Name: protocols for c-brick dna standard assembly using cpf1
Uploaded: 2017-06-15T14:00:00
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Agradecemos a Shanghai Tolo Biotech por sua assistência técnica durante o desenvolvimento do padrão C-Brick. Este trabalho foi apoiado por bolsas do Programa de Pesquisa Prioritária Estratégica da Academia Chinesa de Ciências (Grant No. XDB19040200).

1. Preparação de crRNA <ol><li> Preparação de modelos CRRNA <ol><li> Re-suspenda os oligonucleótidos individuais ( Tabela 1 ) em água sem RNase até uma concentração de 10 uM. </li><li> Adicionar 22,5 μL de oligonucleótido de cadeia superior (T7-F na Tabela 1 ), 22,5 μL de oligonucleótido de cadeia inferior ( Tabela 1 ) e 5 μL de tampão de recozimento 10x a um tubo de PCR de 0,2 mL. Certifique-se de que o volume total seja de 50 μL. <br...

<ol>
	<li>Canton, B., Labno, A., Endy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+and+standardization+of+synthetic+biological+parts+and+devices.">Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices.</a> Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).</li><li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts.">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J Biol Eng. 2, (2008).</li><li>Knight, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , 1-11 (2003).</li><li>Li, S. Y., Zhao, G. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+Applications+of+CRISPR+Systems:+Harnessing+Nature's+Toolbox+for+Genome+Engineering.">Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering.</a> Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bricks+and+blueprints:+methods+and+standards+for+DNA+assembly.">Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).</li><li>Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+synthetic+biology.">A brief history of synthetic biology.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).</li><li>Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology+for+synthetic+chemistry.">Synthetic biology for synthetic chemistry.</a> ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).</li></ol>

Este protocolo descreve um procedimento para o padrão de montagem de DNA C-Brick. O passo mais importante neste protocolo é a linearização do vetor padrão C-Brick; A clivagem incompleta do vetor pode afetar seriamente a taxa de sucesso. Além disso, embora o Cpf1 cliva principalmente as sequências de DNA alvo no padrão de clivagem &quot;18-23&quot;, também foi detectada uma clivagem incorreta perto das duas bases 4 , o que pode causar um pequeno número de mutações após a montagem do D...

A padronização de partes biológicas do DNA é importante para o desenvolvimento da biologia sintética 1 . O desenvolvimento de um procedimento de montagem de DNA pode substituir projetos experimentais ad hoc e remover muitos dos resultados inesperados que ocorrem durante a montagem de componentes genéticos em sistemas maiores. O padrão BioBrick (BBF RFC 10) foi um dos primeiros padrões de montagem de DNA propostos. Ele usa a seqüência de prefixo (contendo sites de corte EcoRI e XbaI) e a seqüência de sufixos (contendo sites de corte SpeI e PstI) 2 , 3 . Como XbaI e SpeI têm extremidades coesivas complementares, as partes de DNA BioBrick que são cortadas com XbaI e SpeI podem ser unidas, gerando um novo BioBrick para uma montagem iterativa adicional. Alguns defeitos foram identificados com o uso do padrão BioBrick 4 . Por exemplo, produz uma cicatriz de 8 pbEntre as partes de DNA, o que não permite a construção de proteínas in-fusion. Além disso, os quatro tipos acima mencionados de sites de restrição de 6 pb devem ser removidos das partes de DNA, o que é muito inconveniente. O padrão BglBrick foi estabelecido para resolver o primeiro problema 5 . Ele cria uma cicatriz &quot;GGATCT&quot; de 6 pb, produzindo Gly-Ser e permitindo a fusão de múltiplas proteínas ou domínios protéicos. IBrick foi desenvolvido para lidar com o segundo problema 6 . Ele usa endonucleases homing (HEs) que reconhecem longas seqüências de DNA. Como os sites de reconhecimento HE raramente existem em seqüências de DNA naturais, o padrão iBrick pode ser usado para a construção direta de peças iBrick sem modificar suas seqüências de DNA. No entanto, o padrão iBrick deixa uma cicatriz de 21 pb entre as partes do DNA, o que pode ser o motivo da sua impopularidade. Nos últimos anos, as repetições palindrômicas curtas regularmente intercaladas agrupadas (CRISPR) foi desenvolvido rapidamente 7 , 8 . Entre as proteínas associadas a CRISPR (Cas), a endonuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes é amplamente utilizada. Ele apresenta principalmente interrupções de DNA de cadeia dupla (DSBs) com extremidades sem corte 9 . Em 2015, Zhang e colaboradores caracterizaram o Cpf1 (CRISPR da Prevotella e Francisella 1) pela primeira vez. Ele pertence ao sistema CRISPR-Cas da classe 2 do tipo V e é uma endonuclease 10 CRISRP RNA (crRNA). Ao contrário de Cas9, o Cpf1 apresenta um DSB com uma subida de 5 ou 5 nt 5 &#39;10. Com base nessa característica, Cpf1 foi usado para desenvolver um padrão de montagem de DNA, C-Brick 4 . Em um vetor padrão C-Brick, quatro locais alvo Cpf1 de T1 / T2 prefixados e T3 / T4 sufixos flanqueiam as partes biológicas; Isso é semelhante ao padrão BioBrick. Como a divisão dos sites T2 e T3 pRoduces extremidades adesivas complementares, é possível realizar a montagem iterativa de partes de DNA ao gerar uma cicatriz &quot;GGATCC&quot; entre as partes. Notavelmente, o padrão C-Brick tem duas vantagens principais: reconhecendo longas sequências alvo e deixando cicatrizes curtas. A cicatriz de 6 pb &quot;GGATCC&quot; gerada por C-Brick codifica Gly-Ser, que permite a construção de proteínas de fusão. Além disso, o padrão C-Brick também é parcialmente compatível com os padrões BglBrick e BioBrick.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="828">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Comercial Oligonucleotide</td>
			<td style="width:160px;">Sangon Biotech</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x Taq PCR Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Transgen</td>
			<td style="width:161px;">#J40928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Ultra Pure Distilled Water</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">5x RNA Transcription Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">K0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">#EP0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">NTP mixture</td>
			<td style="width:160px;">Sangon</td>
			<td style="width:161px;">#ND0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">RRI(Recombinant RNase Inhibitor)</td>
			<td style="width:160px;">Takara</td>
			<td style="width:161px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:160px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:161px;">R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">UV-Vis Spectrometer</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">Nano-Drop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">2x Phanta Max Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Vazyme</td>
			<td style="width:161px;">PB505</td>
			<td>PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">dNTPs</td>
			<td style="width:160px;">Transgen</td>
			<td style="width:161px;">AD101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:316px;">Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:160px;">Vazyme</td>
			<td style="width:161px;">P505-d1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Ezmax for One-step Cloning</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">24303-1</td>
			<td>seamless assembly kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">5x Buffer for Ezmax One-step Cloning</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">BamHI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">BamHI-HF</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R3136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">BglII&#160;</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R0144L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">XbaI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R0145L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">SpeI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R3133L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x Buffer 3</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#B7003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x T4 DNA ligase Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">DpnI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R01762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">SV Gel and PCR clean-up system</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td style="width:161px;">A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Plasmid Mini Kit I</td>
			<td style="width:160px;">Omega</td>
			<td style="width:161px;">D6943-02</td>
			<td>plasmid preparation kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">thermosensitive alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">#EF0651</td>
			<td>FastAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x Cpf1 buffer</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Cpf1</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32105</td>
			<td>FnCpf1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">thermocycler</td>
			<td style="width:160px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">veriti 96 well</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">C-Brick standard vector</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">98101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">E. coli [DH10B]</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">18297010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Luria-Bertani media (tryptone)</td>
			<td style="width:160px;">Oxoid</td>
			<td style="width:161px;">LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Luria-Bertani media (yeast extract)</td>
			<td style="width:160px;">Oxoid</td>
			<td style="width:161px;">LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Luria-Bertani media (NaCl)</td>
			<td style="width:160px;">Sangon Biotech</td>
			<td style="width:161px;">B126BA0007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for c-brick dna standard assembly using cpf1

