Name: protocols for c-brick dna standard assembly using cpf1
Uploaded: 2017-06-15T14:00:00
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우리는 C-Brick 표준 개발 과정에서 기술 지원을 해주신 Shanghai Tolo Biotech에게 감사드립니다. 이 연구는 중국 과학 아카데미의 전략적 우선 순위 연구 프로그램 (Grant No. XDB19040200)의 교부금으로 지원되었다.

1. crRNA의 제조 <ol><li> crRNA 주형의 제조 <ol><li> RNase가없는 물에서 10 μM의 농도로 개별 올리고 뉴클레오티드 ( 표 1 )를 재현 탁하십시오. </li><li> 상단 스트랜드 올리고 뉴클레오티드 ( 표 1의 T7-F) 22.5 μL, 하단 스트랜드 올리고 뉴클레오티드 22.5 μL ( 표 1 ) 및 10 mL 어닐링 완충액 5 μL를 0.2 mL PCR 튜브에 첨가한다. 총 부피가 50 μL인지 확인하십시오. <b...

<ol>
	<li>Canton, B., Labno, A., Endy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+and+standardization+of+synthetic+biological+parts+and+devices.">Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices.</a> Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).</li><li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts.">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J Biol Eng. 2, (2008).</li><li>Knight, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , 1-11 (2003).</li><li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Brick:+A+New+Standard+for+Assembly+of+Biological+Parts+Using+Cpf1.">C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li><li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BglBricks:+A+flexible+standard+for+biological+part+assembly.">BglBricks: A flexible standard for biological part assembly.</a> J Biol Eng. 4 (1), (2010).</li><li>Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iBrick:+a+new+standard+for+iterative+assembly+of+biological+parts+with+homing+endonucleases.">iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases.</a> PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li><li>Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+Applications+of+CRISPR+Systems:+Harnessing+Nature's+Toolbox+for+Genome+Engineering.">Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering.</a> Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bricks+and+blueprints:+methods+and+standards+for+DNA+assembly.">Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).</li><li>Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+synthetic+biology.">A brief history of synthetic biology.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).</li><li>Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology+for+synthetic+chemistry.">Synthetic biology for synthetic chemistry.</a> ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).</li></ol>

이 프로토콜은 DNA 어셈블리 표준 C-Brick을위한 절차를 설명합니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 C-Brick 표준 벡터의 선형화입니다. 벡터가 불완전하게 절단되면 성공률에 심각한 영향을 줄 수 있습니다. 또한, Cpf1은 주로 &quot;18-23&quot;분열 패턴의 표적 DNA 서열을 절단하지만, 두 개의 염기 근처에서 부정확 한 절단이 또한 검출되었는데, 이는 DNA 조립 후 작은 수의 돌연변이를 일으킬 수있다...

