Name: effects of allogeneic platelet-rich plasma (prp) on the healing process of sectioned achilles tendons of rats: a methodological description
Uploaded: 2018-03-19T12:30:00
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Questo studio è stato sostenuto da Standard de Liège e Lejeune - Lechien concede dei fondi Frédéricq Leon.

Cura e manipolazione degli animali sono state eseguite in conformità con la guida per la cura e uso di animali da laboratorio a cura dell'Accademia nazionale delle scienze e pubblicato da istituti nazionali di salute (USA). Legislazione europea e nazionale sono stati seguiti attentamente.
1. animale preparazione
<ol><li>Utilizzare 132 2 - mesi-vecchio maschi ratti Sprague-Dawley 320-450 grammi (120 ratti per la sperimentazione) e 12 ratti per il prelievo di sangue, Figu...

<ol>
	<li>Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+rich+plasma+traitement+des+tendinopathies+chroniques?+Revue+de+la+litt&#233;rature.+Platelet+rich+plasma+treatment+of+chronic+tendinopathies?+Review+of+literature.">Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la litt&#233;rature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature.</a> J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).</li><li>Anitua, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+preparations+rich+in+growth+factors+promote+proliferation+and+induce+VEGF+and+HGF+production+by+human+tendon+cells+in+culture.">Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture.</a> J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).</li><li>Bosch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+platelet-rich+plasma+on+the+quality+of+repair+of+mechanically+induced+core+lesions+in+equine+superficial+digital+flexor+tendons:+A+placebo-controlled+experimental+study.">Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study.</a> J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).</li><li>Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tendinopathies+and+platelet-rich+plasma+(PRP):+From+pre-clinical+experiments+to+therapeutic+use.">Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use.</a> J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).</li><li>Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+and+epidemiology+of+tendinopathy.">Types and epidemiology of tendinopathy.</a> Clin. Sports Med. 22, 675-692 (2003).</li><li>Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+growth+factors+in+tendon+and+ligament+healing.">The roles of growth factors in tendon and ligament healing.</a> Sports Med. 33, 381-394 (2003).</li><li>Lyras, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+platelet-rich+plasma+gel+in+the+early+phase+of+patellar+tendon+healing.">The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing.</a> Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).</li><li>Aspenberg, P., Virchenko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+concentrate+injection+improves+Achilles+tendon+repair+in+rats.">Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats.</a> Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).</li><li>Visser, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+Factor-Rich+Plasma+Increases+Tendon+Cell+Proliferation+and+Matrix+Synthesis+on+a+Synthetic+Scaffold:+An+In+Vitro+Study.">Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).</li><li>Zhang, J., Wang, J. H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma+Releasate+Promotes+Differentiation+of+Tendon+Stem+Cells+Into+Active+Tenocytes.">Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes.</a> Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).</li><li>Kajikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-rich+plasma+enhances+the+initial+mobilization+of+circulation-derived+cells+for+tendon+healing.">Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing.</a> J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).</li><li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors-diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics.">Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li><li>Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+size+determination.">Sample size determination.</a> ILAR J. 43, 207-213 (2002).</li><li>M&#228;hler Convenor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+recommendations+for+the+health+monitoring+of+mouse,+rat,+hamster,+guinea+pig+and+rabbit+colonies+in+breeding+and+experimental+units.">FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units.</a> Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).</li><li>Kaux, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#201;tude+comparative+de+cinq+techniques+de+pr&#233;paration+plaquettaire+(platelet-rich+plasma).">&#201;tude comparative de cinq techniques de pr&#233;paration plaquettaire (platelet-rich plasma).</a> Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).</li><li>Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-jaw+designed+for+in+vitro+tensile+testing+of+the+healing+Achilles+tendons+in+rats.">A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats.</a> J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).</li><li>Kaux, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Endothelial+Growth+Factor-111+(VEGF-111)+and+tendon+healing:+preliminary+results+in+a+rat+model+of+tendon+injury.">Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury.</a> Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).</li><li>Docheva, D., Hunziker, E. B., F&#228;ssler, R., Brandau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenomodulin+is+necessary+for+tenocyte+proliferation+and+tendon+maturation.">Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation.</a> Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).</li><li>Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapi&#232;re, C. M., Nusgens, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+pathways+in+the+over-expression+of+matrix+metalloproteinases+in+human+fibroblasts+by+relaxation+of+mechanical+tension.">Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension.</a> Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).</li><li>Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+and+wound+healing.">Platelets and wound healing.</a> Front. Biosci. 13, 3532-3548 (2008).</li><li>Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+effects+of+platelet+rich+plasma:+a+study+on+HL-60+macrophage-like+cells.">Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells.</a> Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).</li><li>Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+use+of+platelet-rich+plasma+in+sports+medicine+as+a+new+treatment+for+tendon+and+ligament+injuries.">A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries.</a> Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).</li><li>Mazzocca, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+positive+effects+of+different+platelet-rich+plasma+methods+on+human+muscle,+bone,+and+tendon+cells.">The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells.</a> Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).</li><li>McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+leukocyte+concentration+in+platelet-rich+plasma+for+the+treatment+of+tendinopathy.">Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).</li><li>Boswell, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+platelet+concentrations+in+leukocyte-reduced+platelet-rich+plasma+decrease+collagen+gene+synthesis+in+tendons.">Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons.</a> Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).</li><li>Virchenko, O., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+one+platelet+injection+after+tendon+injury+lead+to+a+stronger+tendon+after+4+weeks?:+Interplay+between+early+regeneration+and+mechanical+stimulation.">How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation.</a> Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).</li></ol>

