Name: integration of miniaturized solid phase extraction and lc-ms/ms detection of 3-nitrotyrosine in human urine for clinical applications
Uploaded: 2017-07-14T12:30:00
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Die Autoren würden Scott Howard und Abigail Marinack für die allgemeine Unterstützung und Koordination dieser Arbeit anerkennen.

Alle Studien mit menschlichen Urinproben wurden unter Einhaltung des von Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB) genehmigten Verfahrens durchgeführt. 1. Urinprobenentnahme und Creatinin (Cr) Bestimmung <ol><li> Sammle 5 ml des nächsten Morgens Urinproben nach ca. 10 h über Nacht in einem 5 mL Transportrohr A mit 250 μl 3 N HCl als Konservierungsmittel und bei -20 ° C bis zur Verwendung aufbewahren. </li><li> Tau und Wirbel 5 mL Transport Urin Eine Röhre und zentrifu...

<ol>
	<li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease.">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).</li><li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease.">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).</li><li>Baraldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Nitrotyrosine,+a+marker+of+nitrosative+stress,+is+increased+in+breath+condensate+of+allergic+asthmatic+children.">3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children.</a> Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).</li><li>Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+nitration+in+neurodegeneration:+Cause,+effect,+or+association?.">Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association?.</a> J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).</li><li>Butterfield, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+3-nitrotyrosine+in+brain+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment:+implications+for+the+role+of+nitration+in+the+progression+of+Alzheimer's+disease.">Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease.</a> Brain Res. 1148, 243-248 (2007).</li><li>Hui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+robust+LC-MS/MS+method+for+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+from+patients+receiving+on-pump+CABG+surgery.">A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery.</a> Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+modified+tyrosines+in+healthy+and+diabetic+human+urine+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).</li><li>Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+approaches+to+the+analysis+of+3-nitrotyrosine.">A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine.</a> Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).</li><li>Ryberg, H., Caidahl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+and+mass+spectrometric+methods+for+quantitative+determination+of+3-nitrotyrosine+in+biological+samples+and+their+application+to+human+samples.">Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples.</a> J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).</li><li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+3-nitrotyrosine+quantification+in+biological+samples:+the+unique+role+of+tandem+mass+spectrometry.">Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry.</a> Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).</li><li>Tsikas, D., Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+3-nitrotyrosine:+strategies,+controversies,+and+our+current+perspective.">Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective.</a> Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).</li><li>Iwasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence+reagents+for+simultaneous+determination+of+hydroxylated+phenylalanine+and+nitrated+tyrosine+by+high-performance+liquid+chromatography+with+fluorescence+detection.">Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.</a> Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).</li><li>Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+performance+liquid+chromatography-electrochemical+array+method+for+the+measurement+of+oxidative/nitrative+changes+in+human+urine.">A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine.</a> J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).</li><li>Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole, ., Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+the+synthesis+of+a+water+compatible+molecularly+imprinted+polymer+as+artificial+receptor+for+detection+of+3-nitro-L-tyrosine+in+neurological+diseases.">Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases.</a> Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).</li><li>Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic-tandem+mass+spectrometric+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+at+the+basal+state.">Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state.</a> Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).</li><li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake.">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).</li><li>Marvin, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+o,o'-dityrosine,+o-nitrotyrosine,+and+o-tyrosine+in+cat+urine+samples+by+LC/electrospray+ionization-MS/MS+using+isotope+dilution.">Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution.</a> Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).</li><li>Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+tyrosine,+phenylalanine+and+deoxyguanosine+oxidation+products+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+as+non-invasive+biomarkers+for+oxidative+damage.">Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage.</a> J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).</li><li>Chen, H. J. C., Chiu, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+quantification+of+3-nitrotyrosine+and+3-bromotyrosine+in+human+urine+by+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).</li><li>Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitters+excreted+in+the+urine+as+biomarkers+of+nervous+system+activity:+validity+and+clinical+applicability.">Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).</li><li>Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+specific+and+sensitive+LC-MS/MS+method+for+quantification+of+urinary+catecholamines+and+application+in+biological+variation+studies.">Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-analytical+and+analytical+validations+and+clinical+applications+of+a+miniaturized,+simple+and+cost-effective+solid+phase+extraction+combined+with+LC-MS/MS+for+the+simultaneous+determination+of+catecholamines+and+metanephrines+in+spot+urine+samples.">Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples.</a> Talanta. 159, 238-247 (2016).</li><li>Chao, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+3-nitrotyrosine+and+3-nitro-4-hydroxyphenylacetic+acid+in+human+urine+by+online+SPE+LC-MS/MS+and+their+association+with+oxidative+and+methylated+DNA+lesions.">Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions.</a> Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).</li><li>Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+detection+of+nitrotyrosine+in+biological+fluids+development+of+a+clinically+translatable+biomarker.">Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker.</a> Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+96-well+&#181;Elution+solid-phase+extraction+combined+with+UFLC-MS/MS:+a+significantly+improved+approach+for+determination+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+urine.">Tailored 96-well &#181;Elution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).</li><li>. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7 Available from: <a target="_blank" href="https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html">https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html</a> (2011)</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mixed-mode+solid+phase+extraction+coupled+with+LC-MS/MS+for+the+re-evaluation+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+as+an+oxidative+stress+biomarker.">A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker.</a> Talanta. 140, 45-51 (2015).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+approach+for+the+ultra-sensitive+determination+of+catecholamines+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+assess+neural-immune+communication.">An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication.</a> J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).</li></ol>

