Name: generation of genetically modified mice through the microinjection of oocytes
Uploaded: 2017-06-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes at JoVE.com

ويشكر المؤلفون موظفي مرفق الحيوانات (برك) على دعمهم المستمر. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية ومجلس البحوث الأسترالي.

وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل جامعة نيو ساوث ويلز رعاية الحيوانات والأخلاقيات اللجنة. 1. إعداد التحوير (التكامل العشوائي) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليلي أغاروس هلام الكهربائي. <ol style...

<ol>
	<li>Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+function+of+tau+mediates+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer's+disease+mouse+models.">Dendritic function of tau mediates amyloid-beta toxicity in Alzheimer's disease mouse models.</a> Cell. 142 (3), 387-397 (2010).</li><li>Ittner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+phosphorylation+of+tau+inhibits+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer's+mice.">Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice.</a> Science. 354 (6314), 904-908 (2016).</li><li>Marantz Henig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Monk in the Garden. , (2000).</li><li>Jaenisch, R., Mintz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simian+virus+40+DNA+sequences+in+DNA+of+healthy+adult+mice+derived+from+preimplantation+blastocysts+injected+with+viral+DNA.">Simian virus 40 DNA sequences in DNA of healthy adult mice derived from preimplantation blastocysts injected with viral DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 71 (4), 1250-1254 (1974).</li><li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei.">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA.">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs.">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li><li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+targeting+in+mice:+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century.">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li><li>Carbery, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186 (2), 451-459 (2010).</li><li>Sung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting.">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).</li><li>Jinek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Kang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introducing+precise+genetic+modifications+into+human+3PN+embryos+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+editing.">Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing.</a> J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).</li><li>Liang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+gene+editing+in+human+tripronuclear+zygotes.">CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.</a> Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).</li><li>Ittner, L. M., G&#246;tz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pronuclear+injection+for+the+production+of+transgenic+mice.">Pronuclear injection for the production of transgenic mice.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).</li><li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li><li>. Resuspension Calculator Available from: <a target="_blank" href="https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/">https://sg.idtdna.com/calc/resuspension/</a> (2017)</li><li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain-dependent+differences+in+the+efficiency+of+transgenic+mouse+production.">Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production.</a> Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).</li><li>Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+aging+on+superovulation+efficiency,+aneuploidy+rates,+and+sister+chromatid+cohesion+in+mice+aged+up+to+15+months.">Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months.</a> Biol Reprod. 86 (2), 49 (2012).</li><li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-superovulation+for+the+CRISPR-Cas9-mediated+production+of+gene-knockout,+single-amino-acid-substituted,+and+floxed+mice.">Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice.</a> Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).</li><li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images.">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS One. 7 (4), e35538 (2012).</li><li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+the+oestrous+cycle+of+the+mouse+by+external+stimuli+associated+with+the+male.">Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male.</a> J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).</li><li>Ye, S., Dhillon, S., Ke, X., Collins, A. R., Day, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+procedure+for+genotyping+single+nucleotide+polymorphisms.">An efficient procedure for genotyping single nucleotide polymorphisms.</a> Nucleic Acids Res. 29 (17), E88 (2001).</li><li>Yoshimi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ssODN-mediated+knock-in+with+CRISPR-Cas+for+large+genomic+regions+in+zygotes.">ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes.</a> Nat Commun. 7, 10431 (2016).</li><li>Suzuki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+genome+editing+via+CRISPR/Cas9+mediated+homology-independent+targeted+integration.">In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration.</a> Nature. , (2016).</li><li>Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalized+lacZ+expression+with+the+ROSA26+Cre+reporter+strain.">Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain.</a> Nat Genet. 21, 70-71 (1999).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+targeted+mutation+at+the+known+collagenase+cleavage+site+in+mouse+type+I+collagen+impairs+tissue+remodeling.">A targeted mutation at the known collagenase cleavage site in mouse type I collagen impairs tissue remodeling.</a> J Cell Biol. 130 (1), 227-237 (1995).</li><li>Ke, Y. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+suppression+of+A315T+mutant+human+TDP-43+expression+improves+functional+deficits+in+a+novel+inducible+transgenic+mouse+model+of+FTLD-TDP+and+ALS.">Short-term suppression of A315T mutant human TDP-43 expression improves functional deficits in a novel inducible transgenic mouse model of FTLD-TDP and ALS.</a> Acta Neuropathol. 130 (5), 661-678 (2015).</li><li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+functional+transgenic+mice+by+DNA+pronuclear+microinjection.">Production of functional transgenic mice by DNA pronuclear microinjection.</a> Acta Biochim Pol. 51 (1), 9-31 (2004).</li><li>Iyer, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Off-target+mutations+are+rare+in+Cas9-modified+mice.">Off-target mutations are rare in Cas9-modified mice.</a> Nat Methods. 12 (6), 479 (2015).</li><li>Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+screening+of+a+CRISPR/Cas9+library+for+functional+genomics+in+human+cells.">High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.</a> Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).</li><li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+of+globin+messenger+RNA+by+the+mouse+ovum.">Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum.</a> Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).</li><li>Pinkert, C. A., Irwin, M. H., Johnson, L. W., Moffatt, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+transfer+into+mouse+ova+by+microinjection.">Mitochondria transfer into mouse ova by microinjection.</a> Transgenic Res. 6 (6), 379-383 (1997).</li><li>Biggers, J. D., Summers, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choosing+a+culture+medium:+making+informed+choices.">Choosing a culture medium: making informed choices.</a> Fertil Steril. 90 (3), 473-483 (2008).</li><li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+transfer+through+the+wall+of+the+fallopian+tube+in+mice.">Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice.</a> Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).</li><li>Truett, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+PCR-quality+mouse+genomic+DNA+with+hot+sodium+hydroxide+and+tris+(HotSHOT).">Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and tris (HotSHOT).</a> Biotechniques. 29 (1), 52-54 (2000).</li><li>Richardson, C. D., Ray, G., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+homology-directed+genome+editing+by+catalytically+active+and+inactive+CRISPR-Cas9+using+asymmetric+donor+DNA.">Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).</li><li>Delerue, F., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Editing+in+Mice+Using+CRISPR/Cas9:+Achievements+and+Prospects.">Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects.</a> Clon. Transgen. 4, (2015).</li></ol>