Le piastrine sono essenziali per la fase infiammatoria iniziale del tendine del processo di guarigione. Quando queste piastrine sono esposti all'associazione di tessuto o fattori che inducono la coagulazione, rilasciano fattori di crescita che sono immagazzinati nei granuli α. A causa di questa interazione, macromolecole della matrice extracellulare sono sintetizzati e cellule mesenchimali proliferano. Le piastrine hanno anche un'attività chemiotattica su cellule progenitrici nella circolazione sanguigna, migliorando l...

Coagulazione, processi infiammatori e i ruoli di modulazione di immunità delle piastrine sono ben noti1. Più recentemente, è stato dimostrato che hanno anche proprietà lenitive2,3. Infatti, diversi fattori di crescita e citochine (VEGF, PDGF, TGF-B, IGF-I e HGF) vengono rilasciati dalle piastrine durante la degranulazione. Questi fattori di crescita promuovono l'angiogenesi, rimodellamento tissutale e ferita guarigione (ossa, pelle, muscolo, tendine)2. Centrifugazione del sangue autologo produce plasma ricco di piastrine (PRP) che contiene concentrazioni piastrinica elevata a seconda del metodo di isolamento (tra 3 e 10 volte concentrazioni basali del sangue). Infatti, varie tecniche di preparazione del PRP non possono fornire un prodotto finale identico. Fino ad ora, c' non è stato nessun accordo generale internazionale su questo tema. Nel complesso, PRP potrebbe essere un'interessante opzione terapeutica per il trattamento di patologie muscolo-scheletriche croniche, quali tendinopatia, fascite plantare, osteoartrite e non sindacale4. Esso è stato utilizzato per la prima volta in chirurgia orale e implantologia4 per migliorare e accelerare la guarigione dopo aver piazzato un impianto dentale ossea. In questo studio, descriviamo un metodo riproducibile che consente l'acquisizione di PRP per sperimentazione animale4.
Poiché le lesioni dei tendini sono osservate frequentemente in sportivi e fisica dei lavoratori, migliorare il processo di guarigione e riducendo così il tempo per il recupero sono di grande interesse5. Nuovi metodi di trattamento che sviluppano spesso implicano l'uso di fattori di crescita, e l'amministrazione di PRP è un modo semplice e come minimo dilagante per fornire una miscela di fattori di crescita endogeni4.
Parecchi studi in vitro o animale hanno dimostrato che la somministrazione di plasma, che contiene un alto livello di piastrine, attraverso il rilascio di mediatori biologici, può stimolare la riparazione del tendine e del legamento attraverso il rilascio di mediatori biologici6 ,7,8,9. Inoltre, altri studi hanno dimostrato che PRP può stimolare il tipo I e la sintesi del collagene III nel tendine celle9,10,11. È anche stato suggerito che PRP può diminuire l'attivazione di metalloproteinasi (MMPs) e di conseguenza ridurre la degradazione della matrice. Le cellule che sono coinvolte nel processo di infiammazione possono produrre MMP-9, che svolge un ruolo nel rimodellamento tissutale (fisiologiche e patologiche) indotta dall'infiammazione12.
Basato su queste informazioni, abbiamo supposto che una singola iniezione di PRP nei tendini di Achille sezionati dei ratti potrebbe migliorare il processo di recupero e la resistenza meccanica del tessuto riparato. Questo è testato misurando le proprietà biomeccaniche dei tendini guarigione durante il processo di recupero e attraverso un'analisi istologiche e molecolare per valutare collagene rimodellamento nel tessuto formato di recente. Lo scopo dello studio era di osservare se una singola iniezione di PRP allogeniche potrebbe influenzare la guarigione dei tendini di Achilles sezionati.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xyl-M)</td>
			<td>VMD</td>
			<td>none</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin (J&#233;tamine 1000 CEVA)</td>
			<td>CEVA Sant&#233; Animale</td>
			<td>none</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphin (Veterg&#233;sic Multidosis)</td>
			<td>ALSTOE</td>
			<td>none</td>
			<td>Painkiller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iso-Betadine</td>
			<td>MEDA-Pharma</td>
			<td>none</td>
			<td>Desinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resorbable yarn Vicryl 6/0</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nembutal</td>
			<td>CEVA Sant&#233; Animale</td>
			<td>none</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Preserves structure of the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,922,364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,823,362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28973.363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LEIC3950.1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.15938.0025</td>
			<td>Colorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.15935.0100</td>
			<td>Colorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3989</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effects of allogeneic platelet-rich plasma (prp) on the healing process of sectioned achilles tendons of rats: a methodological description