Wesentliche Schwankungen der bisher in der Literatur berichteten Konzentrationen für das endogene freie 3-NT in menschlichen Urinproben zeigen methodische Probleme, die mit den verfügbaren Assays 8 , 9 , 10 , 11 verbunden sind . Eine genaue Bestimmung des niedrigen Basalniveaus von 3-NT im menschlichen Urin bleibt eine anspruchsvolle Aufgabe, die besondere Vorkehrungen für die Probenvorbere...

Die Auswirkungen von oxidativem Stress auf die klinische Präsentation wurden in den letzten Jahren in den Vordergrund gerückt 1 . Einer der untersuchten Biomarker ist 3-Nitrotyrosin (3-NT), ein endstabiles Produkt, das gebildet wird, wenn reaktive Stickstoffspezies (RNS) mit Tyrosin, einem Catecholamin-Neurotransmitter-Vorläufer, zusammenwirken. Während 3-NT klinischen Wert als Biomarker für RNS in vivo haben kann, können die wesentlichen Veränderungen der Eigenschaften und Funktionen von Tyrosin die entsprechenden Proteine ​​und zellulären Funktionen 1 , 2 nachteilig beeinflussen. Emerging Research hat vorgeschlagen, dass 3-NT eine wichtige Rolle bei entzündlichen Zuständen spielen kann 3 , neurodegenerative Erkrankungen 4 , 5 , Herz-Kreislauf-Erkrankungen 6 und Diabetes 7 sowie Zustände im Zusammenhang mit oxidativem Stress. Doch diese obseRvations basiert auf Ergebnissen aus Methoden, denen keine Sensitivität und / oder Selektivität fehlt 8 , 9 , 10 , 11 . Die enormen 3-NT-Konzentrationsbereiche für die bisher in der Literatur berichteten biologischen Proben zeigen, dass mit diesen Assays ernsthafte analytische Probleme verbunden sind und technische Verbesserungen erforderlich sind, um die Niveaus von 3-NT genau zu quantifizieren und ihre Rolle in der Pathologie dieser Bedingungen zu überprüfen . Die Quantifizierung von freiem 3-NT in biologischen Matrizen stellt eine besondere Herausforderung für Mensch und Instrument 8 , 9 , 10 , 11 dar . Erstens verlangt der Spurengrad des endogenen 3-NT eine hochempfindliche Detektion; Zweitens die Existenz zahlreicher strukturell ähnlicher Analoga, insbesondere Tyrosin, die inGroßer Überschuss erfordert einen hohen Grad an Selektivität; Drittens erfordert die artefaktuelle Bildung von 3-NT durch Tyrosin-Nitrierung mit ubiquitärem Nitrat und Nitrit eine besondere Berücksichtigung während der Probenvorbereitung, um eine falsche Überschätzung von 3-NT zu vermeiden. Unter einer Vielzahl von Methoden, die zur Messung von 3-NT eingesetzt wurden, wurde MS / MS aufgrund seiner überlegenen Empfindlichkeit und Selektivität 11 , 12 , 13 , 14 als Goldstandardmethode angesehen. Gaschromatographie (GC) gekoppelte MS / MS bietet die beste Empfindlichkeit, jedoch sind die unentbehrlichen Probenderivatisierungsschritte zu langwierig und zeitaufwendig, um für den klinischen Nutzen 15 , 16 effizient zu sein. LC-MS / MS erfordert keine komplexe Musterderivatisierung und ist damit vielversprechender. Dennoch gibt es mehrere Hindernisse zu überwinden wie die seDie in der Literatur berichteten LC-MS / MS-Methoden müssen sich für die Messung von niedrigen 3-NT 7 , 17 , 18 verbessern und die relativ lange Durchlaufzeit für die Hochdurchsatzanwendungen 12 , 13 , 17 , 19 verkürzen . Darüber hinaus spielt bei der Betrachtung klinischer Anwendungen die verwendete biologische Matrix eine bedeutende Rolle. Es sollte einfach und kostengünstig zu erhalten und nicht-invasiv, wenn möglich 20 , 21 , 22 . Plasma, die traditionell verwendete Probe in der Literatur, ist keine klinisch wünschenswerte Matrix, so dass eine Methodik, die Urin verwendet, die nicht-invasiv und kostengünstig ist, gesucht wurde. Mehrere Versuche zu entwickeln relUnd spezielle LC-MS / MS-Methoden wurden mit Urin 9 , 10 , 11 gemacht . Allerdings haben sie alle nicht selektiv, zuverlässig oder effizient genug für die klinische Anwendung. Die Effektivität der vorherrschenden SPE mit herkömmlicher Umkehrphasenpatrone (C18-Typ) als Probenreinigung für die 3-NT-Analyse wurde in Frage gestellt und eine sequentielle SPE von starkem Kationenaustausch (SCX) und umgekehrter Phase C18-OH wurde vorgeschlagen 6 , 7 , 19 Eine kürzlich entwickelte LC-MS / MS-Methode verwendete ein mehrstufiges Reinigungsverfahren von manueller C18 SPE, präparative Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Online-SPE zur Analyse von 3-NT 23 . Obwohl diese Methode für klinische Zwecke empfindlich genug war, mit einem LLOQ von 0,041 nM, war der Cleanup-Prozess intensiv und langwierig und requiRote 3 ml Urin, die ihre Durchführbarkeit für Hochdurchsatz begrenzt. Ein molekular geprägtes Polymer wurde als SPE-Sorptionsmittel verwendet, um die Effizienz des Reinigungsverfahrens 14 zu verbessern, aber das resultierende LLOQ (0,7 &amp; mgr; g / ml) war für klinische Proben nicht niedrig genug. Eine andere Methode erforderte zweidimensionale (2D) LC-MS / MS- und Immunoaffinitätschromatographie zur Probenreinigung, um eine Nachweisgrenze (LOD) von 0,022 nM 24 zu erreichen . Während alle diese Methoden Fortschritte bei der Bewertung von 3-NT gemacht haben, hat keiner die Empfindlichkeit, Zuverlässigkeit und Effizienz für klinische