خطوات حاسمة داخل البروتوكول ومن المعروف أن توليد الفئران المعدلة وراثيا أن يكون تحديا من الناحية الفنية. ومع ذلك، فإن بروتوكول المقدمة هنا هو الأسلوب الأمثل والمبسط الذي يسمح لإتقان واستكشاف هذه التقنية في وقت قياسي. هناك خطوتان ?...

وكانت النماذج الحيوانية، سواء في الفقاريات واللافقاريات، مفيدة لفحص الفيزيولوجيا المرضية للظروف البشرية مثل مرض الزهايمر 1 ، 2 . وهي أيضا أدوات لا تقدر بثمن للبحث عن معدلات المرض وتطوير استراتيجيات العلاج الجديدة في نهاية المطاف على أمل العلاج. على الرغم من أن كل نموذج له قيود جوهرية، واستخدام الحيوانات والنماذج النظامية بأكملها أمر حيوي للبحوث الطبية الحيوية. وذلك لأن البيئة الفسيولوجية الأيضية والمعقدة لا يمكن محاكاة تماما في زراعة الأنسجة. حتى الآن، لا يزال الفأر أنواع الثدييات الأكثر شيوعا المستخدمة في التلاعب الجيني لأنه يتميز العديد من المزايا. يتم حفظ العمليات الفسيولوجية والجينات المرتبطة بالأمراض بشكل كبير بين الفئران والبشر. كان الفأر أول حيوان ثديي له تسلسله الكامل للجينوم (2002)، قبل سنة واحدة من الجين البشريلي (2003). وبصرف النظر عن هذه الثروة من المعلومات الوراثية، والفأر لديه قدرات تربية جيدة، دورة تنمية سريعة (6 أسابيع من الإخصاب إلى الفطام)، وحجم معقول. كل هذه المزايا، إلى جانب المؤشرات الفسيولوجية، مثل الألوان معطف متميزة (المطلوبة لاستراتيجيات عبور)، وجعل الماوس نموذجا جذابا للتلاعب الجيني. ومن الجدير بالذكر أنه في سن مبكرة جدا من علم الوراثة الحديثة، بدأ جريجور مندل العمل على الفئران قبل الانتقال إلى النباتات 3 . وأسفرت تقنيات نقل الجينات عن توليد الفأرة المعدلة وراثيا الأولى على مدى ثلاثة عقود مضت 4 ، التي تم إنشاؤها في البداية باستخدام الولادة الفيروسية. ومع ذلك، سرعان ما أدرك الباحثون أن واحدة من التحديات الرئيسية للالترانزجينيس الماوس هو عدم القدرة على السيطرة على مصير الحمض النووي خارجي. لأن التسليم الفيروسي من الجينات المحورة في البويضات الماوس أدى إلى نسخ متعددة متكاملة بشكل عشوائي في الجينوم، و بوسيبيليتذ من إنشاء خطوط المعدلة وراثيا اللاحقة كان محدودا. تم التغلب على أحد هذه القيود عندما غوردون وآخرون. ولدت أول خط الماوس المعدلة وراثيا بواسطة ميكروينجكتيون 5 ، 6 . بدأ هذا عصر تكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف، والمعلمات التي تؤثر على نتائج جلسة ميكروينجكتيون وقد درست على نطاق واسع 7 . على الرغم من أن ميكروينجكتيون لا يسمح للسيطرة على موقع التكامل من التحوير (الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى مستويات التعبير محددة لكل مؤسس الماوس)، والميزة الرئيسية لل ميكروينجكتيون برونوكلار يبقى تشكيل المحاور ( أي صفائف من نسخ متعددة من التحوير، مرتبطة في سلسلة) قبل التكامل الجيني 5 . وقد استخدمت هذه الخاصية على مر السنين لإنشاء الآلاف من خطوط الماوس المعدلة وراثيا التي أوفيركسريس الجين من الفائدة. ومنذ ذلك الحين، ترانسجينيسيس، والتعديل الجيني لجينوم الكائن الحي، وقد استخدم على نطاق واسع لتحديد دور الجينات واحدة في حدوث الأمراض. تم تحقيق إنجاز رئيسي آخر في التلاعب الجينوم الماوس عندما ماريو كابيتشي تعطل بنجاح الجين واحد في الماوس، وفتح عصر الجينات استهداف 8 . ومع ذلك، ظهرت العيوب الرئيسية بسرعة من الخلايا الجذعية المستندة إلى الخلايا الجذعية المستقرة، بما في ذلك تحديات زراعة الخلايا الجذعية السرطانية، ودرجة متغير نوعا ما من الخيمرية، وطول العملية ( أي 12-18 شهرا، والحد الأدنى، للحصول على الماوس) . في الآونة الأخيرة، ظهرت أوجه التقدم في التكنولوجيات الجديدة، مثل إندونوكليسيس المهندسة (على سبيل المثال، نوكليسيس الإصبع الزنك (زفن)، النسخ المنشط مثل نوكليسيس المستجيب (تالين)، وتجمعات منتظمة متداخلة قصيرة متداخلة قصيرة (كريسبر / Cas9)) كطرق بديلة ل وتسريع عملية استهداف الجينات في هيئة التصنيع العسكريe 9 ، 10 . يمكن حقن هذه إندونوكليس بسهولة في البويضات الماوس عن طريق ميكروينجكتيون، مما يسمح لتوليد الفئران المستهدفة الجينات في اقل من 6 أسابيع. منذ التقرير الأول عن استخدام كريسبر لتحرير الجينوم 11 ، هذا الجهاز المناعي التكتيكي الجرثومي قد حل محل زفن و تالين بسبب العديد من المزايا، بما في ذلك سهولة التوليف والقدرة على استهداف موقع متعدد في وقت واحد (المشار إليها باسم &quot;تعدد الإرسال &quot;). تم استخدام كريسبر لأول مرة لاستهداف الجينات في الفئران 12 ومنذ ذلك الحين تم تطبيقها على عدد لا يحصى من الأنواع، من النباتات إلى البشر 13 ، 14 . وحتى الآن، لا يوجد تقرير عن نوع واحد مقاوم لتحرير الجينوم كريسبر. اثنين من الخطوات الرئيسية المحددة لتوليد الفئران المعدلة وراثيا هي حقن البويضات وإعادة زرعمن هذه البويضات في الإناث الحوامل الزائفة. على الرغم من أن هذه التقنية قد وصفها لنا 15 وآخرون 16 ، والتحسينات التقنية الأخيرة في علم الأجنة الماوس وتقنيات نقل الجينات ثورة في عملية توليد الفئران المعدلة وراثيا. وسيتم وصف هذه التحسينات هنا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 0.1-2.5 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">4920000016</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 2-20 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>4920000040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 20-200 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>4920000067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Micropipette 100-1000 ul</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>4920000083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular weight marker&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33025</td>
			<td>HyperLadder 1kb</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Molecular weight marker&#160;</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-33056</td>
