Name: integration of miniaturized solid phase extraction and lc-ms/ms detection of 3-nitrotyrosine in human urine for clinical applications
Uploaded: 2017-07-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications at JoVE.com

המחברים היו מודים סקוט הווארד אביגיל Marinack לתמיכה כללית ותיאום של עבודה זו.

כל המחקרים שעסקו בדגימות שתן של בני אדם נערכו תוך שמירה על ההליך שאושר על ידי מועצת המנהלים של המוסד הרפואי (Pharmasan / Neuroscience). 1. שתן אוסף דוגמאות וקריאטינין (Cr) קביעת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף 5 מ&quot;ל של ד...

<ol>
	<li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease.">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).</li><li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease.">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).</li><li>Baraldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Nitrotyrosine,+a+marker+of+nitrosative+stress,+is+increased+in+breath+condensate+of+allergic+asthmatic+children.">3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children.</a> Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).</li><li>Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+nitration+in+neurodegeneration:+Cause,+effect,+or+association?.">Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association?.</a> J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).</li><li>Butterfield, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+3-nitrotyrosine+in+brain+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment:+implications+for+the+role+of+nitration+in+the+progression+of+Alzheimer's+disease.">Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease.</a> Brain Res. 1148, 243-248 (2007).</li><li>Hui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+robust+LC-MS/MS+method+for+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+from+patients+receiving+on-pump+CABG+surgery.">A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery.</a> Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+modified+tyrosines+in+healthy+and+diabetic+human+urine+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).</li><li>Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+approaches+to+the+analysis+of+3-nitrotyrosine.">A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine.</a> Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).</li><li>Ryberg, H., Caidahl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+and+mass+spectrometric+methods+for+quantitative+determination+of+3-nitrotyrosine+in+biological+samples+and+their+application+to+human+samples.">Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples.</a> J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).</li><li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+3-nitrotyrosine+quantification+in+biological+samples:+the+unique+role+of+tandem+mass+spectrometry.">Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry.</a> Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).</li><li>Tsikas, D., Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+3-nitrotyrosine:+strategies,+controversies,+and+our+current+perspective.">Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective.</a> Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).</li><li>Iwasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence+reagents+for+simultaneous+determination+of+hydroxylated+phenylalanine+and+nitrated+tyrosine+by+high-performance+liquid+chromatography+with+fluorescence+detection.">Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.</a> Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).</li><li>Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+performance+liquid+chromatography-electrochemical+array+method+for+the+measurement+of+oxidative/nitrative+changes+in+human+urine.">A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine.</a> J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).</li><li>Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole, ., Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+the+synthesis+of+a+water+compatible+molecularly+imprinted+polymer+as+artificial+receptor+for+detection+of+3-nitro-L-tyrosine+in+neurological+diseases.">Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases.</a> Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).</li><li>Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic-tandem+mass+spectrometric+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+at+the+basal+state.">Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state.</a> Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).</li><li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake.">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).</li><li>Marvin, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+o,o'-dityrosine,+o-nitrotyrosine,+and+o-tyrosine+in+cat+urine+samples+by+LC/electrospray+ionization-MS/MS+using+isotope+dilution.">Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution.</a> Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).</li><li>Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+tyrosine,+phenylalanine+and+deoxyguanosine+oxidation+products+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+as+non-invasive+biomarkers+for+oxidative+damage.">Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage.</a> J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).</li><li>Chen, H. J. C., Chiu, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+quantification+of+3-nitrotyrosine+and+3-bromotyrosine+in+human+urine+by+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).</li><li>Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitters+excreted+in+the+urine+as+biomarkers+of+nervous+system+activity:+validity+and+clinical+applicability.">Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).</li><li>Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+specific+and+sensitive+LC-MS/MS+method+for+quantification+of+urinary+catecholamines+and+application+in+biological+variation+studies.">Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-analytical+and+analytical+validations+and+clinical+applications+of+a+miniaturized,+simple+and+cost-effective+solid+phase+extraction+combined+with+LC-MS/MS+for+the+simultaneous+determination+of+catecholamines+and+metanephrines+in+spot+urine+samples.">Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples.</a> Talanta. 159, 238-247 (2016).</li><li>Chao, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+3-nitrotyrosine+and+3-nitro-4-hydroxyphenylacetic+acid+in+human+urine+by+online+SPE+LC-MS/MS+and+their+association+with+oxidative+and+methylated+DNA+lesions.">Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions.</a> Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).</li><li>Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+detection+of+nitrotyrosine+in+biological+fluids+development+of+a+clinically+translatable+biomarker.">Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker.</a> Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+96-well+&#181;Elution+solid-phase+extraction+combined+with+UFLC-MS/MS:+a+significantly+improved+approach+for+determination+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+urine.">Tailored 96-well &#181;Elution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).</li><li>. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7 Available from: <a target="_blank" href="https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html">https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html</a> (2011)</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mixed-mode+solid+phase+extraction+coupled+with+LC-MS/MS+for+the+re-evaluation+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+as+an+oxidative+stress+biomarker.">A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker.</a> Talanta. 140, 45-51 (2015).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+approach+for+the+ultra-sensitive+determination+of+catecholamines+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+assess+neural-immune+communication.">An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication.</a> J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).</li></ol>