Anwendungen erreicht. Um die Pathologie der freien 3-NT und seine Rolle als Biomarker für oxidativen Stress im klinischen Umfeld zu untersuchen, haben wir eine Methode entwickelt , die einfache, effiziente, genaue und präzise ist, so dass für Hochdurchsatz - klinische Anwendungen 25. Ein miniaturisierter Mischmodus Kation exc(MCX) 96-well Extraktion Mikroplatte wurde implementiert, um eine einfache und effektive Probenreinigung und Anreicherung von 3-NT in einer einzigen Extraktion zu erreichen, die die Nachteile bei den bestehenden Methoden, die eine Derivatisierung, Verdampfung und 2D-LC erfordern, umgehen. Die Flüssigkeitschromatographie mit 0,01% HCOOH als Additiv in der mobilen Phase lieferte eine verbesserte Signalantwort mit einer schnellen Zykluszeit. Die Selektivität wurde durch die Anwendung einer milden NH 4 OAc-Elutionslösung für die selektive Elution von 3-NT und die Verwendung des MRM-Übergangs für sowohl 3-NT als auch den internen Standard (IS) weiter verbessert. Der Matrixeffekt wurde durch die Verwendung einer reduzierten Menge eines bevorzugten 13 C-markierten Isotopen IS zur Quantifizierung kompensiert. Mit dem Aufkommen dieser Methodik werden Forscher und Kliniker in der Lage sein, die Rolle von 3-NT in klinischen Zuständen zu überprüfen und die Auswirkungen von oxidativem Stress weiter zu erforschen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="912">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">3-Nitro-L-tyrosine</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">N7389-5g</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">3-Nitro-L-tyrosine-13C9</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>652296-5.0mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mass Spec Gold Urine</td>
			<td>Golden West Biologicals</td>
			<td>MSG 5000-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oasis MCX 96-well &#181;Elution plate</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>186001830BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2mL 96 well collection plate</td>
			<td style="width:161px;">Phenomenex&#160;&#160;</td>
			<td style="width:115px;">AH0-7194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 positive processor</td>
			<td style="width:161px;">Waters&#160;</td>
			<td style="width:115px;">186005521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol&#160;&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">14262-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS Ultra CHROMASOLV water</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">14263-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid for mass spectrometry</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td>94318-50ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">338818-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra PFP propyl columns</td>
			<td style="width:161px;">Restek</td>
			<td style="width:115px;">9179362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5500 Triple quad</td>
			<td style="width:161px;">AB Sciex&#160;</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Contact manufacture for more detail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UFLC-XR</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu&#160;</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Contact manufacture for more detail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Integra 400 Plus&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Urinary Creatinine Jaff&#233; Gen 2 method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LCMS certified 12 x 32mm screw neck vial</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>600000751CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vial</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>186000384C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL transport tube</td>
			<td style="width:161px;">Phenix</td>
			<td>TT-3205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">50 mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:161px;">Crystalgen&#160;</td>
			<td style="width:115px;">23-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">15 mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:161px;">Crystalgen&#160;</td>
			<td style="width:115px;">23-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eLine electronic pipette</td>
			<td style="width:161px;">Sartorius</td>
			<td style="width:115px;">730391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:115px;">A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OHAUS balance&#160;&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Kennedy Scales, inc.</td>
			<td style="width:115px;">735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex mixer&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Bernstead Thermolyne</td>
			<td style="width:115px;">M16715</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integration of miniaturized solid phase extraction and lc-ms/ms detection of 3-nitrotyrosine in human urine for clinical applications

