Name: integration of miniaturized solid phase extraction and lc-ms/ms detection of 3-nitrotyrosine in human urine for clinical applications
Uploaded: 2017-07-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications at JoVE.com

Авторы признали Скотта Говарда и Абигайль Маринак за общую поддержку и координацию этой работы.

Все исследования с использованием образцов мочи человека проводились в соответствии с процедурой, утвержденной Советом по институциональному обзору Pharmasan / Neuroscience (IRB). 1. Сбор образцов мочи и определение креатинина (Cr) <ol><li> Соберите 5 мл образцов мочи следующего дня пос?...

<ol>
	<li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease.">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).</li><li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease.">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).</li><li>Baraldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Nitrotyrosine,+a+marker+of+nitrosative+stress,+is+increased+in+breath+condensate+of+allergic+asthmatic+children.">3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children.</a> Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).</li><li>Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+nitration+in+neurodegeneration:+Cause,+effect,+or+association?.">Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association?.</a> J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).</li><li>Butterfield, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+3-nitrotyrosine+in+brain+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment:+implications+for+the+role+of+nitration+in+the+progression+of+Alzheimer's+disease.">Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease.</a> Brain Res. 1148, 243-248 (2007).</li><li>Hui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+robust+LC-MS/MS+method+for+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+from+patients+receiving+on-pump+CABG+surgery.">A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery.</a> Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+modified+tyrosines+in+healthy+and+diabetic+human+urine+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).</li><li>Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+approaches+to+the+analysis+of+3-nitrotyrosine.">A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine.</a> Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).</li><li>Ryberg, H., Caidahl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+and+mass+spectrometric+methods+for+quantitative+determination+of+3-nitrotyrosine+in+biological+samples+and+their+application+to+human+samples.">Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples.</a> J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).</li><li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+3-nitrotyrosine+quantification+in+biological+samples:+the+unique+role+of+tandem+mass+spectrometry.">Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry.</a> Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).</li><li>Tsikas, D., Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+3-nitrotyrosine:+strategies,+controversies,+and+our+current+perspective.">Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective.</a> Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).</li><li>Iwasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence+reagents+for+simultaneous+determination+of+hydroxylated+phenylalanine+and+nitrated+tyrosine+by+high-performance+liquid+chromatography+with+fluorescence+detection.">Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.</a> Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).</li><li>Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+performance+liquid+chromatography-electrochemical+array+method+for+the+measurement+of+oxidative/nitrative+changes+in+human+urine.">A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine.</a> J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).</li><li>Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole, ., Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+the+synthesis+of+a+water+compatible+molecularly+imprinted+polymer+as+artificial+receptor+for+detection+of+3-nitro-L-tyrosine+in+neurological+diseases.">Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases.</a> Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).</li><li>Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic-tandem+mass+spectrometric+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+at+the+basal+state.">Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state.</a> Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).</li><li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake.">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).</li><li>Marvin, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+o,o'-dityrosine,+o-nitrotyrosine,+and+o-tyrosine+in+cat+urine+samples+by+LC/electrospray+ionization-MS/MS+using+isotope+dilution.">Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution.</a> Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).</li><li>Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+tyrosine,+phenylalanine+and+deoxyguanosine+oxidation+products+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+as+non-invasive+biomarkers+for+oxidative+damage.">Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage.</a> J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).</li><li>Chen, H. J. C., Chiu, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+quantification+of+3-nitrotyrosine+and+3-bromotyrosine+in+human+urine+by+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).</li><li>Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitters+excreted+in+the+urine+as+biomarkers+of+nervous+system+activity:+validity+and+clinical+applicability.">Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).</li><li>Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+specific+and+sensitive+LC-MS/MS+method+for+quantification+of+urinary+catecholamines+and+application+in+biological+variation+studies.">Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-analytical+and+analytical+validations+and+clinical+applications+of+a+miniaturized,+simple+and+cost-effective+solid+phase+extraction+combined+with+LC-MS/MS+for+the+simultaneous+determination+of+catecholamines+and+metanephrines+in+spot+urine+samples.">Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples.</a> Talanta. 159, 238-247 (2016).</li><li>Chao, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+3-nitrotyrosine+and+3-nitro-4-hydroxyphenylacetic+acid+in+human+urine+by+online+SPE+LC-MS/MS+and+their+association+with+oxidative+and+methylated+DNA+lesions.">Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions.</a> Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).</li><li>Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+detection+of+nitrotyrosine+in+biological+fluids+development+of+a+clinically+translatable+biomarker.">Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker.</a> Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+96-well+&#181;Elution+solid-phase+extraction+combined+with+UFLC-MS/MS:+a+significantly+improved+approach+for+determination+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+urine.">Tailored 96-well &#181;Elution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).</li><li>. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7 Available from: <a target="_blank" href="https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html">https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html</a> (2011)</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mixed-mode+solid+phase+extraction+coupled+with+LC-MS/MS+for+the+re-evaluation+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+as+an+oxidative+stress+biomarker.">A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker.</a> Talanta. 140, 45-51 (2015).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+approach+for+the+ultra-sensitive+determination+of+catecholamines+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+assess+neural-immune+communication.">An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication.</a> J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).</li></ol>

