Name: protocols for c-brick dna standard assembly using cpf1
Uploaded: 2017-06-15T14:00:00
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Nous remercions Shanghai Tolo Biotech pour son assistance technique lors du développement de la norme C-Brick. Ce travail a été soutenu par des subventions du Programme de recherche prioritaire stratégique de l&#39;Académie chinoise des sciences (Subvention n ° XDB19040200).

1. Préparation de crRNA <ol><li> Préparation des modèles CRRNA <ol><li> Ré-suspendre les oligonucléotides individuels ( Tableau 1 ) dans de l&#39;eau exempte de RNase à une concentration de 10 uM. </li><li> Ajouter 22,5 μl d&#39;oligonucléotide de brin supérieur (T7-F dans le tableau 1 ), 22,5 μl d&#39;oligonucléotide de brin inférieur ( Tableau 1 ) et 5 μL de tampon de recuit 10x à un tube de PCR de 0,2 ml. Assurez-vous que le volume to...

<ol>
	<li>Canton, B., Labno, A., Endy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+and+standardization+of+synthetic+biological+parts+and+devices.">Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices.</a> Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).</li><li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts.">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J Biol Eng. 2, (2008).</li><li>Knight, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , 1-11 (2003).</li><li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Brick:+A+New+Standard+for+Assembly+of+Biological+Parts+Using+Cpf1.">C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li><li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BglBricks:+A+flexible+standard+for+biological+part+assembly.">BglBricks: A flexible standard for biological part assembly.</a> J Biol Eng. 4 (1), (2010).</li><li>Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+Applications+of+CRISPR+Systems:+Harnessing+Nature's+Toolbox+for+Genome+Engineering.">Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering.</a> Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+synthetic+biology.">A brief history of synthetic biology.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).</li><li>Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology+for+synthetic+chemistry.">Synthetic biology for synthetic chemistry.</a> ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).</li></ol>

Ce protocole décrit une procédure pour la norme d&#39;assemblage d&#39;ADN C-Brick. L&#39;étape la plus importante dans ce protocole est la linéarisation du vecteur standard C-Brick; Le clivage incomplet du vecteur pourrait affecter gravement le taux de réussite. En outre, bien que Cpf1 couvre principalement les séquences d&#39;ADN cible dans le schéma de clivage &quot;18-23&quot;, un clivage inexact près des deux bases a également été détecté 4 , ce qui peut provoquer un petit nombr...

La standardisation des parties biologiques de l&#39;ADN est importante pour le développement de la biologie synthétique 1 . Le développement d&#39;une procédure d&#39;assemblage d&#39;ADN peut remplacer des conceptions expérimentales ponctuelles et éliminer plusieurs des résultats inattendus qui surviennent lors de l&#39;assemblage de composants génétiques dans des systèmes plus vastes. La norme BioBrick (BBF RFC 10) était l&#39;une des premières normes d&#39;assemblage d&#39;ADN proposées. Il utilise la séquence de préfixe (contenant des sites de coupe EcoRI et XbaI) et la séquence de suffixe (contenant les sites de coupe SpeI et PstI) 2 , 3 . Étant donné que XbaI et SpeI ont des extrémités cohésives complémentaires, les pièces d&#39;ADN BioBrick qui sont coupées avec XbaI et SpeI peuvent être jointes, générant un nouveau BioBrick pour un assemblage itératif supplémentaire. Certains défauts ont été identifiés avec l&#39;utilisation de la norme BioBrick 4 . Par exemple, il produit une cicatrice de 8 pbEntre les parties d&#39;ADN, ce qui ne permet pas la construction de protéines in-fusion. En outre, les quatre types de sites de restriction de 6 pb susmentionnés doivent être retirés des pièces d&#39;ADN, ce qui est très gênant. La norme BglBrick a été établie pour résoudre le premier problème 5 . Il crée une cicatrice &quot;GGATCT&quot; de 6 p. 100, produisant Gly-Ser et permettant la fusion de protéines multiples ou de domaines protéiques. IBrick a été développé pour traiter le deuxième problème 6 . Il utilise des endonucléases homing (HE) qui reconnaissent de longues séquences d&#39;ADN. Comme les sites de reconnaissance HE existent rarement dans les séquences d&#39;ADN naturelles, la norme iBrick peut être utilisée pour la construction directe de pièces iBrick sans modifier leurs séquences d&#39;ADN. Cependant, la norme iBrick laisse une cicatrice de 21 pb entre les parties de l&#39;ADN, ce qui pourrait être la raison de son impopularité. Au cours des dernières années, les répétitions palindromiques courtes classées régulièrement (CRISPR) s&#39;est développé rapidement 7 , 8 . Parmi les protéines associées au CRISPR (Cas), l&#39;endonucléase Cas9 de Streptococcus pyogenes est maintenant largement utilisée. Il introduit principalement des ruptures d&#39;ADN bicaténaires (DSB) avec des extrémités franches 9 . En 2015, Zhang et ses collègues ont caractérisé pour la première fois Cpf1 (CRISPR de Prevotella et Francisella 1). Il appartient au système CRISPR-Cas de classe 2 de type V et est une endonucléase 10 CRISRP (CRARN). Contrairement à Cas9, Cpf1 introduit un DSB avec un surtension de 5 ou 5 nt 5 &#39;10. Sur la base de cette caractéristique, Cpf1 a été utilisé pour développer une norme d&#39;assemblage d&#39;ADN, C-Brick 4 . Sur un vecteur standard C-Brick, quatre sites Cpf1 de T1 / T2 préfixés et T3 / T4 suffixés flanquent les parties biologiques; Ceci est similaire à la norme BioBrick. Comme le clivage des sites T2 et T3 pTransforme les extrémités collantes complémentaires, il est possible d&#39;effectuer l&#39;assemblage itératif des pièces d&#39;ADN tout en générant une cicatrice &quot;GGATCC&quot; entre les pièces. Notamment, la norme C-Brick a deux avantages principaux: reconnaître des séquences cibles longues et laisser des cicatrices courtes. La cicatrice &quot;GGATCC&quot; de 6 pb générée par C-Brick encode Gly-Ser, qui permet la construction de protéines de fusion. En outre, la norme C-Brick est également partiellement compatible avec les standards BglBrick et BioBrick.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="828">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Comercial Oligonucleotide</td>
			<td style="width:160px;">Sangon Biotech</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x Taq PCR Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Transgen</td>
			<td style="width:161px;">#J40928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Ultra Pure Distilled Water</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">5x RNA Transcription Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">K0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">#EP0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">NTP mixture</td>
			<td style="width:160px;">Sangon</td>
			<td style="width:161px;">#ND0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">RRI(Recombinant RNase Inhibitor)</td>
			<td style="width:160px;">Takara</td>
			<td style="width:161px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:160px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:161px;">R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">UV-Vis Spectrometer</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">Nano-Drop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">2x Phanta Max Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Vazyme</td>
			<td style="width:161px;">PB505</td>
			<td>PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">dNTPs</td>
			<td style="width:160px;">Transgen</td>
			<td style="width:161px;">AD101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:316px;">Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:160px;">Vazyme</td>
			<td style="width:161px;">P505-d1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Ezmax for One-step Cloning</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">24303-1</td>
			<td>seamless assembly kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">5x Buffer for Ezmax One-step Cloning</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">BamHI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">BamHI-HF</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R3136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">BglII&#160;</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R0144L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">XbaI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R0145L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">SpeI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R3133L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x Buffer 3</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#B7003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x T4 DNA ligase Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">DpnI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R01762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">SV Gel and PCR clean-up system</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td style="width:161px;">A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Plasmid Mini Kit I</td>
			<td style="width:160px;">Omega</td>
			<td style="width:161px;">D6943-02</td>
			<td>plasmid preparation kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">thermosensitive alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">#EF0651</td>
			<td>FastAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x Cpf1 buffer</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Cpf1</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32105</td>
			<td>FnCpf1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">thermocycler</td>
			<td style="width:160px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">veriti 96 well</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">C-Brick standard vector</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">98101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">E. coli [DH10B]</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">18297010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Luria-Bertani media (tryptone)</td>
			<td style="width:160px;">Oxoid</td>
			<td style="width:161px;">LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Luria-Bertani media (yeast extract)</td>
			<td style="width:160px;">Oxoid</td>
			<td style="width:161px;">LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Luria-Bertani media (NaCl)</td>
			<td style="width:160px;">Sangon Biotech</td>
			<td style="width:161px;">B126BA0007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for c-brick dna standard assembly using cpf1

