Name: comprehensive dna methylation analysis using a methyl-cpg-binding domain capture-based method in chronic lymphocytic leukemia patients
Uploaded: 2017-06-16T13:00:00
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この研究は、スウェーデン研究評議会、スウェーデン癌協会、クヌート・アンド・アリス・ヴァレンベルグ財団（KAW）、およびフォア・ヴェストラゴタランセリージョン・オブ・ザ・イヤーによって支持された。

CLLサンプルを収集するための倫理的承認は、2007年5月21日から、次の登録番号：EPN Gbg dnr 239/07である。すべてのCLL患者は最近改訂された基準8に従って診断され、サンプルは診断時に収集された。研究の患者は、書面による同意が得られた後、スウェーデン西部の様々な血液学部門から含まれていた。この研究では、白血病細胞の腫瘍パーセンテージが70％以上であるCLL末梢?...

<ol>
	<li>Kanduri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+genome-wide+array-based+methylation+profiles+in+prognostic+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia.">Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia.</a> Blood. 115 (2), 296-305 (2010).</li><li>Cahill, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=450K-array+analysis+of+chronic+lymphocytic+leukemia+cells+reveals+global+DNA+methylation+to+be+relatively+stable+over+time+and+similar+in+resting+and+proliferative+compartments.">450K-array analysis of chronic lymphocytic leukemia cells reveals global DNA methylation to be relatively stable over time and similar in resting and proliferative compartments.</a> Leukemia. 27 (1), 150-158 (2013).</li><li>Kanduri, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+transcriptional+control+in+major+immunogenetic+subsets+of+chronic+lymphocytic+leukemia+exhibiting+subset-biased+global+DNA+methylation+profiles.">Distinct transcriptional control in major immunogenetic subsets of chronic lymphocytic leukemia exhibiting subset-biased global DNA methylation profiles.</a> Epigenetics. 7 (12), 1435-1442 (2012).</li><li>Kulis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenomic+analysis+detects+widespread+gene-body+DNA+hypomethylation+in+chronic+lymphocytic+leukemia.">Epigenomic analysis detects widespread gene-body DNA hypomethylation in chronic lymphocytic leukemia.</a> Nat Genet. 44 (11), 1236-1242 (2012).</li><li>Booth, M. 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T., Kanduri, C., Kanduri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+DNA+methylation+profiling+reveals+new+insights+into+epigenetically+deregulated+protein+coding+and+long+noncoding+RNAs+in+CLL.">Global DNA methylation profiling reveals new insights into epigenetically deregulated protein coding and long noncoding RNAs in CLL.</a> Clin Epigenetics. 8, 106 (2016).</li><li>Hallek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+diagnosis+and+treatment+of+chronic+lymphocytic+leukemia:+a+report+from+the+International+Workshop+on+Chronic+Lymphocytic+Leukemia+updating+the+National+Cancer+Institute-Working+Group+1996+guidelines.">Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic lymphocytic leukemia: a report from the International Workshop on Chronic Lymphocytic Leukemia updating the National Cancer Institute-Working Group 1996 guidelines.</a> Blood. 111 (12), 5446-5456 (2008).</li><li>De Meyer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+evaluation+of+methyl+binding+domain+based+kits+for+enrichment+DNA-methylation+sequencing.">Quality evaluation of methyl binding domain based kits for enrichment DNA-methylation sequencing.</a> PLoS One. 8 (3), e59068 (2013).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. 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K., Shi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=featureCounts:+an+efficient+general+purpose+program+for+assigning+sequence+reads+to+genomic+features.">featureCounts: an efficient general purpose program for assigning sequence reads to genomic features.</a> Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+silencing+of+miR-26A1+in+chronic+lymphocytic+leukemia+and+mantle+cell+lymphoma:+Impact+on+EZH2+expression.">Epigenetic silencing of miR-26A1 in chronic lymphocytic leukemia and mantle cell lymphoma: Impact on EZH2 expression.</a> Epigenetics. 11 (5), 335-343 (2016).</li><li>Robinson, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+affinity-based+genome-wide+DNA+methylation+data:+effects+of+CpG+density,+amplification+bias,+and+copy+number+variation.">Evaluation of affinity-based genome-wide DNA methylation data: effects of CpG density, amplification bias, and copy number variation.</a> Genome Res. 20 (12), 1719-1729 (2010).</li></ol>

MBD-seqは、費用対効果の高い免疫沈降に基づく技術であり、完全なゲノムワイドカバレッジでメチル化パターンを研究するために使用できます。 MeDIP seq（メチル化DNA免疫沈降の後にシーケンシング）およびMBD-seqの両方が、CpGが豊富なメチル化DNAの濃縮をもたらす。しかしながら、MBD-seqは、MeDIP seq19と比較した場合、高度にCpGに富む領域への結合に対するより高い親和性を示す。メチル結合濃...

