Name: integration of miniaturized solid phase extraction and lc-ms/ms detection of 3-nitrotyrosine in human urine for clinical applications
Uploaded: 2017-07-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications at JoVE.com

Författarna skulle erkänna Scott Howard och Abigail Marinack för allmänt stöd och samordning av detta arbete.

Alla studier som involverade urinprover av mänskliga personer utfördes i enlighet med förfarandet godkänt av Pharmasan / Neuroscience Institutional Review Board (IRB). 1. Urinprovsamling och kreatinin (Cr) bestämning <ol><li> Samla 5 ml av nästa morgon urinprover efter ca. 10 h över natten fastande i ett 5 ml transportrör A innehållande 250 | xl 3 N HCl som konserveringsmedel och förvaras vid -20 ° C tills användning. </li><li> Tina och virvel 5 ml transporturin Ett rör och ce...

<ol>
	<li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease.">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).</li><li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease.">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).</li><li>Baraldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Nitrotyrosine,+a+marker+of+nitrosative+stress,+is+increased+in+breath+condensate+of+allergic+asthmatic+children.">3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children.</a> Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).</li><li>Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+nitration+in+neurodegeneration:+Cause,+effect,+or+association?.">Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association?.</a> J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).</li><li>Butterfield, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+3-nitrotyrosine+in+brain+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment:+implications+for+the+role+of+nitration+in+the+progression+of+Alzheimer's+disease.">Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease.</a> Brain Res. 1148, 243-248 (2007).</li><li>Hui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+robust+LC-MS/MS+method+for+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+from+patients+receiving+on-pump+CABG+surgery.">A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery.</a> Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+modified+tyrosines+in+healthy+and+diabetic+human+urine+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).</li><li>Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+approaches+to+the+analysis+of+3-nitrotyrosine.">A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine.</a> Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).</li><li>Ryberg, H., Caidahl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+and+mass+spectrometric+methods+for+quantitative+determination+of+3-nitrotyrosine+in+biological+samples+and+their+application+to+human+samples.">Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples.</a> J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).</li><li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+3-nitrotyrosine+quantification+in+biological+samples:+the+unique+role+of+tandem+mass+spectrometry.">Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry.</a> Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).</li><li>Tsikas, D., Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+3-nitrotyrosine:+strategies,+controversies,+and+our+current+perspective.">Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective.</a> Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).</li><li>Iwasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence+reagents+for+simultaneous+determination+of+hydroxylated+phenylalanine+and+nitrated+tyrosine+by+high-performance+liquid+chromatography+with+fluorescence+detection.">Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.</a> Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).</li><li>Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+performance+liquid+chromatography-electrochemical+array+method+for+the+measurement+of+oxidative/nitrative+changes+in+human+urine.">A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine.</a> J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).</li><li>Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole, ., Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+the+synthesis+of+a+water+compatible+molecularly+imprinted+polymer+as+artificial+receptor+for+detection+of+3-nitro-L-tyrosine+in+neurological+diseases.">Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases.</a> Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).</li><li>Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic-tandem+mass+spectrometric+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+at+the+basal+state.">Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state.</a> Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).</li><li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake.">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).</li><li>Marvin, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+o,o'-dityrosine,+o-nitrotyrosine,+and+o-tyrosine+in+cat+urine+samples+by+LC/electrospray+ionization-MS/MS+using+isotope+dilution.">Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution.</a> Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).</li><li>Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+tyrosine,+phenylalanine+and+deoxyguanosine+oxidation+products+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+as+non-invasive+biomarkers+for+oxidative+damage.">Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage.</a> J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).</li><li>Chen, H. J. C., Chiu, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+quantification+of+3-nitrotyrosine+and+3-bromotyrosine+in+human+urine+by+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).</li><li>Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitters+excreted+in+the+urine+as+biomarkers+of+nervous+system+activity:+validity+and+clinical+applicability.">Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).</li><li>Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+specific+and+sensitive+LC-MS/MS+method+for+quantification+of+urinary+catecholamines+and+application+in+biological+variation+studies.">Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-analytical+and+analytical+validations+and+clinical+applications+of+a+miniaturized,+simple+and+cost-effective+solid+phase+extraction+combined+with+LC-MS/MS+for+the+simultaneous+determination+of+catecholamines+and+metanephrines+in+spot+urine+samples.">Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples.</a> Talanta. 159, 238-247 (2016).</li><li>Chao, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+3-nitrotyrosine+and+3-nitro-4-hydroxyphenylacetic+acid+in+human+urine+by+online+SPE+LC-MS/MS+and+their+association+with+oxidative+and+methylated+DNA+lesions.">Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions.</a> Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).</li><li>Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+detection+of+nitrotyrosine+in+biological+fluids+development+of+a+clinically+translatable+biomarker.">Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker.</a> Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+96-well+&#181;Elution+solid-phase+extraction+combined+with+UFLC-MS/MS:+a+significantly+improved+approach+for+determination+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+urine.">Tailored 96-well &#181;Elution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).</li><li>. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7 Available from: <a target="_blank" href="https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html">https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html</a> (2011)</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mixed-mode+solid+phase+extraction+coupled+with+LC-MS/MS+for+the+re-evaluation+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+as+an+oxidative+stress+biomarker.">A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker.</a> Talanta. 140, 45-51 (2015).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+approach+for+the+ultra-sensitive+determination+of+catecholamines+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+assess+neural-immune+communication.">An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication.</a> J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).</li></ol>

