Name: optimized protocol for the extraction of proteins from the human mitral valve
Uploaded: 2017-06-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve at JoVE.com

Il Ministero della Salute italiano ha sostenuto questo studio (RC 2013-BIO 15). Ringraziamo Barbara Micheli per la sua eccellente assistenza tecnica.

In questo protocollo, i cuori umani vengono raccolti durante l&#39;esplorazione multiorgano (tempi di ischemia fredda di 4-12 h, media 6 ± 2 h) dai donatori multi-organi esclusi dal trapianto di organi per motivi tecnici o funzionali, nonostante i normali parametri ecocardiografici. Sono inviati alla Banca Tissue Cardiovascolare di Milano, Centro Cardiologico Monzino (Milano, Italia) per l&#39;attività bancaria delle valvole aortiche e polmonari. I volantini posteriori mitraali non vengono utilizzati per scopi clinici...

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	<li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+signatures+of+protein+and+mRNA+expression+levels.">Global signatures of protein and mRNA expression levels.</a> Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).</li><li>Hanash, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disease+proteomics.">Disease proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).</li><li>Ahram, M., Petricoin, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+Discovery+of+Disease+Biomarkers.">Proteomics Discovery of Disease Biomarkers.</a> Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).</li><li>Chandramouli, K., Qian, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics:+challenges,+techniques+and+possibilities+to+overcome+biological+sample+complexity.">Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity.</a> Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).</li><li>Singleton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+bioanalytical+sample+preparation+for+LC-MS+analysis.">Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis.</a> Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).</li><li>Williams, T. H., Jew, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Is+the+mitral+valve+passive+flap+theory+overstated?+An+active+valve+is+hypothesized.">Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized.</a> Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).</li><li>Rabkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+interstitial+myofibroblasts+express+catabolic+enzymes+and+mediate+matrix+remodeling+in+myxomatous+heart+valves.">Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves.</a> Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).</li><li>Martins Cde, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mitral+valve+proteomic+profiles+in+rheumatic+heart+disease+and+myxomatous+degeneration.">Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration.</a> Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).</li><li>Tan, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+proteome+of+degenerative+human+mitral+valves.">Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves.</a> Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).</li><li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+of+platelets+in+patients+with+coronary+artery+disease.">Proteome of platelets in patients with coronary artery disease.</a> Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).</li><li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+human+low-density+lipoprotein+reveals+the+presence+of+prenylcysteine+lyase,+a+hydrogen+peroxide-generating+enzyme.">Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme.</a> Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li><li>Banfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Very+low+density+lipoprotein-mediated+signal+transduction+and+plasminogen+activator+inhibitor+type+1+in+cultured+HepG2+cells.">Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells.</a> Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).</li><li>Brioschi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+human+mitral+valve+proteome:+A+preliminary+investigation+by+gel-based+and+gel-free+proteomic+approaches.">Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches.</a> Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).</li><li>Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+endothelial+cell+secretome:+a+means+of+studying+the+pleiotropic+effects+of+Hmg-CoA+reductase+inhibitors.">Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors.</a> J Proteomics. 78, 346-361 (2013).</li><li>Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+protein+carbamylation+in+urea+solution+using+ammonium-containing+buffers.">Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers.</a> Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).</li><li>Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+the+solubilization+of+proteins+in+two-dimensional+electrophoresis+with+immobilized+pH+gradients.">Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients.</a> Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).</li><li>Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins+and+proteomics:+un+amour+impossible?.">Membrane proteins and proteomics: un amour impossible?.</a> Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).</li><li>Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+analysis+of+histones.">Extraction, purification and analysis of histones.</a> Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).</li><li>Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+membranes+by+means+of+sodium+carbonate+treatment:+application+to+endoplasmic+reticulum.">Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum.</a> J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).</li><li>Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+two-dimensional+electrophoresis+technology+for+proteomics.">Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics.</a> Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).</li><li>Mann, M., Kelleher, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+proteomics:+the+case+for+high+resolution+and+high+mass+accuracy.">Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).</li><li>Thakur, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+highly+sensitive+proteome+coverage+by+LC-MS/MS+without+prefractionation.">Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).</li><li>Loardi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+mitral+valve+prolapse:+the+harvest+is+big,+but+the+workers+are+few.">Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few.</a> Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).</li><li>Schoen, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+concepts+of+cardiac+valve+dynamics:+the+continuum+of+development,+functional+structure,+pathobiology,+and+tissue+engineering.">Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering.</a> Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).</li><li>Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+anatomic+and+physiologic+overview+of+the+porcine+heart.">A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).</li></ol>

Un passo critico di questo protocollo è l&#39;uso di azoto liquido per congelare il campione e per raffreddare il sistema di macinazione. L&#39;utilizzo di azoto liquido evita il degrado biologico e consente una polverizzazione efficace, ma richiede una formazione specifica per una manipolazione sicura. In questo protocollo è previsto un sistema di macinazione per la macinazione del campione in quanto i piccoli campioni sono difficili da recuperare da mortai e pestelli standard. In questo ...