DNA 생물학적 부분의 표준화는 합성 생물학 1 의 개발에 중요합니다. DNA 조립 절차의 개발은 임시 실험 설계를 대체 할 수 있고 유전체 구성 요소를 대형 시스템으로 조립하는 동안 발생하는 예기치 않은 결과를 제거 할 수 있습니다. BioBrick 표준 (BBF RFC 10)은 가장 초기에 제안 된 DNA 어셈블리 표준 중 하나였습니다. 접두어 시퀀스 (EcoRI 및 XbaI 절단 사이트 포함)와 접미사 시퀀스 (SpeI 및 PstI 절단 사이트 포함) 2 , 3을 사용 합니다. XbaI와 SpeI는 상호 보완적인 응집력을 지니고 있기 때문에 XbaI와 SpeI로 절단 된 BioBrick DNA 부품을 결합하여 추가 반복 조립을위한 새로운 BioBrick을 생성 할 수 있습니다. 일부 결함은 BioBrick 표준을 사용하여 확인되었습니다. 예를 들어, 8-bp 흉터를 생성합니다.융합 단백질을 만들 수없는 DNA 부분들 사이. 게다가 위에서 언급 한 네 종류의 6-bp 제한 효소 부위는 DNA 부분에서 제거해야하므로 매우 불편합니다. BglBrick 표준은 첫 번째 문제를 해결하기 위해 수립되었습니다. 5 . 이것은 6-bp의 &quot;GGATCT&quot;흉터를 만들어 Gly-Ser를 만들고 여러 단백질 또는 단백질 도메인의 융합을 허용합니다. iBrick은 두 번째 문제점 6 을 처리하기 위해 개발되었습니다. 그것은 긴 DNA 염기 서열을 인식하는 homing endonucleases (HE)를 사용합니다. HE 인식 사이트가 천연 DNA 서열에는 거의 존재하지 않기 때문에, iBrick 표준은 DNA 서열을 수정하지 않고 iBrick 부품의 직접 건설에 사용될 수 있습니다. 그러나 iBrick 표준은 DNA 부분 사이에 21bp의 흉터를 남겨 둡니다. 이는 인기가없는 이유 일 수 있습니다. 최근 몇 년 동안, 클러스터 된 정기적으로 interresaced 짧은 palindromic 반복 (CRISPR) 시스템이 급속히 발전했다. CRISPR- 관련 (Cas) 단백질 중에서, Streptococcus pyogenes 로부터의 Cas9 엔도 뉴 클레아 제가 현재 널리 사용되고있다. 주로 둔기가있는 이중 가닥 DNA 브레이크 (DSB)를 도입합니다. 2015 년 Zhang과 동료들은 처음으로 Cpf1 ( Prevotella 와 Francisella의 CRISPR)을 특징으로했습니다. 그것은 클래스 2 유형 V CRISPR-Cas 시스템에 속하며 CRISRP RNA (crRNA) 유도 된 endonuclease 10 입니다. Cas9와는 달리, Cpf1은 4 또는 5 nt의 5 &#39;오버행을 갖는 DSB를 도입한다. 이 특성을 바탕으로 Cpf1은 DNA 어셈블리 표준 인 C-Brick 4 를 개발하는 데 사용되었습니다. C-Brick 표준 벡터에서, 접두어가 붙은 T1 / T2와 접미사가 붙은 T3 / T4의 4 개의 Cpf1 표적 부위는 생물학적 부분에 인접 해 있습니다. 이는 BioBrick 표준과 유사합니다. T2 및 T3 부위의 절단으로서상보적인 끈적 끈적한 말단이 생기면 DNA 부분의 반복적 인 조립을 수행하는 동시에 부품들 사이에 &quot;GGATCC&quot;흉터를 생성 할 수 있습니다. 특히, C-Brick 표준에는 긴 대상 시퀀스 인식과 짧은 흉터 남기기라는 두 가지 주요 이점이 있습니다. C-Brick이 만든 6 bp &quot;GGATCC&quot;흉터는 Gly-Ser를 암호화하며 융합 단백질을 만들 수 있습니다. 또한 C-Brick 표준은 BglBrick 및 BioBrick 표준과 부분적으로 호환됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="828">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Comercial Oligonucleotide</td>
			<td style="width:160px;">Sangon Biotech</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x Taq PCR Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Transgen</td>
			<td style="width:161px;">#J40928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Ultra Pure Distilled Water</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">5x RNA Transcription Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">K0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">#EP0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">NTP mixture</td>
			<td style="width:160px;">Sangon</td>
			<td style="width:161px;">#ND0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">RRI(Recombinant RNase Inhibitor)</td>
			<td style="width:160px;">Takara</td>
			<td style="width:161px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:160px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:161px;">R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">UV-Vis Spectrometer</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">Nano-Drop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">2x Phanta Max Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Vazyme</td>
			<td style="width:161px;">PB505</td>
			<td>PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">dNTPs</td>
			<td style="width:160px;">Transgen</td>
			<td style="width:161px;">AD101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:316px;">Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:160px;">Vazyme</td>
			<td style="width:161px;">P505-d1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Ezmax for One-step Cloning</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">24303-1</td>
			<td>seamless assembly kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">5x Buffer for Ezmax One-step Cloning</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">BamHI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">BamHI-HF</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R3136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">BglII&#160;</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R0144L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">XbaI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R0145L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">SpeI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R3133L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x Buffer 3</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#B7003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x T4 DNA ligase Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">DpnI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R01762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">SV Gel and PCR clean-up system</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td style="width:161px;">A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Plasmid Mini Kit I</td>
			<td style="width:160px;">Omega</td>
			<td style="width:161px;">D6943-02</td>
			<td>plasmid preparation kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">thermosensitive alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">#EF0651</td>
			<td>FastAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x Cpf1 buffer</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Cpf1</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32105</td>
			<td>FnCpf1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">thermocycler</td>
			<td style="width:160px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">veriti 96 well</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">C-Brick standard vector</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">98101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">E. coli [DH10B]</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">18297010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Luria-Bertani media (tryptone)</td>
			<td style="width:160px;">Oxoid</td>
			<td style="width:161px;">LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Luria-Bertani media (yeast extract)</td>
			<td style="width:160px;">Oxoid</td>
			<td style="width:161px;">LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Luria-Bertani media (NaCl)</td>
			<td style="width:160px;">Sangon Biotech</td>
			<td style="width:161px;">B126BA0007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for c-brick dna standard assembly using cpf1