Väsentliga variationer i koncentrationer som tidigare rapporterats i litteraturen för det endogena fria 3-NT i humana urinprover avslöjar metodiska problem associerade med tillgängliga analyser 8 , 9 , 10 , 11 . Noggrann bestämning av den låga basala nivån på 3-NT i human urin är fortfarande en utmanande uppgift som kräver speciella försiktighetsåtgärder för provberedning och LC-...

Effekterna av oxidativ stress på klinisk presentation har dragits fram i framkant de senaste åren 1 . En av de biomarkörer som undersöks är 3-nitrotyrosin (3-NT), en slutstabil produkt som bildas när reaktiva kvävearter (RNS) interagerar med tyrosin, en katecholamin-neurotransmittorprekursor. Medan 3-NT kan ha kliniskt värde som biomarkör för RNS in vivo, kan de väsentliga förändringar av egenskaperna och funktionerna hos tyrosin negativt påverkar motsvarande proteiner och cellulära funktioner 1, 2. Ny forskning har föreslagit att 3-NT kan spela en viktig roll vid inflammatoriska tillstånd 3 , neurodegenerativa sjukdomar 4 , 5 , kardiovaskulär sjukdom 6 och diabetes 7 samt villkor relaterade till oxidativ stress. Men dessa obseRvationer baseras på resultat från metoder som saknar känslighet och / eller selektivitet 8 , 9 , 10 , 11 . De enorma 3-NT-koncentrationsområdena för de biologiska prover som tidigare rapporterats i litteraturen visar att allvarliga analytiska problem är associerade med dessa analyser och teknisk förbättring är nödvändig för att exakt kvantifiera nivåerna av 3-NT och verifiera dess roll i patologin för dessa betingelser . Kvantitering av fri 3-NT i biologiska matriser presenterar en speciell utmaning för man och instrument 8 , 9 , 10 , 11 . För det första kräver spårningsnivån för endogen 3-NT en ultrakänslig detektering; För det andra finns förekomsten av många strukturellt liknande analoger, särskilt tyrosin, som är närvarande iStort överskott, kräver en hög grad av selektivitet För det tredje kräver artefaktuell bildning av 3-NT genom tyrosinitrering med allestädes närvarande nitrat och nitrit särskild hänsyn vid provberedning för att undvika falskt överskattning av 3-NT. Bland många olika metoder som används för att mäta 3-NT har MS / MS betraktats som guldstandardmetoden på grund av sin överlägsen känslighet och selektivitet 11 , 12 , 13 , 14 . Gaskromatografi (GC) kopplad MS / MS ger den bästa känsligheten, men de nödvändiga provderivatiseringsstegen är alltför tråkiga och tidskrävande för att vara effektiva för klinisk nytta 15 , 16 . LC-MS / MS kräver inte komplicerad provderivatisering, vilket gör det mer lovande alternativet. Ändå finns det flera hinder att övervinna, såsom seNsitivity av LC-MS / MS-metoder som rapporteras i litteraturen måste förbättras för mätning av lågt rikligt 3-NT 7 , 17 , 18 och den relativt långa omställningstiden måste förkortas för applikationer med hög genomströmning 12 , 13 , 17 , 19 . Vidare spelar den biologiska matrisen en betydande roll när man överväger kliniska tillämpningar. Det ska vara enkelt och billigt att få och inte invasiv om möjligt 20 , 21 , 22 . Plasma, det traditionellt använda provet i litteraturen, är inte en kliniskt önskvärd matris, så en metod som utnyttjar urin som är icke-invasiv och kostnadseffektiv sökes. Flera försök att utveckla relAnvändbara och specifika LC-MS / MS-metoder har gjorts med användning av urin 9 , 10 , 11 . De har emellertid alla fallit brist på att vara selektiva, tillförlitliga eller effektiva nog för klinisk användning. Effektiviteten hos den övervägande SPE med användning av traditionell reversfaspatron (C18-typ) som provuppsättning för 3-NT-analysen har ifrågasatts och en sekventiell SPE med stark katjonbyte (SCX) och omvänd fas C18-OH har föreslagits 6 , 7 , 19 . En nyligen utvecklad LC-MS / MS-metod utnyttjade en rening med flera steg med manuell C18 SPE, preparativ högtrycksvätskekromatografi (HPLC) och online SPE för analys av 3-NT 23 . Fastän denna metod var känslig nog för kliniska ändamål, med en LLOQ på 0,041 nM, var uppreningsprocessen intensiv och tråkig och krävdesRöd 3 ml urin, vilket begränsar dess genomförbarhet för hög genomströmning. En molekylärtryckad polymer användes som SPE-sorptionsmedlet för att förbättra effektiviteten hos upprensningsprocessen 14 , men den resulterande LLOQ (0,7 ug / ml) var inte tillräckligt låg för kliniska prov. En annan metod krävde tvådimensionell (2D) LC-MS / MS och immunaffinitetskromatografi för provuppretting för att uppnå en detektionsgräns (LOD) på 0,022 nM 24 . Medan alla dessa metoder har gjort framsteg i bedömningen av 3-NT har ingen uppnått känsligheten, tillförlitligheten och effektiviteten som krävs för kliniska tillämpningar. För att undersöka patologin för fri 3-NT och dess roll som biomarkör av oxidativ stress i kliniska