Questo articolo descrive le procedure sperimentali utilizzate per osservare se PRP può influenzare positivamente la guarigione del tendine. Ci sono 4 principali passi da seguire: indurre una lesione nel tendine di Achille; PRP di preparare ed iniettare (o soluzione salina); rimuovere il tendine; ed eseguire valutazioni biomeccaniche, molecolari ed istologiche. Ad ogni passo, tutte le procedure e i metodi sono descritti in dettaglio, quindi possono essere riprodotti facilmente.
Tendini di Achilles sono stati chirurgicamente sezionata (rimozione di una sezione di lunghezza di 5 mm). In seguito, PRP o soluzione salina è stata iniettata per studiare se PRP ha un effetto positivo sulla guarigione del tendine. Tre gruppi di 40 animali (un totale di 120 ratti sono stati utilizzati in questo studio) sono stati suddivisi in 2 sottogruppi: gruppo di controllo di gruppo di iniezione di PRP e un'iniezione salina. Ratti sono stati sacrificati ad aumentare i punti temporali (gruppo a: 5 giorni; Gruppo b: 15 giorni; Gruppo c: 30 giorni) e tendini sono stati rimossi. 90 tendini hanno subito la prova biomeccanica prima di eseguire analisi trascrittomica e 30 restanti tendini sono stati sottoposti ad analisi istologica.

I risultati sono espressi come media ± deviazione standard di media e sono stati confrontati con analisi della varianza (ANOVA). Un ANOVA a due vie e post hoc test de Scheffe, che è un test parametrico, sono stati utilizzati.
La resistenza ultima a trazione (UTS) necessaria per provocare una rottura dei tendini d'Achille non-ferito di ratti era 42.0 ± 5,7 N (n = 10). La resistenza alla trazione è aumentato significa...

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Effects of Allogeneic Platelet-Rich Plasma PRP on the Healing Process of Sectioned Achilles Tendons of Rats: A Methodological Description

Questo protocollo descrive il processo di valutazione della guarigione tendini in ratti che sono stati iniettati con plasma ricco di piastrine allogeniche (PRP) o soluzione salina dopo la rimozione di parte del tendine di Achille. L'andamento del tendine che guarisce è valutato a diversi intervalli di tempo utilizzando diversi tipi di analisi.

Gli effetti del trapianto Allogeneic Plasma ricco di piastrine (PRP) sul processo di guarigione dei tendini di Achilles sezionato dei ratti: una descrizione metodologica

This article describes the experimental procedures used to observe if PRP can positively affect tendon healing. There are 4 main steps to follow: induce a ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Effects of Allogeneic Platelet-Rich Plasma (PRP) on the Healing Process of Sectioned Achilles Tendons of Rats: A Methodological Description

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