			<td>HyperLadder 100 bp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">EDTA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>93296</td>
			<td>10x - Dilute to 1x</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15585011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SYBR Safe gel stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S33102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Gel extraction kit</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">PCR purification kit (Qiaquick)</td>
			<td style="width:147px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Vacuum system (Manifold)</td>
			<td style="width:147px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A7231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nuclease-free microinjection buffer&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-095-10F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrafree-MC microcentrifuge filter&#160;</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC30GV00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cas9 mRNA</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">CAS9MRNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">CRISPR expressing plasmid (px330)</td>
			<td style="width:147px;">Addgene</td>
			<td style="width:119px;">42230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Phusion polymerase</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T7 Quick High Yield RNA kit</td>
			<td style="width:147px;">New England Biolabs</td>
			<td>E2050S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">RNA purification spin columns (NucAway)</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM10070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">ssOligos</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>OLIGO STANDARD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Donor plasmid</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">GeneArt</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Hyaluronidase</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H3884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">KSOMaa embryo culture medium</td>
			<td>Zenith Biotech&#160;</td>
			<td>ZEKS-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Mineral oil</td>
			<td>Zenith Biotech&#160;</td>
			<td>ZSCO-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">M2 Medium</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Mouthpiece</td>
			<td style="width:147px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Glass microcapillaries</td>
			<td style="width:147px;">Sutter Instrument</td>
			<td style="width:119px;">BF100-78-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Proteinase K</td>
			<td>Applichem</td>
			<td>A3830.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Vessel clamp</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">18374-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Wound clips&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12040-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Clips applier&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td style="width:119px;">12018-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro-scissors&#160;</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>15000-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cauterizer</td>
			<td>Fine Science Tools&#160;</td>
			<td>18000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Non-absorbable surgical sutures (Ethilon 3-0)</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>1691H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">5% CO2 incubator</td>
			<td style="width:147px;">MG Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Galaxy 14S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:147px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">6321 000.515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Electrophoresis set up</td>
			<td style="width:147px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1640300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">UV Transilluminator</td>
			<td style="width:147px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">1708110EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Thermocycler</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td>6334000069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscopic microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td style="width:119px;">IX71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">2x Micromanipulators</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5188000.012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Oocytes manipulator</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5176000.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:307px;">Microinjector (Femtojet)</td>
			<td style="width:147px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5247000.013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:307px;">Mice C57BL/6J strain</td>
			<td style="width:147px;">Australian BioResources</td>
			<td>C57BL/6JAusb&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genetically modified mice through the microinjection of oocytes