Recenti testimonianze hanno alterato la comprensione dei ruoli dei molti meccanismi regolatori che si verificano dopo la sintesi di mRNA. Infatti, i processi traslazionali, post-trascrizionali e proteolitici possono regolare l&#39;abbondanza e la funzione proteica. Il dogma, che afferma che le concentrazioni di mRNA sono proxy a quelle delle proteine ​​corrispondenti, assumendo che i livelli di trascritture sono il determinante principale dell&#39;abbondanza di proteine, è stata parzialmente riveduta. In effetti, i livelli di trascrizione solo parzialmente prevedono l&#39;abbondanza di proteine, suggerendo che gli eventi post-trascrizionali Si verificano per regolare le proteine ​​all&#39;interno delle cellule 1 , 2 . Inoltre, le proteine ​​infine dettano la funzione della cellula e quindi dettano il suo fenotipo, che può subire variazioni dinamiche in risposta ai fattori autocrini, paracrini e endocrini; Mediatori di sangue; temperatura; Trattamento farmacologico; E la malattia si sviluppament. Pertanto, un&#39;analisi di espressione incentrata sul livello della proteina è utile per caratterizzare il proteome e per svelare i cambiamenti critici che si verificano come parte della patogenesi della malattia 3 . Pertanto, le opportunità che la proteomica presenta per chiarire le condizioni della salute e delle malattie sono formidabili, nonostante le sfide tecnologiche esistenti. Le aree particolarmente promettenti di ricerca a cui la proteomica può contribuire comprendono: l&#39;individuazione dell&#39;espressione alterata di proteine ​​a qualsiasi livello ( cioè cellule intere o tessuti, compartimenti subcellulari e fluidi biologici); L&#39;identificazione, la verifica e la convalida di nuovi biomarcatori utili per la diagnosi e la prognosi della malattia; E, auspicabilmente, l&#39;individuazione di nuovi bersagli proteici che possono essere utilizzati per scopi terapeutici, nonché per la valutazione dell&#39;efficacia e della tossicità farmacologica 4 . Catturare la complessità diIl proteome rappresenta una sfida tecnologica. Gli attuali strumenti proteomici offrono l&#39;opportunità di eseguire analisi su larga scala e ad alto rendimento per l&#39;identificazione, la quantificazione e la convalida dei livelli alterati di proteine. Inoltre, l&#39;introduzione di tecniche di frazionamento e arricchimento, mirante ad evitare le interferenze causate dalle proteine ​​più abbondanti, ha anche migliorato l&#39;identificazione delle proteine ​​includendo le proteine ​​meno abbondanti. Infine, la proteomica è stata completata dall&#39;analisi delle modificazioni post-traduzionali, che emergono progressivamente come importanti modulatori della funzione proteica. Tuttavia, la preparazione del campione e il recupero delle proteine ​​nei campioni biologici in analisi rimangono ancora i passi limitanti nel flusso di lavoro proteomico e aumentano il potenziale di eventuali insidie 5 . Infatti, nella maggior parte delle tecniche di biologia molecolare che devono essere ottimizzate, i primi passi sono l&#39;omogeneizzazione dei tessutiIoni e cellule, soprattutto durante l&#39;analisi di proteine ​​a bassa abbondanza per le quali non esistono metodi di amplificazione. Inoltre, la natura chimica delle proteine ​​può influenzare il proprio recupero. Ad esempio, l&#39;analisi delle proteine ​​altamente idrofobiche è molto impegnativa, perché facilmente precipitano durante la messa a fuoco isoelettrica, mentre le proteine ​​di trans-membrana sono quasi insolubili (esaminate nel Reference 5). Inoltre, la variabilità della composizione tissutale crea una barriera significativa allo sviluppo di un metodo di estrazione universale. Infine, poiché quasi tutti gli esemplari clinici sono di quantità limitata, è essenziale consentire la preparazione di proteine ​​con il massimo recupero e riproducibilità da quantità minime di campioni 6 . Questo lavoro descrive un protocollo ottimizzato per l&#39;estrazione proteica dalla valvola mitrale normale cardiaca umana, che rappresenta un campione molto impegnativo per l&#39;analisi proteomica. La normale valvola mitrale è un compLex che si trova tra l&#39;atrio sinistro e il ventricolo sinistro del cuore ( Figura 1 ). Esso svolge un ruolo importante nel controllo del flusso di sangue dall&#39;atrio al ventricolo, impedendo il flusso di riflusso e assicurando il corretto livello di alimentazione dell&#39;ossigeno per tutto il corpo, mantenendo così un&#39;adeguata uscita cardiaca. Tuttavia, è spesso considerato un tessuto &quot;inattivo&quot;, con una bassa cellularità e pochi componenti, principalmente nella matrice extracellulare. Ciò è dovuto al fatto che, in condizioni normali, le cellule interstiziali valvolari residenti (VIC) presentano un fenotipo di riposo con una bassa percentuale di biosintesi proteica 7 . Tuttavia, è stato dimostrato che, in uno stato patologico, il numero di VICs nella spongiosa aumenta e la loro sintesi proteica è attivata, insieme ad altri cambiamenti funzionali e fenotipici 8 . Pertanto, non sorprende che i dati minimi disponibili inLa letteratura si concentra sull&#39;analisi delle valvole mitraliche patologiche 9 , 10 , in cui l&#39;aumento del numero di VIC attivato potrebbe spiegare il numero relativamente elevato di proteine ​​identificate. In conclusione, il presente protocollo può servire a sviluppare la comprensione dei meccanismi patogeni responsabili delle malattie delle valvole mitraliche attraverso lo studio di componenti proteici della valvola mitrale. Infatti, una maggiore comprensione dei processi patologici sottostanti potrebbe contribuire a migliorare la gestione clinica delle malattie delle valvole, le cui attuali indicazioni per l&#39;intervento sono in gran parte predicate sulle considerazioni emodinamiche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.9 % NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eurocollins A</td>
			<td>SALF</td>
			<td>30874046</td>
			<td>Balanced organ&#39;s transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eurocollins B</td>
			<td>SALF</td>
			<td>30874022</td>
			<td>Balanced organ&#39;s transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wisconsin</td>
			<td>Bridge life</td>
			<td>RM/N 4081</td>
			<td>Balanced organ&#39;s transport medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biohazard vertical flow air</td>
			<td>Burdinola</td>
			<td></td>
			<td>Class A GMP classification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dewar Flask</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Nalgene 4150-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogrinder system</td>
			<td>OPS diagnostics</td>
			<td>CG 08-01</td>
			<td>Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile scalpel</td>
			<td>Medisafe</td>
			<td>MS-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel picks</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Autoclavable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable sterile drap</td>
			<td>Mon&#38;Tex</td>
			<td>3.307.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizing solution with isopropyl alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>70% isopropyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizing solution with hydrogen peroxide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6% hydrogen peroxide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette, 1 mL, with tips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>9278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7 mL centrifuge tubes</td>
			<td>VWR international</td>
			<td>PIER90410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>U6504-1KG</td>
			<td>To be used for Urea buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td>To be used for Urea buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C3023-5GR</td>
			<td>To be used for Urea buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>D0632-5G</td>
			<td>To be used for Urea buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 50 mL</td>
			<td>PIC</td>
			<td></td>
			<td>To be used to filter Urea buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGP033RB</td>
			<td>To be used to filter Urea buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFTE Pestle, 2 mL</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>6302</td>
			<td>Part of Potter-Elvehjem homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass mortar</td>
			<td>Kartell</td>
			<td>6102</td>
			<td>Part of Potter-Elvehjem homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stirrer</td>
			<td>VELP scientifica</td>
			<td>Stirrer DLH</td>
			<td>To be used for homogenization by Potter-Elvehjem</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Protein assay</td>
			<td>Bio-Rad laboratories</td>
			<td>5000006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube rotator</td>
			<td>Pbi International</td>
			<td>F205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum foil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene box</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80&#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision balance</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic gloves for liquid nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Professional forced ventilation and natural air convection oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P8340-5ML</td>
			<td>100X solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteoExtract Protein Precipitation Kit</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>539180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiGest</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186001861</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytoscape</td>
			<td>www.cytoscape.org</td>
			<td>version 2.7</td>
			<td>Software platform for Gene Ontology analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BiNGO</td>
			<td>http://apps.cytoscape.org/apps/bingo</td>
			<td>version 3.0.3</td>
			<td>Plugin for Gene ontology analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-97494</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody against CryAB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Septin-11 Antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-83824</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody against septin-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHL1 Antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP-188745</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody against FHL-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dermatopontin Antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NB110-68135</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti mouse IgG HRP</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>A4416-0.5ML</td>
			<td>Secondary antibody for immunoblotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti rabbit IgG HRP</td>
			<td>Bio-Rad laboratories</td>
			<td>170-5046</td>
			<td>Secondary antibody for immunoblotting</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized protocol for the extraction of proteins from the human mitral valve