Freies 3-Nitrotyrosin (3-NT) wurde weitgehend als möglicher Biomarker für oxidativen Stress eingesetzt. Erhöhte Niveaus von 3-NT wurden in einer Vielzahl von pathologischen Bedingungen berichtet. Allerdings fehlt es den vorhandenen Methoden an der ausreichenden Empfindlichkeit und / oder Spezifität, die notwendig sind, um das niedrige endogene Niveau von 3-NT zuverlässig zu messen und für klinische Anwendungen zu schwerfällig zu sein. Daher ist eine analytische Verbesserung dringend erforderlich, um die Niveaus von 3-NT genau zu quantifizieren und die Rolle von 3-NT in pathologischen Zuständen zu überprüfen. Dieses Protokoll stellt die Entwicklung einer neuartigen Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS / MS) -Erkennung in Kombination mit einer miniaturisierten Festphasenextraktion (SPE) für die schnelle und genaue Messung von 3-NT im menschlichen Urin als nicht-invasiven Biomarker dar Für oxidativen Stress SPE mit einer 96-Well-Platte vereinfachte den Prozess durch die Kombination von Probenreinigung und Analytanreicherung ohne mühsame Derivatisierungs- und Verdampfungsschritte deutlich, Verringerung des Lösemittelverbrauchs, Abfallentsorgung, Verunreinigungsgefahr und Gesamtverarbeitungszeit. Die Verwendung von 25 mM Ammoniumacetat (NH 4 OAc) bei pH 9 als SPE-Elutionslösung verbesserte die Selektivität wesentlich. Die Massenspektrometrie-Signalantwort wurde durch die Einstellung der MRM-Übergänge (MRM) verbessert. Die Verwendung von 0,01% HCOOH als Additiv auf einer Pentafluorphenyl (PFP) -Säule (150 mm x 2,1 mm, 3 μm) verbesserte die Signalantwort weiter 2,5-fach und verkürzte die Gesamtlaufzeit auf 7 min. Es wurde eine untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) von 10 pg / ml (0,044 nM) erreicht, was eine signifikante Empfindlichkeitsverbesserung gegenüber den angegebenen Assays darstellt. Diese vereinfachte, schnelle, selektive und empfindliche Methode erlaubt es, zwei Platten von Urinproben (n = 192) in einer 24-Stunden-Zeitspanne zu verarbeiten. In Anbetracht der deutlich verbesserten analytischen Leistungsfähigkeit und der nicht-invasiven und kostengünstigen Urinprobenentnahme ist der vorgeschlagene Assay für präklinische und klinische Zwecke von VorteilStudien.