La protéine CPf1 associée au CRISPR clive l&#39;ADN bicaténaire sous la direction de l&#39;ARN CRISPR (CRRNA), générant des extrémités collantes. En raison de cette caractéristique, Cpf1 a été utilisé pour l&#39;établissement d&#39;une norme d&#39;assemblage d&#39;ADN appelée C-Brick, qui présente l&#39;avantage de longs sites de reconnaissance et de cicatrices courtes. Sur un vecteur C-Brick standard, il existe quatre sites de reconnaissance Cpf1 - le préfixe (sites T1 et T2) et le suffixe (sites T3 et T4) - éléments d&#39;ADN biologiques flanquant. Le clivage des sites T2 et T3 produit des extrémités collantes complémentaires, qui permettent l&#39;assemblage de pièces d&#39;ADN avec des sites T2 et T3. Pendant ce temps, une courte cicatrice &quot;GGATCC&quot; est générée entre les pièces après l&#39;assemblage. Comme le plasmide nouvellement formé contient à nouveau les quatre sites de clivage Cpf1, la méthode permet l&#39;assemblage itératif de pièces d&#39;ADN, ce qui est similaire à celui des standards BioBrick et BglBrick. Une procédure décrivant l&#39;utilisation de la norme C-Brick pour assembler des pièces d&#39;ADNEst décrit ici. La norme C-Brick peut être largement utilisée par les scientifiques, les étudiants diplômés et les étudiants de premier cycle, et même les amateurs.

<html> Ce protocole a démontré l&#39;assemblage de trois cassettes de chromoprotéines (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) et amilGFP (BBa_K592010)). Tout d&#39;abord, les séquences codantes des trois gènes et terminateurs mentionnés ci-dessus ont été clones individuellement dans un vecteur standard C-Brick. Des parties d&#39;ADN courtes, un promoteur et un terminateur, ont été introduits dans le vecteur C-Brick par amplification PCR en utilisant des amorces contenant le...

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Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

La protéine Cpf1 associée à CRISPR peut être guidée par un ARN CRISPR spécialement conçu (CRRNA) pour cliver l&#39;ADN bicaténaire aux sites souhaités, générant des extrémités collantes. Sur la base de cette caractéristique, une norme d&#39;assemblage d&#39;ADN (C-Brick) a été établie, et un protocole détaillant son utilisation est décrit ici.

Protocoles pour l&#39;assemblage standard d&#39;ADN de C-Brick utilisant Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Research

JoVE Journal

Genetics

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Recherche

Génétique

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Étude de l&#39;expression génétique régulée par un cycle cellulaire par deux protocoles complémentaires de synchronisation cellulaire

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

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Détermination de l’emplacement chromosomique optimale pour un élément d’ADN chez Escherichia coli en utilisant une nouvelle approche induite par le Transposon

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