Существенные изменения концентраций, ранее описанные в литературе для эндогенного свободного 3-НТ в образцах мочи человека, выявили методологические проблемы, связанные с доступными анализами 8 , 9 , 10 , 11 . Точное опре...

В последние годы воздействие окислительного стресса на клиническое проявление было выдвинуто на первый план 1 . Один из исследованных биомаркеров представляет собой 3-нитротирозин (3-NT), конечный стабильный продукт, образующийся при взаимодействии реакционноспособных видов азота (RNS) с тирозином, предшественником нейротрансмиттера катехоламина. Хотя 3-NT может иметь клиническое значение в качестве биомаркера для RNS in vivo, существенные изменения свойств и функций тирозина могут неблагоприятно влиять на соответствующие белки и клеточные функции 1 , 2 . Новые исследования показали, что 3-NT может играть важную роль в воспалительных заболеваниях 3 , нейродегенеративных расстройствах 4 , 5 , сердечно-сосудистых заболеваниях 6 и диабете 7, а также в условиях, связанных с окислительным стрессом. Однако эти обманкиОснованные на результатах методологий, не обладающих чувствительностью и / или селективностью 8 , 9 , 10 , 11 . Огромные диапазоны концентраций 3-НТ для биологических образцов, о которых сообщалось ранее в литературе, показывают, что с этими анализами связаны серьезные аналитические проблемы, и требуется техническое усовершенствование для точного количественного определения уровней 3-НТ и проверки его роли в патологии этих условий , Количественное определение свободных 3-NT в биологических матрицах представляет особый вызов человеку и инструменту 8 , 9 , 10 , 11 . Во-первых, уровень следа эндогенного 3-NT требует ультрачувствительного обнаружения; Во-вторых, существование многочисленных структурно подобных аналогов, особенно тирозина, которое присутствует вОгромный избыток, требует высокой степени избирательности; В-третьих, артефактное образование 3-NT тирозиновым нитрованием с вездесущим нитратом и нитритом требует особого рассмотрения при подготовке образца, чтобы избежать ложной переоценки 3-NT. Среди широкого спектра методологий, используемых для измерения 3-NT, MS / MS считается золотым стандартным методом из-за его превосходной чувствительности и селективности 11 , 12 , 13 , 14 . Газовая хроматография (ГХ), связанная с MS / MS, обеспечивает лучшую чувствительность, однако незаменимые этапы дериватизации образцов слишком утомительны и требуют много времени, чтобы быть эффективными для клинической полезности 15 , 16 . LC-MS / MS не требует сложной дериватизации образцов, что делает его более перспективным. Тем не менее, есть несколько препятствий для преодоления, таких какВ литературе необходимо повысить чувствительность методов LC-MS / MS, которые необходимо улучшить для измерения низких концентраций 3-NT 7 , 17 , 18, и относительно длительное время поворота должно быть сокращено для высокопроизводительных приложений 12 , 13 , 17 , 19 , Кроме того, при рассмотрении клинических применений важную роль играет используемая биологическая матрица. Это должно быть легко и недорого для получения и неинвазивного, если это возможно, 20 , 21 , 22 . Плазма, традиционно используемая в литературе, не является клинически желательной матрицей, поэтому была запрошена методология использования неинвазивной и рентабельной мочи. Несколько попыток разработать relМетоды LC-MS / MS были разработаны с использованием мочи 9 , 10 , 11 . Тем не менее, они все еще не были избирательными, надежными или эффективными для клинического использования. Эффективность преобладающего SPE с использованием традиционного картриджа с обращенной фазой (тип C18) в качестве очистки образца для анализа 3-NT была поставлена ​​под сомнение и предложена последовательная SPE сильного катионного обмена (SCX) и обратная фаза C18-OH 6 , 7 , 19 . В недавно разработанном методе LC-MS / MS использовался многоступенчатый процесс очистки ручного C18 SPE, препаративной жидкостной хроматографии высокого давления (HPLC) и онлайн-SPE для анализа 3-NT 23 . Хотя этот метод был достаточно чувствительным для клинических целей, с LLOQ 0,041 нМ, процесс очистки был интенсивным и утомительным и требовалКрасный 3 мл мочи, что ограничивает его возможность высокой пропускной способности. В качестве сорбента SPE использовали молекулярно-импринтированный полимер для повышения эффективности процесса очистки 14 , но полученный LLOQ (0,7 мкг / мл) был недостаточно низким для клинических образцов. Другой метод требовал двумерной (2D) LC-MS / MS и иммуноаффинной хроматографии для очистки образца для достижения предела обнаружения (LOD) 0,022 нМ 24 . Хотя все эти методы сделали успехи в оценке 3-NT, ни один из них не достиг чувствительности, надежности и эффективности, необходимых для клинических применений. Чтобы исследовать патологию свободного 3-NT и его роль биомаркера окислительного стресса