L&#39;analisi del proteome cellulare può aiutare a chiarire i meccanismi molecolari che sottostanno le malattie dovute allo sviluppo di tecnologie che permettono l&#39;identificazione e la quantificazione su larga scala delle proteine ​​presenti nei complessi sistemi biologici. Le conoscenze acquisite da un approccio proteomico possono portare a un Una migliore comprensione dei meccanismi patogeni che affrontano le malattie, consentendo l&#39;individuazione di nuovi marcatori di malattia diagnostici e prognostici e, speriamo, di obiettivi terapeutici. Tuttavia, la valvola cardiaca mitrale rappresenta un campione molto impegnativo per l&#39;analisi proteomica a causa della bassa mobilità in proteoglicano e matrice extracellulare ricca di collagene. Questo rende impegnativo estrarre le proteine ​​per un&#39;analisi proteomica globale. Questo lavoro descrive un protocollo compatibile con l&#39;analisi proteica successiva, come proteomica quantitativa e immunoblotting. Ciò può consentire la correlazione dei dati riguardantiG con dati sull&#39;espressione mRNA quantitativa e analisi immunoistochimica non-quantitativa. Infatti, questi approcci, se eseguiti insieme, porteranno ad una comprensione più completa dei meccanismi molecolari che stanno alla base di malattie, da mRNA a modifica della proteina post-traduzionale. Quindi, questo metodo può essere rilevante per i ricercatori interessati allo studio della fisiopatologia della valvola cardiaca.