שינויים משמעותיים בריכוזים שפורסמו בעבר בספרות עבור אנדוגני חינם 3-NT בדגימות שתן האדם לחשוף בעיות מתודולוגיות הקשורות מבחני זמין 8 , 9 , 10 , 11 . קביעה מדויקת של רמה בסיסית נמוכה של 3-NT בשתן אנושי נותרה ...

ההשפעות של לחץ חמצוני על מצגת קלינית כבר דחף בחזית בשנים האחרונות 1 . אחד הביומרקרים הנבדקים הוא 3-nitrotyrosine (3-NT), מוצר יציב סוף נוצר כאשר מינים חנקן תגובתי (RNS) אינטראקציה עם טירוזין, מבשר נוירוטרנסמיטר catecholamine. בעוד 3-NT עשוי להיות ערך קליני כמו ביומרקר עבור RNS in vivo, שינויים משמעותיים של תכונות ותפקודים של טירוזין עלול להשפיע לרעה חלבונים המתאימים פונקציות הסלולר 1 , 2 . מחקר מתפתח הציע כי 3-NT עשוי לשחק תפקיד חשוב בתנאים דלקתיים 3 , הפרעות ניווניות 4 , 5 , מחלות לב וכלי דם 6 ו סוכרת 7 כמו גם תנאים הקשורים מתח חמצוני. עם זאת, אלה obseRvations מבוססים על תוצאות מתודולוגיות חסרות רגישות ו / או סלקטיביות 8 , 9 , 10 , 11 . טווחי הריכוז העצומים 3-NT עבור הדגימות הביולוגיות שדווחו בעבר בספרות מגלות כי בעיות אנליטיות חמורות קשורות עם מבחנים אלה ושיפור טכני נדרש כדי לכמת במדויק את רמות 3-NT ולאמת את תפקידו הפתולוגיה של תנאים אלה . הכמות של 3-NT חינם מטריצות ביולוגיות מציג אתגר מיוחד לאדם ולכלי 8 , 9 , 10 , 11 . ראשית, רמת עקבות של אנדוגני 3-NT דורש זיהוי רגיש במיוחד; שנית, את קיומו של מספר רב של אנלוגים דומים מבחינה מבנית, במיוחד טירוזין, אשר קייםעודף עצום, דורש מידה גבוהה של סלקטיביות; שלישית, היווצרות artefactual של 3-NT ידי טיטרציה טירוזין עם חנקתי בכל מקום ניטריט דורש שיקול מיוחד במהלך הכנת המדגם, כדי למנוע overestimation שקר של 3-NT. בין מגוון רחב של מתודולוגיות המשמשות למדידה של 3-NT, MS / MS נחשב לשיטה הסטנדרטית של הזהב, בשל רגישותו הסלקטיבית והבררה שלו 11 , 12 , 13 , 14 . גז כרומטוגרפיה (GC) מצמידים MS / MS מציעה את הרגישות הטובה ביותר, עם זאת, הצעדים derivatization המדגם הכרחי מייגעים מדי זמן רב כדי להיות יעיל עבור כלי קליני 15 , 16 . LC-MS / MS אינו דורש derivatization מדגם מורכב, מה שהופך אותו אופציה מבטיחה יותר. עם זאת, ישנם מספר מכשולים שיש להתגבר עליהםNsitivity של LC-MS / MS שיטות דיווחו בספרות הצרכים כדי לשפר את המדידה של שופע נמוך 3-NT 7 , 17 , 18 ואת זמן התפנית יחסית חייב להיות מקוצר עבור תפוקה גבוהה יישומים 12 , 13 , 17 , 19 . בנוסף, כאשר בוחנים יישומים קליניים, המטריצה ​​הביולוגית המשמשת משחקת תפקיד משמעותי. זה צריך להיות קל וזול להשיג ולא פולשני אם אפשר 20 , 21 , 22 . פלזמה, המדגם המשמש באופן מסורתי בספרות, אינה מטריצה ​​רצויה מבחינה קלינית, ולכן מתודולוגיה המשתמשת בשתן שאינו פולשני וחסכוני. מספר ניסיונות לפתח relIable ספציפיים LC-MS / MS מתודולוגיות נעשו באמצעות שתן 9 , 10 , 11 . עם זאת, כולם נמנעו מלהיות סלקטיביים, אמינים או יעילים מספיק לשימוש קליני. האפקטיביות של ה- SPE השולט באמצעות מחסנית שלב הפוכה המסורתית (C18 סוג) כמו ניקוי מדגם לניתוח 3-NT כבר נחקר ו SPE רציף של חילופי קטיון חזקה (SCX) ואת הפוכה שלב C18-OH הוצע 6 , 7 , 19 . שיטה אחת שפותחה לאחרונה LC-MS / MS השתמשו בתהליך טיהור רב של C18 SPE ידנית, כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC), ו- SPE באינטרנט לניתוח של 3-NT 23 . למרות ששיטה זו הייתה רגישה מספיק למטרות קליניות, עם LLOQ של 0.041 ננומטר, תהליך הניקוי היה אינטנסיבי ומייגע ו requiאדום 3 מ&quot;ל של שתן, הגבלת הכדאיות שלה עבור תפוקה גבוהה. פולימר מוטבע במולקולה הועסק כמרכיב SPEb כדי לשפר את היעילות של תהליך הניקוי 14 , אך LLOQ שהתקבל (0.7 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לא היה נמוך מספיק עבור דגימות קליניות. שיטה נוספת נדרשה דו מימדי LC-MS / MS ו chromatography immunoaffinity עבור ניקוי המדגם על מנת להשיג גבול של גילוי (LOD) של 0.022 nM 24 . בעוד כל השיטות הללו עשו התקדמות בהערכת 3-NT, אף אחד לא השיגו את הרגישות, האמינות, ואת היעילות הדרושים עבור יישומים קליניים. על מנת לחקור את הפתולוגיה של 3-NT חינם ואת תפקידה כסימן ביולוגי של מתח חמצוני בקליני, פיתחנו מתודולוגיה פשוטה, יעילה, מדויקת ומדויקת, המאפשרת יישומים קליניים עתירי תפוקה 25 . מיניאטורה מעורבת מצב קטיון excHange (MCX) 96-microplate החילוץ גם יושמה כדי להשיג ניקוי מדגם פשוט ויעיל והעשרה של 3-NT ב מיצוי אחד עקיפת החסרונות לראות בשיטות הקיימות הדורשים derivatization, אידוי ו- 2D-LC. כרומטוגרפיה נוזלית עם 0.01% HCOOH כתוסף בשלב נייד הציעה תגובת אות משופרת עם זמן מחזור מהיר. הסלקטיביות השתפרה עוד יותר באמצעות יישום של פתרון ALUT מתון NH 4 OAc עבור elution סלקטיבי של 3-NT, ושימוש במעבר MRM הן עבור 3-NT והן בתקן הפנימי (IS). אפקט מטריצה ​​היה פיצוי על ידי שימוש בכמות מופחתת של 13 המועדפת C שכותרתו IS איזוטופי לכימות. עם הופעתה של מתודולוגיה זו, חוקרים וקלינאים יוכלו לאמת את התפקיד של 3-NT בתנאים קליניים נוספת לחקור את ההשפעה של מתח חמצוני.