A proteína Cpf1 associada ao CRISPR cliva o DNA de cadeia dupla sob a orientação do ARN CRISPR (crRNA), gerando extremidades pegajosas. Por causa desta característica, o Cpf1 tem sido usado para o estabelecimento de um padrão de montagem de DNA chamado C-Brick, que tem a vantagem de longos sites de reconhecimento e cicatrizes curtas. Em um vetor C-Brick padrão, existem quatro sites de reconhecimento Cpf1 - o prefixo (sites T1 e T2) e o sufixo (sites T3 e T4) - partes biológicas de DNA flanqueando. A clivagem dos locais T2 e T3 produz extremidades adesivas complementares, que permitem a montagem de partes de DNA com sites T2 e T3. Enquanto isso, uma pequena cicatriz &quot;GGATCC&quot; é gerada entre partes após a montagem. À medida que o plasmídeo recém-formado contém novamente os quatro locais de clivagem Cpf1, o método permite a montagem iterativa de partes de DNA, que é semelhante à dos padrões BioBrick e BglBrick. Um procedimento descrevendo o uso do padrão C-Brick para montar peças de DNAÉ descrito aqui. O padrão C-Brick pode ser amplamente utilizado por cientistas, estudantes de graduação e graduação e até amadores.

<html> Este protocolo demonstrou a montagem de três cassetes de cromoproteína (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) e amilGFP (BBa_K592010)). Primeiro, as sequências de codificação dos três genes e terminadores acima mencionados foram clonados individualmente em um vetor padrão C-Brick. Pequenas partes de DNA, promotor e terminador, foram introduzidas no vetor C-Brick através de amplificação por PCR usando primers contendo as partes de DNA curtas no terminal 5 &#39;. Segu...

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Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

A proteína Cpf1 associada ao CRISPR pode ser guiada por um ARN CRISPR especialmente concebido (crRAR) para escindir o DNA de cadeia dupla nos locais desejados, gerando extremidades pegajosas. Com base nessa característica, foi estabelecido um padrão de montagem de DNA (C-Brick), e um protocolo que detalha seu uso é descrito aqui.

Protocolos para Montagem Padrão de DNA C-Brick Usando Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Research

JoVE Journal

Genetics

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Sequenciamento de captura de DNA de ligação de metilo em tecidos de pacientes

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Genética

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Estudo da Expressão de Genes Reguladores do Ciclo Celular por dois Protocolos Complementares de Sincronização Celular

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