L&#39;estrazione e la dissoluzione delle proteine ​​nel buffer urea è direttamente compatibile con i metodi proteomici basati su isoelectrofocusing (elettroforesi bidimensionale (2-DE) 11 e fuoco isoelettrico a fase liquida (IEF) 12 ) e con immunoblotting dopo la diluizione in tampone Laemmli 13 Contenente un cocktail inibitore della proteasi 14 . <p class="jove_content" fo:keep-toget...

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Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

La composizione proteica della valvola mitrale umana è ancora parzialmente sconosciuta, perché la sua analisi è complicata da basse cellularità e quindi da bassa biosintesi proteica. Questo lavoro fornisce un protocollo per estrarre efficacemente proteine ​​per l&#39;analisi della proteoma della valvola mitrale.

Protocollo ottimizzato per l&#39;estrazione delle proteine ​​dalla valvola mitrale umana

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An Optimized Protocol for Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Infrared Fluorescent Dye-labeled Oligonucleotides

Un protocollo ottimizzato per elettroforetica Mobility Shift Assay Utilizzando oligonucleotidi infrarosso colorante fluorescente etichettati

Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) are an instrumental tool to characterize the interactions between proteins and their target DNA sequences. ...

Ricerca

Biochimica

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purification of Biotinylated Cell Surface Proteins from Rhipicephalus microplus Epithelial Gut Cells

Purificazione delle proteine ​​superficiali delle cellule biotinilate da<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Cellule epiteliali delle ghiandole

Rhipicephalus microplus &#8211; the cattle tick &#8211; is the most significant ectoparasite in terms of economic impact on livestock as a vector of ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Un semplice metodo di estrazione frazionata per l&#39;analisi completa dei metaboliti, dei lipidi e delle proteine ​​da un singolo campione

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Campionamento e pretrattamento dello smalto dei denti carbonato per carbonio stabile e analisi di isotopi di ossigeno

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

Caratterizzazione delle proteine mediante cromatografia di dimensioni-esclusione accoppiata alla dispersione luminosa multi-angolo (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Sezionamento trasversale di riso maturo (Oryza sativa L.) Kernel per la scansione di immagini al microscopio elettronico utilizzando le punte delle pipette come supporto per l'immobilizzazione

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Incorporazione ottimizzata di analoghi degli acidi grassi alchinici per il rilevamento di proteine acilate grasse utilizzando la chimica dei clic

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Potenziamento del rilassamento paramagnetico per rilevare e caratterizzare le auto-associazioni di proteine intrinsecamente disordinate

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Ultrasonic-Assisted Extraction of Cannabidiolic Acid from Cannabis Biomass

Estrazione assistita da ultrasuoni di acido cannabidiolico dalla biomassa di cannabis

Industrial hemp (Cannabis spp.) has many compounds of interest with potential medical benefits. Of these compounds, cannabinoids have come to the center ...

Protocollo ottimizzato per l'estrazione delle proteine ​​dalla valvola mitrale umana

Protocollo ottimizzato per l'estrazione delle proteine dalla valvola mitrale umana