近年、全世界のDNAメチル化プロファイルを解析するための次世代シーケンシング技術の使用が増えています。メチル化感受性制限酵素消化、およびメチルCpG特異的抗体を用いたメチル化DNAの免疫沈降に基づいて、ゲノムワイドメチル化アッセイ（マイクロアレイおよび非マイクロアレイベースの方法を含む）を開発した。 異常なDNAメチル化は、慢性リンパ球性白血病（CLL）を含む白血病およびリンパ腫の特徴の1つである。以前は、私たちを含むいくつかのグループが、ゲノムDNAの重亜硫酸塩変換、マイクロアレイベースの方法または全ゲノム配列決定1,2,3を用いて、異なるCLL予後サブグループおよび正常な健康なB細胞コントロールのDNAメチル化プロファイルを特徴付けた、 &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 4。ゲノムDNAの重亜硫酸塩の変換は、修飾されていないシトシンのウラシルへの脱アミノ化をもたらし、修飾メチル化シトシンをゲノムに残す。一旦変換されると、DNAのメチル化状態は、マイクロアレイベースまたは全ゲノムバイサルファイトシークエンシング（WGBS）のような異なる定量的または定性的方法を用いたPCR増幅および配列決定によって決定することができる。重亜硫酸塩変換に基づく方法は多くの利点を有し、DNAメチル化レベルを分析するために異なる癌型で広く使用されているが、この技術に関連するいくつかの欠点がある。 WGBSシークエンシングにより、より少ないDNA量で1塩基対の分解能が得られ、多数のサンプルを分析するのに最適なオプションです。しかしながら、この方法は、ゲノム5,6中の 5mCレベルと5hmCレベルとの間の改変を区別することができない。さらに、マイクロアレイに基づく方法は完全なcを提供しないゲノムの超過。 私たちの研究室7の最近の研究では、重亜硫酸塩変換ではなく、免疫沈降に基づく方法を用いて、CLL患者および正常な健常対照における全体的な規模で高度にCpGが豊富な差別的にメチル化された領域を同定した。 Inmethyl-CpG結合ドメイン（MBD）の次世代配列決定（MBD-seq）では、二本鎖断片化DNAの濃縮はCpGメチル化の程度に依存する。この方法は、重亜硫酸塩変換法の欠点を克服することができ、バイアスのないPCRおよびPCR非依存的な方法でCpGメチル化のゲノムワイドカバレッジを提供することもできる。さらに、重亜硫酸塩変換に基づくマイクロアレイ法とは異なり、MBD-seqを使用して、長い散在性核要素（LINE）、短い散在核要素（SINE）、長い末端反復配列（LTRS）などの反復要素のメチル化状態を分析することができる。 等 。しかしながら、亜硫酸水素塩の変換方法と比較して、MBD-seqプロトコルは比較的大量の入力DNAを必要とする。また、配列決定の質およびデータは、使用される抗体の特異性、親和性および品質に依存する。 現在の研究では、次世代シーケンシングのためにメチル化DNAを濃縮するための詳細なMBD-seqプロトコルについて説明しています。これは市販のメチル化DNA結合濃縮キット（ 材料表に記載されている）と、メチル化シーケンシングデータを視覚化して解釈してCLL特異的なハイパーサイトおよびハイポメチル化領域を同定する計算パイプラインを使用しています。基本的に、この方法は、メチル化CpGで富化されたDNAを抽出するためのメチル化CpGとのヒトMBD2タンパク質相互作用のMBDの能力を利用し、メチル化DNAのハイスループットシーケンシングが続く。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dneasy Blood and tissue kit</td>
			<td style="width:124px;">Qaigen</td>
			<td style="width:119px;">69504</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lymphoprep solution</td>
			<td style="width:124px;">A X I S-S H I E L D</td>
			<td style="width:119px;">1114544</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nano drop 2000</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fischersceintific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="51">
			<td height="51" style="height:51px;width:216px;">TE buffer PH 8</td>
			<td style="width:124px;">Sigma aldrich</td>
			<td style="width:119px;">93283</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bioruptor standard sonication device</td>
			<td style="width:124px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">UCD-200</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">TPX bioruptor tubes 1.5ml</td>
			<td style="width:124px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C30010010-300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">3 M Sodium acetate</td>
			<td style="width:124px;">Diagenode</td>
			<td>C03030002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">E-gel iBase safe imager combo kit</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fischersceintific</td>
			<td style="width:119px;">G6465EU</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">E-gel 2% Agarose gels</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fischersceintific</td>
			<td style="width:119px;">G441002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Methylminer Methylated DNA enrichment kit</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fischersceintific</td>
			<td style="width:119px;">ME10025</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Labquake Tube Shaker/Rotators</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fischersceintific</td>
			<td style="width:119px;">415110</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dynal MPC-S</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fischersceintific</td>
			<td style="width:119px;">A13346</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vortex mixer</td>
			<td style="width:124px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">12620-848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Absolute Ethanol</td>
			<td style="width:124px;">Any company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">70% Ethanool</td>
			<td style="width:124px;">Any company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DNAse free water</td>
			<td style="width:124px;">Milli Q</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DNA precipitant (3M sodium acetate)</td>
			<td style="width:124px;">Diagenode</td>
			<td style="width:119px;">C03030002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Safe seal 1.5ml eppendorf tubes</td>
			<td style="width:124px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">4036-3204</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fischersceintific</td>
			<td style="width:119px;">Q32851</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qubit 0.5ml tubes</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fischersceintific</td>
			<td style="width:119px;">Q32856</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qubit</td>
			<td style="width:124px;">Thermo Fischersceintific</td>
			<td style="width:119px;">Q32866</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Illumina Hiseq2000 Platform</td>
			<td style="width:124px;">Illumina</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Water&#160; Bath</td>
			<td style="width:124px;">Grant</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Heat block</td>
			<td style="width:124px;">grant</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Tube rotater</td>
			<td style="width:124px;">Labquake</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

