Name: effects of allogeneic platelet-rich plasma (prp) on the healing process of sectioned achilles tendons of rats: a methodological description
Uploaded: 2018-03-19T12:30:00
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Este estudo foi suportado pelo Standard de Liège e Lejeune - Lechien concede dos fundos Leon Frédéricq.

Cuidados e tratamento dos animais foram realizados em conformidade com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório preparado pela Academia Nacional de Ciências e publicado pelos institutos nacionais de saúde (EUA). Legislação europeia e nacional foram seguidas com cuidado.
1. preparação animal
<ol><li>Use 132 ratos Sprague-Dawley machos 2 - meses de idade pesando 320-450 g (120 ratos para experimentação) e 12 ratos para amostragem de sangue, Figura 1</...

<ol>
	<li>Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+rich+plasma+traitement+des+tendinopathies+chroniques?+Revue+de+la+litt&#233;rature.+Platelet+rich+plasma+treatment+of+chronic+tendinopathies?+Review+of+literature.">Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la litt&#233;rature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature.</a> J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).</li><li>Anitua, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+preparations+rich+in+growth+factors+promote+proliferation+and+induce+VEGF+and+HGF+production+by+human+tendon+cells+in+culture.">Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture.</a> J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).</li><li>Bosch, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+platelet-rich+plasma+on+the+quality+of+repair+of+mechanically+induced+core+lesions+in+equine+superficial+digital+flexor+tendons:+A+placebo-controlled+experimental+study.">Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study.</a> J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).</li><li>Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tendinopathies+and+platelet-rich+plasma+(PRP):+From+pre-clinical+experiments+to+therapeutic+use.">Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use.</a> J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).</li><li>Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Types+and+epidemiology+of+tendinopathy.">Types and epidemiology of tendinopathy.</a> Clin. Sports Med. 22, 675-692 (2003).</li><li>Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+growth+factors+in+tendon+and+ligament+healing.">The roles of growth factors in tendon and ligament healing.</a> Sports Med. 33, 381-394 (2003).</li><li>Lyras, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+platelet-rich+plasma+gel+in+the+early+phase+of+patellar+tendon+healing.">The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing.</a> Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).</li><li>Aspenberg, P., Virchenko, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+concentrate+injection+improves+Achilles+tendon+repair+in+rats.">Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats.</a> Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).</li><li>Visser, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+Factor-Rich+Plasma+Increases+Tendon+Cell+Proliferation+and+Matrix+Synthesis+on+a+Synthetic+Scaffold:+An+In+Vitro+Study.">Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).</li><li>Zhang, J., Wang, J. H. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-Rich+Plasma+Releasate+Promotes+Differentiation+of+Tendon+Stem+Cells+Into+Active+Tenocytes.">Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes.</a> Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).</li><li>Kajikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-rich+plasma+enhances+the+initial+mobilization+of+circulation-derived+cells+for+tendon+healing.">Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing.</a> J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).</li><li>Pasternak, B., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metalloproteinases+and+their+inhibitors-diagnostic+and+therapeutic+opportunities+in+orthopedics.">Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics.</a> Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).</li><li>Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+size+determination.">Sample size determination.</a> ILAR J. 43, 207-213 (2002).</li><li>M&#228;hler Convenor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FELASA+recommendations+for+the+health+monitoring+of+mouse,+rat,+hamster,+guinea+pig+and+rabbit+colonies+in+breeding+and+experimental+units.">FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units.</a> Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).</li><li>Kaux, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#201;tude+comparative+de+cinq+techniques+de+pr&#233;paration+plaquettaire+(platelet-rich+plasma).">&#201;tude comparative de cinq techniques de pr&#233;paration plaquettaire (platelet-rich plasma).</a> Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).</li><li>Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cryo-jaw+designed+for+in+vitro+tensile+testing+of+the+healing+Achilles+tendons+in+rats.">A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats.</a> J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).</li><li>Kaux, J. -. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+Endothelial+Growth+Factor-111+(VEGF-111)+and+tendon+healing:+preliminary+results+in+a+rat+model+of+tendon+injury.">Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury.</a> Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).</li><li>Docheva, D., Hunziker, E. B., F&#228;ssler, R., Brandau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenomodulin+is+necessary+for+tenocyte+proliferation+and+tendon+maturation.">Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation.</a> Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).</li><li>Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapi&#232;re, C. M., Nusgens, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+pathways+in+the+over-expression+of+matrix+metalloproteinases+in+human+fibroblasts+by+relaxation+of+mechanical+tension.">Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension.</a> Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).</li><li>Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelets+and+wound+healing.">Platelets and wound healing.</a> Front. Biosci. 13, 3532-3548 (2008).</li><li>Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+effects+of+platelet+rich+plasma:+a+study+on+HL-60+macrophage-like+cells.">Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells.</a> Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).</li><li>Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+the+use+of+platelet-rich+plasma+in+sports+medicine+as+a+new+treatment+for+tendon+and+ligament+injuries.">A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries.</a> Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).</li><li>Mazzocca, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+positive+effects+of+different+platelet-rich+plasma+methods+on+human+muscle,+bone,+and+tendon+cells.">The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells.</a> Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).</li><li>McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+leukocyte+concentration+in+platelet-rich+plasma+for+the+treatment+of+tendinopathy.">Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy.</a> J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143 (2012).</li><li>Boswell, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increasing+platelet+concentrations+in+leukocyte-reduced+platelet-rich+plasma+decrease+collagen+gene+synthesis+in+tendons.">Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons.</a> Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).</li><li>Virchenko, O., Aspenberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+can+one+platelet+injection+after+tendon+injury+lead+to+a+stronger+tendon+after+4+weeks?:+Interplay+between+early+regeneration+and+mechanical+stimulation.">How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation.</a> Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).</li></ol>