miljöer har vi utvecklat en metod som är enkel, effektiv, exakt och exakt, vilket möjliggör kliniska applikationer med hög genomströmning 25 . En miniatyriserad blandad-mode katjon exc(MCX) 96-brunns extraktionsmikroplatta genomfördes för att uppnå enkel och effektiv provrening och berikning av 3-NT i en enda extraktion som omger de nackdelar som ses i de befintliga metoderna som kräver derivatisering, avdunstning och 2D-LC. Vätskekromatografi med 0,01% HCOOH som additiv i mobilfas erbjöd ett förbättrat signalrespons med en snabb cykeltid. Selektivitet förbättrades ytterligare genom applicering av en mild NH4OAC elueringslösning för selektiv eluering av 3-NT, och användning av MRM övergång för både 3-NT och den interna standarden (IS). Matriseffekten kompenserades genom användning av en reducerad mängd av en föredragen 13 C-märkt isotopisk IS för kvantifiering. Med tillkomsten av denna metodik kommer forskare och kliniker att kunna verifiera rollen som 3-NT i kliniska tillstånd och vidare utforska effekterna av oxidativ stress.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="912">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">3-Nitro-L-tyrosine</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">N7389-5g</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">3-Nitro-L-tyrosine-13C9</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>652296-5.0mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mass Spec Gold Urine</td>
			<td>Golden West Biologicals</td>
			<td>MSG 5000-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oasis MCX 96-well &#181;Elution plate</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>186001830BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2mL 96 well collection plate</td>
			<td style="width:161px;">Phenomenex&#160;&#160;</td>
			<td style="width:115px;">AH0-7194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 positive processor</td>
			<td style="width:161px;">Waters&#160;</td>
			<td style="width:115px;">186005521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol&#160;&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">14262-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS Ultra CHROMASOLV water</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">14263-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid for mass spectrometry</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td>94318-50ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">338818-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra PFP propyl columns</td>
			<td style="width:161px;">Restek</td>
			<td style="width:115px;">9179362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5500 Triple quad</td>
			<td style="width:161px;">AB Sciex&#160;</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Contact manufacture for more detail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UFLC-XR</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu&#160;</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Contact manufacture for more detail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Integra 400 Plus&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Urinary Creatinine Jaff&#233; Gen 2 method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LCMS certified 12 x 32mm screw neck vial</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>600000751CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vial</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>186000384C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL transport tube</td>
			<td style="width:161px;">Phenix</td>
			<td>TT-3205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">50 mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:161px;">Crystalgen&#160;</td>
			<td style="width:115px;">23-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">15 mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:161px;">Crystalgen&#160;</td>
			<td style="width:115px;">23-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eLine electronic pipette</td>
			<td style="width:161px;">Sartorius</td>
			<td style="width:115px;">730391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:115px;">A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OHAUS balance&#160;&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Kennedy Scales, inc.</td>
			<td style="width:115px;">735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex mixer&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Bernstead Thermolyne</td>
			<td style="width:115px;">M16715</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integration of miniaturized solid phase extraction and lc-ms/ms detection of 3-nitrotyrosine in human urine for clinical applications