в клинических условиях, мы разработали простую, эффективную, точную и точную методологию, позволяющую применять высокопроизводительные клинические применения 25 . Миниатюрный катион смешанного режима(MCX) была выполнена 96-луночная микропланшетная микропланшетная установка для обеспечения простой и эффективной очистки образца и обогащения 3-NT в одной экстракции, минуя недостатки, существующие в существующих методах, которые требуют дериватизации, испарения и 2D-LC. Жидкая хроматография с 0,01% HCOOH в качестве добавки в подвижной фазе обеспечивала повышенный сигнал с быстрым временем цикла. Селективность была дополнительно улучшена за счет применения мягкого раствора элюирования NH 4 OAc для селективного элюирования 3-NT и использования перехода MRM как для 3-NT, так и для внутреннего стандарта (IS). Матричный эффект был компенсирован за счет использования уменьшенного количества предпочтительной 13 С-меченой изотопной ИС для количественной оценки. С появлением этой методологии исследователи и клиницисты смогут проверить роль 3-НТ в клинических условиях и дополнительно изучить влияние окислительного стресса.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="912">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">3-Nitro-L-tyrosine</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">N7389-5g</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">3-Nitro-L-tyrosine-13C9</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>652296-5.0mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mass Spec Gold Urine</td>
			<td>Golden West Biologicals</td>
			<td>MSG 5000-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oasis MCX 96-well &#181;Elution plate</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>186001830BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2mL 96 well collection plate</td>
			<td style="width:161px;">Phenomenex&#160;&#160;</td>
			<td style="width:115px;">AH0-7194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 positive processor</td>
			<td style="width:161px;">Waters&#160;</td>
			<td style="width:115px;">186005521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol&#160;&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">14262-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS Ultra CHROMASOLV water</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">14263-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid for mass spectrometry</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td>94318-50ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">338818-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra PFP propyl columns</td>
			<td style="width:161px;">Restek</td>
			<td style="width:115px;">9179362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5500 Triple quad</td>
			<td style="width:161px;">AB Sciex&#160;</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Contact manufacture for more detail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UFLC-XR</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu&#160;</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Contact manufacture for more detail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Integra 400 Plus&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Urinary Creatinine Jaff&#233; Gen 2 method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LCMS certified 12 x 32mm screw neck vial</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>600000751CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vial</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>186000384C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL transport tube</td>
			<td style="width:161px;">Phenix</td>
			<td>TT-3205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">50 mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:161px;">Crystalgen&#160;</td>
			<td style="width:115px;">23-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">15 mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:161px;">Crystalgen&#160;</td>
			<td style="width:115px;">23-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eLine electronic pipette</td>
			<td style="width:161px;">Sartorius</td>
			<td style="width:115px;">730391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:115px;">A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OHAUS balance&#160;&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Kennedy Scales, inc.</td>
			<td style="width:115px;">735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex mixer&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Bernstead Thermolyne</td>
			<td style="width:115px;">M16715</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integration of miniaturized solid phase extraction and lc-ms/ms detection of 3-nitrotyrosine in human urine for clinical applications