comprehensive dna methylation analysis using a methyl-cpg-binding domain capture-based method in chronic lymphocytic leukemia patients

癌における長い非コードRNA（lncRNA）の役割は、癌の発達および進行中のそれらの機構的機能の理解への関心の高まりから、最前線に来ている。それにもかかわらず、特に慢性リンパ球性白血病（CLL）において、lncRNAおよび癌における反復配列の全体的なエピジェネティックな制御は十分に研究されていない。この研究では、メチル結合ドメイン（MBD）タンパク質を用いた二本鎖メチル化DNA断片の免疫沈降に基づく捕捉、次世代シーケンシング（MBD-seq）に続くユニークなアプローチに焦点を当てています。 2つの予後サブグループ（5つのIGVH変異サンプル+ 5つのIGVH非変異サンプル）に属するCLL患者サンプルをこの研究で使用した。分析により、正常な健康対照と比較して5,800の過剰メチル化および12,570低メチル化CLL特異的差異的メチル化遺伝子（cllDMG）が明らかにされた。重要なことに、これらの結果は、いくつかのCLL特異的な、差異的にメチル化されたlncRNAを同定した鋭い要素、および予後の価値を潜在的に有するタンパク質コード遺伝子が含まれる。この研究は、CLL患者試料を用いた高度にCpGが豊富な領域における全体的メチル化プロファイルの包括的な解析のために開発されたMBD-seqおよびバイオインフォマティクスパイプラインの詳細なプロトコルを概説している。最後に、タンパク質コード遺伝子およびlncRNAを、パイロシーケンシングを用いて検証した。これは、CpGメチル化レベルを分析してMBD-seqプロトコールからの知見をさらに裏づける高度に定量的な方法である。

MBD-seqは最近、CLL患者および一致した正常な健常対照に対して行われ、CLL特異的差次的に過剰および低メチル化された遺伝子を同定した7 。 CLLおよび正常な健康サンプルから生成されたデータを分析するために使用される実験的および生物情報パイプラインを図1Aおよび1Bに示す 。これらの分析は、IGHV変異およびIGH...

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Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

この研究では、最適化されたメチル-CpG結合ドメイン（MBD）配列決定プロトコルと、慢性リンパ球性白血病（CLL）患者において差別的にメチル化されたCpGリッチ領域を同定するための計算パイプラインについて記載する。

慢性リンパ球性白血病患者におけるメチル-CpG結合ドメイン捕捉に基づく包括的DNAメチル化解析

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

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新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Candidate Gene Testing in Clinical Cohort Studies with Multiplexed Genotyping and Mass Spectrometry

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Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Single-Molecule F&ouml;rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

Single-Molecule FÃƒÆ’Ã‚Â¶rster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1

GEN1によるホリデイ接合分解能のリアルタイム調査のための単分子フェルスター共鳴エネルギー伝達法

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Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

急性骨髄性白血病細胞におけるCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質によるRUNX1イントロニックサイレンサーの転写役割の調査

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2&prime;-Deoxyuridine (IdU) with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

Use of the Pyrimidine Analog, 5-Iodo-2ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã‚Â²-Deoxyuridine IdU with Cell Cycle Markers to Establish Cell Cycle Phases in a Mass Cytometry Platform

ピリミジン類似体である5-ヨード-2'-デオキシウリジン(IdU)と細胞周期マーカーを使用して、マスサイトメトリープラットフォームで細胞周期相を確立します(英語)

The regulation of cell cycle phase is an important aspect of cellular proliferation and homeostasis. Disruption of the regulatory mechanisms governing the ...

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

骨肉腫由来細胞外小胞で治療した間葉系幹細胞のメチル化解析

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...