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="912">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">3-Nitro-L-tyrosine</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">N7389-5g</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">3-Nitro-L-tyrosine-13C9</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>652296-5.0mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mass Spec Gold Urine</td>
			<td>Golden West Biologicals</td>
			<td>MSG 5000-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oasis MCX 96-well &#181;Elution plate</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>186001830BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2mL 96 well collection plate</td>
			<td style="width:161px;">Phenomenex&#160;&#160;</td>
			<td style="width:115px;">AH0-7194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 positive processor</td>
			<td style="width:161px;">Waters&#160;</td>
			<td style="width:115px;">186005521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol&#160;&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">14262-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS Ultra CHROMASOLV water</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">14263-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid for mass spectrometry</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td>94318-50ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">338818-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra PFP propyl columns</td>
			<td style="width:161px;">Restek</td>
			<td style="width:115px;">9179362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5500 Triple quad</td>
			<td style="width:161px;">AB Sciex&#160;</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Contact manufacture for more detail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UFLC-XR</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu&#160;</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Contact manufacture for more detail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Integra 400 Plus&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Urinary Creatinine Jaff&#233; Gen 2 method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LCMS certified 12 x 32mm screw neck vial</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>600000751CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vial</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>186000384C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL transport tube</td>
			<td style="width:161px;">Phenix</td>
			<td>TT-3205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">50 mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:161px;">Crystalgen&#160;</td>
			<td style="width:115px;">23-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">15 mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:161px;">Crystalgen&#160;</td>
			<td style="width:115px;">23-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eLine electronic pipette</td>
			<td style="width:161px;">Sartorius</td>
			<td style="width:115px;">730391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:115px;">A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OHAUS balance&#160;&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Kennedy Scales, inc.</td>
			<td style="width:115px;">735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex mixer&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Bernstead Thermolyne</td>
			<td style="width:115px;">M16715</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integration of miniaturized solid phase extraction and lc-ms/ms detection of 3-nitrotyrosine in human urine for clinical applications