وقد ساهم استخدام الفئران المعدلة وراثيا بشكل كبير في الدراسات على كل من الفسيولوجية والمرضية في عمليات الجسم الحي . حقن برونوكلار من التعبير الحمض النووي يبني في البويضات المخصبة لا يزال الأسلوب الأكثر شيوعا لتوليد الفئران المعدلة وراثيا ل أوفيركسريسيون. مع إدخال تكنولوجيا كريسبر لاستهداف الجينات، وقد تم تمديد حقن برونوكلار في البويضات المخصبة لتوليد كل من خروج المغلوب والفئران نوكين. ويصف هذا العمل إعداد الحمض النووي للحقن وتوليد أدلة كريسبر لاستهداف الجينات، مع التركيز بشكل خاص على مراقبة الجودة. إجراءات التنميط الجيني المطلوبة لتحديد المؤسسين المحتملين أمر بالغ الأهمية. وترد في هذا التقرير استراتيجيات مبتكرة للتنميط الجيني تستفيد من قدرات &quot;تعدد الإرسال&quot; في نظام كريسبر. كما يتم تحديد الإجراءات الجراحية. معا، فإن خطوات البروتوكول تسمح لتوليد جينالفئران المعدلة إيكاليا ولإنشاء لاحق من مستعمرات الماوس لمجموعة كبيرة من مجالات البحث، بما في ذلك علم المناعة، علم الأعصاب، والسرطان، وعلم وظائف الأعضاء، والتنمية، وغيرها.