Свободный 3-нитротирозин (3-NT) широко использовался в качестве возможного биомаркера для окислительного стресса. Сообщалось о повышении уровня 3-NT в самых разнообразных патологических состояниях. Однако существующие методы не обладают достаточной чувствительностью и / или специфичностью, необходимой для надежного измерения уровня эндогенного уровня 3-NT и слишком громоздки для клинических применений. Следовательно, срочно необходимо аналитическое улучшение для точного количественного определения уровней 3-NT и проверки роли 3-NT в патологических условиях. Этот протокол представляет собой разработку новой спектроскопии тандемной масс-спектрометрии (LC-MS / MS) в жидкой хроматографии в сочетании с миниатюризированной твердофазной экстракцией (SPE) для быстрого и точного измерения 3-NT в человеческой моче как неинвазивный биомаркер Для окислительного стресса. SPE с использованием 96-луночного планшета заметно упрощает процесс путем объединения очистки образца и обогащения аналита без утомительной дериватизации и стадии испарения, Снижение потребления растворителя, удаление отходов, риск загрязнения и общее время обработки. Применение 25 мМ ацетата аммония (NH 4 OAc) при рН 9 в качестве раствора элюирования SPE существенно повысило селективность. Реакция сигнала масс-спектрометрии была улучшена путем регулирования переходов с множественным контролем реакции (MRM). Использование 0,01% HCOOH в качестве добавки на колонке пентафторфенила (PFP) (150 мм x 2,1 мм, 3 мкм) улучшало реакцию сигнала еще в 2,5 раза и сокращало общее время работы до 7 мин. Был достигнут нижний предел количественного определения (LLOQ) 10 пг / мл (0,044 нМ), что представляет собой значительное улучшение чувствительности по сравнению с указанными анализами. Этот упрощенный, быстрый, выборочный и чувствительный метод позволяет обрабатывать две пластины мочи (n = 192) в течение 24-часового периода времени. Учитывая значительно улучшенные аналитические характеристики и неинвазивный и недорогой выборки мочи, предлагаемый анализ полезен для доклинических и клиническихисследования.

На рисунке 1 показано, что 3-NT полностью хроматографически отделена от других аналогично аналогичных аналогов тирозина при оптимизированном состоянии ЖК, что устраняет сопутствующие помехи из-за этих значительно избыточных соединений и, следовательн...

Watch this Scientific Journal Video about Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications at JoVE.com

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

Для измерения свободного 3-нитротирозина был разработан метод селективной и чувствительной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (LC-MS / MS), связанный с эффективной твердофазной экстракцией на 96-луночном микропланшетном катионообменном (MCX) смешанном режиме (MCX) 3-NT) в моче человека с высокой пропускной способностью, которая подходит для клинических применений.

Интеграция миниатюрной твердофазной экстракции и LC-MS / MS Обнаружение 3-нитротирозина в моче человека для клинических применений

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Chemistry

Human Biology

Osmoregulation and Excretion

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Подготовка гидрофобные Металл-органических структур через плазмостимулированного отложение химического пара перфторалканов для удаления аммиака

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Activating Molecules, Ions, and Solid Particles with Acoustic Cavitation

Активация молекул, ионов, и твердые частицы с акустической кавитации

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic ...

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Синтетическая методология для асимметричных Ферроцен, полученных Bio-сопряженных систем через Solid методологии фазы смолу на основе

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

Рентгеновская дифракция в порошок по сохранению науки: На пути к Обычной кристаллической структуры Определение продуктов коррозии на наследие предметов искусства

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Измерение Распределение частиц по размерам в мутных растворах с помощью динамического рассеяния света микроскопии

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Протокол твердофазного синтеза олигомеров РНК, содержащий 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -тиофенилметильная модификация и характеризация с помощью циркулярного дихроизма

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

Удобный метод для извлечения и анализа с высокого давления жидкостной хроматографии и их метаболитов катехоламинов нейротрансмиттеров

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Surface Properties of Synthesized Nanoporous Carbon and Silica Matrices

Свойств поверхности синтезированных нанопористого углерода и кремния матрицы

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) ...

Solid-phase Synthesis of [4.4] Spirocyclic Oximes

Твердофазный синтез [4.4] Оксимы Spirocyclic

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of ...

Development and Validation of Chromium Getters for Solid Oxide Fuel Cell Power Systems

Разработка и валидация хрома Геттеров для твердых оксидных топливных элементов power Systems

Degradation of cathode in solid oxide fuel cells (SOFC) remains a major concern for the long-term performance stability and operational reliability. The ...