CRISPR 관련 단백질 Cpf1은 CRISPR RNA (crRNA)의지도하에 이중 가닥 DNA를 절단하여 끈적 거리는 말단을 생성합니다. 이러한 특성 때문에 Cpf1은 C- 브릭 (C-Brick)이라는 DNA 어셈블리 표준의 확립에 사용되어 오랜 인식 사이트와 짧은 흉터의 장점을 가지고 있습니다. 표준 C-Brick 벡터에는 접두어 (T1 및 T2 사이트)와 접미어 (T3 및 T4 사이트) - 생물학적 DNA 부분이 인접한 4 개의 Cpf1 인식 사이트가 있습니다. T2 및 T3 부위의 절단은 상보적인 끈적한 말단을 생성하여 T2 및 T3 부위를 갖는 DNA 부분의 조립을 허용한다. 한편 조립 후 부품 사이에는 짧은 &quot;GGATCC&quot;흉터가 생깁니다. 새로 형성된 플라스미드가 다시 4 개의 Cpf1 절단 부위를 포함하기 때문에이 방법은 BioBrick 및 BglBrick 표준과 유사한 DNA 부분의 반복적 조립을 가능하게합니다. C-Brick 표준을 사용하여 DNA 부품을 조립하는 절차여기에 설명되어 있습니다. C-Brick 표준은 과학자, 대학원생, 학부생, 심지어 아마추어들까지 광범위하게 사용할 수 있습니다.

<html> 이 프로토콜은 세 가지 색소 카세트 (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) 및 amilGFP (BBa_K592010))의 조립을 시연했습니다. 먼저, 상기 3 가지 유전자 및 터미네이터의 코딩 서열을 개별적으로 C- 브릭 표준 벡터에 클로닝 하였다. 5 &#39;말단에 짧은 DNA 부분을 포함하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 통해 짧은 DNA 부분, 프로모터 및 터미네이터를 C-Brick 벡터에 도입 하였다. 이...

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Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR 관련 단백질 Cpf1은 원하는 위치에서 이중 가닥 DNA를 절단하여 끈적 거리는 말단을 생성하도록 특별히 고안된 CRISPR RNA (crRNA)에 의해 유도 될 수 있습니다. 이 특성을 바탕으로 DNA 어셈블리 표준 (C-Brick)이 수립되었으며 여기에 그 사용법을 자세히 설명하는 프로토콜이 설명되어 있습니다.

Cpf1을 이용한 C-Brick DNA 표준 어셈블리 프로토콜

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

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연구

유전학

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

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Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

심장 세포 치료를 위한 줄기 세포 DNA 무결성을 평가

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

음향 나노 디스펜싱 기술을 사용한 고처리량 DNA 플라스미드 멀티플렉싱 및 트랜스펙션

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...