חינם 3-nitrotyrosine (3-NT) כבר בשימוש נרחב כמו ביומרקר אפשרי עבור מתח חמצוני. רמות מוגברות של 3-NT דווחו במגוון רחב של מצבים פתולוגיים. עם זאת, שיטות קיימות חסרים את הרגישות ו / או הספציפיות הנדרשת כדי למדוד את רמת אנדוגני נמוך של 3-NT אמין והם מסורבלים מדי עבור יישומים קליניים. לפיכך, שיפור אנליטית יש צורך בדחיפות כדי לכמת במדויק את רמות 3-NT ולאמת את התפקיד של 3-NT בתנאים פתולוגיים. פרוטוקול זה מציג את הפיתוח של כרומטוגרפיה נוירומטית חדשה של ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) בשילוב עם מיצוי שלב מוצק מוצק (SPE) למדידה מהירה ומדויקת של 3-NT בשתן אנושי כמו ביומרקר לא פולשני עבור מתח חמצוני. SPE באמצעות צלחת 96-היטב להפשיט באופן משמעותי את התהליך על ידי שילוב ניקוי המדגם והעשרה אנליטית ללא derivatization מייגע צעדים אידוי, הפחתת צריכת ממס, סילוק פסולת, סיכון של זיהום זמן עיבוד הכולל. העסקת 25 מ&quot;מ אמוניום אצטט (NH 4 OAc) ב pH 9 כמו פתרון elution SPE משופרת באופן משמעותי את הסלקטיביות. תגובת אותות ספקטרומטריית מסה השתפרה באמצעות התאמת מעברי הניטור המרובים (MRM). שימוש של 0.01% HCOOH כתוסף על עמודה pentafluorophenyl (PFP) (150 מ&quot;מ x 2.1 מ&quot;מ, 3 מיקרומטר) שיפור האות בתגובה עוד פי 2.5 וקצר את זמן הריצה הכולל עד 7 דקות. מגבלה נמוכה יותר של quantitation (LLOQ) של 10 pg / mL (0.044 ננומטר) הושגה, המייצג שיפור רגישות משמעותי על מבחני דיווח. שיטה פשוטה, מהירה, סלקטיבית ורגישה זו מאפשרת שתי צלחות של דגימות שתן (n = 192) להיות מעובדות תוך 24 שעות. בהתחשב בביצועים האנליטיים המשופרים במידה ניכרת, ובדגימת שתן לא פולשנית וזולה, המבחן המוצע מועיל לטיפול פרה-קליני וקלינילימודים.