As plaquetas são essenciais para a fase inflamatória inicial do tendão processo de cura. Quando estas plaquetas estão expostas a um tecido ou fatores que induzem a coagulação, liberam fatores de crescimento que são estocados em grânulos α. Devido a essa interação, macromoléculas da matriz extracelular são synthetized e células mesenquimais proliferam. As plaquetas também têm uma atividade quimiotáctica em células progenitoras a circulação de sangue, aumentando a angiogênese e estimulando a diferencia...

Coagulação, processos inflamatórios e as funções de modulação da imunidade de plaquetas são conhecidos1. Mais recentemente, foi demonstrado que eles também têm propriedades restauradoras2,3. Na verdade, vários fatores citocinas e crescimento (VEGF, PDGF, TGF-B e IGF-I e HGF) são liberados pelas plaquetas durante a degranulação. Estes fatores de crescimento promovem a angiogênese, remodela o tecido e ferida de cura (ossos, pele, músculo, tendão)2. Centrifugação de sangue autólogo produz plasma rico plaquetas (PRP) que contém concentrações de plaquetas alta dependendo do método de isolamento (entre 3 e 10 vezes sangue concentrações de linha de base). De fato, várias técnicas de preparação do PRP não podem fornecer um produto final idêntico. Até agora, não houve nenhum acordo geral internacional sobre esta questão. No geral, o PRP pode ser uma atraente opção terapêutica no tratamento de condições crônicas músculo-esqueléticas, tais como tendinopatia, fascite plantar, osteoartrite e pseudartrose4. Foi usado pela primeira vez em cirurgia oral e Implantologia4 para melhorar e acelerar a consolidação depois de colocar um implante dentário. Neste estudo, descrevemos um método reprodutível que permite a aquisição de PRP para experimentação animal4.
Desde lesões dos tendões são frequentemente observadas em esportistas e trabalhadores físicos, reforçar o processo de cura e reduzindo o tempo de recuperação são de grande interesse5. Novos métodos de tratamento que estão desenvolvendo frequentemente envolvem o uso de fatores de crescimento, e a administração do PRP é uma maneira simples e minimamente invasiva para entregar uma mistura de fatores de crescimento endógeno4.
Vários estudos em vitro ou em animais demonstraram que a administração de plasma que contém um alto nível de plaquetas, liberando mediadores biológicos, pode estimular a reparação do tendão e ligamento pela liberação de mediadores biológicos6 ,7,8,9. Além disso, outros estudos têm mostrado que o PRP pode estimular tipo eu e a síntese de colágeno III no tendão células de10,9,11. Também tem sido sugerido que o PRP pode diminuir a ativação de metaloproteinases de matriz (MMPs) e, portanto, reduzir a degradação da matriz. As células que estão envolvidas no processo de inflamação podem produzir MMP-9, que desempenha um papel no tecido remodelação (fisiológica e patológica) induzida por inflamação12.
Com base nesta informação, formulamos a hipótese que uma única injeção de PRP para os tendões de Aquiles seccionados de ratos poderia melhorar o processo de recuperação e a resistência mecânica do tecido reparado. Isso é testado medindo as propriedades biomecânicas dos tendões curativas durante o processo de recuperação e realizando análises histológicas e moleculares para avaliar colágeno remodelando o tecido recém-formado. O objetivo do estudo foi observar se uma única injeção de células alogénica PRP poderia influenciar a cicatrização dos tendões de Aquiles seccionados.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Xylazine (Xyl-M)</td>
			<td>VMD</td>
			<td>none</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamin (J&#233;tamine 1000 CEVA)</td>
			<td>CEVA Sant&#233; Animale</td>
			<td>none</td>
			<td>anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphin (Veterg&#233;sic Multidosis)</td>
			<td>ALSTOE</td>
			<td>none</td>
			<td>Painkiller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iso-Betadine</td>
			<td>MEDA-Pharma</td>
			<td>none</td>
			<td>Desinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>resorbable yarn Vicryl 6/0</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nembutal</td>
			<td>CEVA Sant&#233; Animale</td>
			<td>none</td>
			<td>Anesthetic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Preserves structure of the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 100%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,922,364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 95%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,823,362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28973.363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>LEIC3950.1006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.15938.0025</td>
			<td>Colorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.15935.0100</td>
			<td>Colorant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eukitt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3989</td>
			<td>Mounting Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