Fig. 1 veranschaulicht, daß 3-NT vollständig chromatographisch von anderen strukturell ähnlichen Tyrosin-Analoga unter der optimierten LC-Bedingung getrennt ist, was die Co-Elutions-Interferenzen aufgrund dieser stark übermäßigen Verbindungen eliminiert und folglich den Grad der Assay-Selektivität erhöht. Darüber hinaus ermöglicht die Gradientenelution mit 0,01% HCOOH als Additiv in MA und Methanol bei einer Durchflussrate von 0,45 mL / min eine sc...

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Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

Ein selektives und empfindliches Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrieverfahren (LC-MS / MS), gekoppelt mit einer effizienten Festphasenextraktion auf einer gemischten Kationenaustausch- (MCX) 96-Well-Mikroplatte, wurde für die Messung von freiem 3-Nitrotyrosin ( 3-NT) im menschlichen Urin mit hohem Durchsatz, der für klinische Anwendungen geeignet ist.

Integration von miniaturisierter Festphasenextraktion und LC-MS / MS-Nachweis von 3-Nitrotyrosin im menschlichen Urin für klinische Anwendungen

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

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Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Herstellung von hydrophoben Metall-organische Gerüste über Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition von Perfluoralkanen für die Beseitigung von Ammoniak

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

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Activating Molecules, Ions, and Solid Particles with Acoustic Cavitation

Aktivieren Moleküle, Ionen und Feststoffpartikeln mit Acoustic Cavitation

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic ...

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Synthesemethoden für Asymmetric Ferrocen abgeleitete Bio-Konjugat-Systemen über Festphasen-Resin-basierte Methodik

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Auf dem Weg Routine Kristallstrukturbestimmung von Korrosionsprodukten auf Heritage Kunstobjekte

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Die Messung der Partikelgrößenverteilung in trüber Lösungen durch Dynamic Light Scattering Mikroskopie

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Protokoll für die Festphasensynthese von Oligomeren der RNA mit einem 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophenylmethyl-Modifikation und Charakterisierung über Kreisdichroismus

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

Eine bequeme Methode für die Extraktion und Analyse mit Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie Katecholamin Neurotransmitter und deren Metabolite

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Surface Properties of Synthesized Nanoporous Carbon and Silica Matrices

Oberflächeneigenschaften von synthetisierten nanoporöse Carbon und Silica-Matrizen

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) ...

Solid-phase Synthesis of [4.4] Spirocyclic Oximes

Festphasen-Synthese von [4,4] Spirocyclic Oximes

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of ...

Development and Validation of Chromium Getters for Solid Oxide Fuel Cell Power Systems

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Degradation of cathode in solid oxide fuel cells (SOFC) remains a major concern for the long-term performance stability and operational reliability. The ...