איור 1 ממחיש כי 3-NT מופרד לחלוטין chromatographically אחרים דומים מבנית tyrosine דומה אנלוגים תחת תנאי LC אופטימיזציה, אשר מבטלת את שיתוף eluting הפרעות בשל אלה תרכובות מופרז בהרבה וכתוצאה מכך משפר את מידת הסלקטיביות assay. בנוסף, elution שיפוע עם 0.01% HCOOH כתוס...

Watch this Scientific Journal Video about Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications at JoVE.com

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

כרומטוגרפיה סלקטיבית ורגישה כרומטוגרפית מסודרת (LC-MS / MS) שיטה בשילוב עם מוצק שלב מוצק שלב על מצב מעורבת קטיון (MCX) 96 מיקרופלטה גם פותחה למדידת חינם nitrotyrosine 3 ( 3-NT) בשתן אנושי עם תפוקה גבוהה, אשר מתאים ליישומים קליניים.

אינטגרציה של מיצוי שלב מוצק ממוזער ו LC-MS / MS איתור של 3-Nitrotyrosine בשתן האדם עבור יישומים קליניים

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Chemistry

Human Biology

Osmoregulation and Excretion

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

הכנת מסגרות מתכת אורגנית הידרופובי באמצעות פלזמה משופרת שיקוע הכימי של Perfluoroalkanes להסרת אמוניה

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Activating Molecules, Ions, and Solid Particles with Acoustic Cavitation

הפעלת מולקולות, יונים, וחלקיקים מוצקים עם אקוסטית Cavitation

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic ...

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

מתודולוגיה סינתטית למערכות ביו-המצומד Asymmetric Ferrocene נגזרו באמצעות מתודולוגיה המבוססת על שרף שלב מוצקה

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

השתברות אבקת רנטגן שימור מדע: לקראת קביעת מבנה שיגרתית קריסטל של מוצרי קורוזיה על יצירות אמנות מורשה

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

מדידת הפצת החלקיקים גודל פתרונות דלוחים ידי Dynamic Light פיזור מיקרוסקופי

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Protocol עבור שלב מוצק סינתזה של אוליגומרים של רנ&quot;א המכיל 2 &#39;<em&gt; הו</em&gt; שינוי ואפיון של תיאופנילמתיל באמצעות דיכרואיזם מעגלי

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

שיטה נוחה עבור חילוץ וניתוח עם כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה של נוירוטרנסמיטורים קטכולאמין מטבוליטים שלהם

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Surface Properties of Synthesized Nanoporous Carbon and Silica Matrices

מאפייני משטח של פחמן Nanoporous מסונתז סיליקה מטריצות

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) ...

Solid-phase Synthesis of [4.4] Spirocyclic Oximes

מוצק-שלב הסינתזה של Oximes Spirocyclic [4.4]

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of ...

Development and Validation of Chromium Getters for Solid Oxide Fuel Cell Power Systems

פיתוח ותיקוף של כרום הגטרס עבור מערכות חשמל של תחמוצת הדלק מוצק

Degradation of cathode in solid oxide fuel cells (SOFC) remains a major concern for the long-term performance stability and operational reliability. The ...