effects of allogeneic platelet-rich plasma (prp) on the healing process of sectioned achilles tendons of rats: a methodological description

Este artigo descreve os procedimentos experimentais usados para observar se PRP pode afetar positivamente o tendão cicatrização. Há 4 etapas principais a seguir: induzir uma lesão no tendão de Aquiles; preparar o PRP e injetá-lo (ou a solução salina); remover o tendão; e realizar avaliações biomecânicas, moleculares e histológicas. Em cada etapa, todos os procedimentos e métodos são descritos em detalhe, para que possam ser reproduzidos facilmente.
Tendões de Aquiles tem sido seccionada cirurgicamente (remoção de uma seção longa de 5 mm). Depois, PRP ou solução salina foi injetada para estudar se o PRP tem um efeito positivo sobre a cicatrização do tendão. Três grupos de 40 animais (um total de 120 ratos foram utilizados neste estudo) foram subdivididos em 2 subgrupos: grupo de controle grupo de injeção de PRP e uma injeção de solução salina. Ratos foram sacrificados em aumentar os pontos de tempo (grupo r: 5 dias; Grupo b: 15 dias; Grupo c: 30 dias) e tendões foram removidos. 90 tendões foram submetidos a testes biomecânicos antes de executar a análise de transcriptomic e os 30 restantes tendões foram submetidos à análise histológica.

Os resultados são expressos como o média ± desvio-padrão da média e foram comparados com a análise de variância (ANOVA). Uma ANOVA bidirecional e post hoc testam de Scheffé, que é um teste paramétrico, foram usados.
A resistência à tração (UTS) necessária para provocar uma ruptura dos tendões de Aquiles não-feridas de ratos foi 42.0 ± 5,7 N (n = 10). A resistência à tração aumentou significativamen...

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Effects of Allogeneic Platelet-Rich Plasma PRP on the Healing Process of Sectioned Achilles Tendons of Rats: A Methodological Description

Este protocolo descreve o processo de avaliação de cura os tendões em ratos que foram injetados com plasma rico de alogênico plaquetas (PRP) ou solução salina após a remoção de parte do tendão de Aquiles. O progresso da cicatrização do tendão é avaliado em vários pontos de tempo usando diferentes tipos de análises.

Efeitos de alogênico Plasma rico em plaquetas (PRP) sobre o processo de cicatrização dos tendões de Aquiles seccionados de ratos: uma descrição metodológica

This article describes the experimental procedures used to observe if PRP can positively affect tendon healing. There are 4 main steps to follow: induce a ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Effects of Allogeneic Platelet-Rich Plasma (PRP) on the Healing Process of Sectioned Achilles Tendons of Rats: A Methodological Description

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