أدناه، يتم وصف سير العمل ل ميكروينجكتيون في حالة التكامل العشوائي و كريسبر بوساطة استهداف الجينات ( الشكل 1 ). <img alt="شكل 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig1v2.jpg" /> الشكل 1: سير ا?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes at JoVE.com

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

يستخدم حقن ميكروينجكتيون من البويضات الماوس لكل من ترانسجينيسيس الكلاسيكية ( أي التكامل العشوائي للجينات المحورة وراثيا) و كريسبر بوساطة استهداف الجينات. هذا البروتوكول يستعرض أحدث التطورات في ميكروينجكتيون، مع التركيز بشكل خاص على مراقبة الجودة واستراتيجيات التنميط الجيني.

جيل من الفئران المعدلة وراثيا من خلال ميكروينجكتيون من البويضات

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of Human Adipose Stem Cells through Dedifferentiation of Mature Adipocytes in Ceiling Cultures

جيل من الخلايا الجذعية الدهنية لجسم الإنسان من خلال فقد التمايز من الناضجة الخلايا الشحمية في الثقافات السقف

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

جيل المعدلة وراثيا الثقافات الجلد الميتة عضوي عن طريق الأدمة الإنسان

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

تقنية لاستهداف حقن مكروي إلى البلدان النامية<em&gt; القيطم</em&gt; الكلى

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

حقن مكروي الجنين و Electroporation في حبلي<em&gt; Ciona المعوية</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

جيل أورجانويد الجلد 3D من سلك المستمدة من الدم الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

جيل أورجانويدس من القنوات الصفراوية اكستراهيباتيك الماوس

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

جيل من iPSC الإنسان القائم على الدم في الدماغ حاجز رقاقة

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

الحد الأدنى من حجم الحساسية من البويضات غير ناضجة القطط

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Separation of Follicular Cells and Oocytes in Ovarian Follicles of Zebrafish

فصل الخلايا الجريبية والبويضات في بصيلات المبيض من حمار وحشي

Zebrafish has become an ideal model to study the ovarian development of vertebrates. The follicle is the basic unit of the ovary, which consists of ...

Generation and Expansion of Human Cardiomyocytes from Patient Peripheral Blood Mononuclear Cells

توليد وتوسيع خلايا القلب البشرية من خلايا الدم المحيطية المريض أحادية النووية

Generating patient-specific cardiomyocytes from a single blood draw has attracted tremendous interest in precision medicine on cardiovascular disease. ...