Fri 3-nitrotyrosin (3-NT) har i stor utsträckning använts som en möjlig biomarkör för oxidativ stress. Ökad nivå av 3-NT har rapporterats i en mängd olika patologiska tillstånd. Existerande metoder saknar emellertid tillräcklig känslighet och / eller specificitet som är nödvändig för att på ett tillförlitligt sätt mäta den låga endogena nivån på 3-NT och är för tunga för kliniska tillämpningar. Därför krävs analytisk förbättring för att noggrant kvantifiera nivåerna av 3-NT och verifiera rollen av 3-NT vid patologiska tillstånd. Detta protokoll presenterar utvecklingen av en ny vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS / MS) -detektering kombinerad med en miniatyriserad fastfasutvinning (SPE) för snabb och noggrann mätning av 3-NT i human urin som en icke-invasiv biomarkör För oxidativ stress. SPE med en 96-brunnsplatta förenklade processen genom att kombinera provrening och analysberikning utan tråkiga derivatiserings- och evaporationssteg, Minskning av lösningsmedelsförbrukning, avfallshantering, risk för kontaminering och total bearbetningstid. Anställning av 25 mM ammoniumacetat (NH4OAC) vid pH 9 som SPE elueringslösningen förbättras väsentligen selektiviteten. Masspektrometrisignalresponsen förbättrades genom justering av multipelreaktionsövervakning (MRM) -övergångarna. Användning av 0,01% HCOOH som additiv på en pentafluorfenyl (PFP) -kolonn (150 mm x 2,1 mm, 3 um) förbättrade signalresponsen ytterligare 2,5 gånger och förkortat den totala körtiden till 7 min. En lägre kvantifieringsgräns (LLOQ) på 10 pg / ml (0,044 nM) uppnåddes, vilket representerade en signifikant förbättring av känsligheten för de rapporterade analyserna. Denna förenklade, snabba, selektiva och känsliga metod medger att två plåtar ur urinprover (n = 192) behandlas under en 24 h tidsperiod. Med tanke på den markant förbättrade analysprestandan och icke-invasiv och billig urinprovtagning är den föreslagna analysen fördelaktig för preklinisk och kliniskstudier.

Figur 1 illustrerar att 3-NT separeras fullständigt kromatografiskt från andra strukturellt liknande tyrosinanaloger under det optimerade LC-tillståndet, vilket eliminerar de ko-eluerande störningarna på grund av dessa mycket överdrivna föreningar och följaktligen ökar graden av analysselektivitet. Dessutom möjliggör gradientelueringen med 0,01% HCOOH som additiv i MA och metanol vid en flödeshastighet av 0,45 ml / min snabb eluering av 3-NT ( <e...

Watch this Scientific Journal Video about Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications at JoVE.com

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

En selektiv och känslig vätskekromatografi-tandemmasspektrometri (LC-MS / MS) -metod kopplad till en effektiv fastfas-extraktion på en mikroplat med 96 m brunnsmedelsplattform (mixed-mode cation-exchange) (MCX) utvecklades för mätning av fri 3-nitrotyrosin ( 3-NT) i human urin med hög genomströmning, vilket är lämpligt för kliniska tillämpningar.

Integration av miniatyriserad fast fas extraktion och LC-MS / MS-detektion av 3-nitrotyrosin i human urin för kliniska tillämpningar

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Chemistry

Human Biology

Osmoregulation and Excretion

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Beredning av hydrofoba metal-organic frame via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition av perfluoralkaner för borttagning av ammoniak

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Activating Molecules, Ions, and Solid Particles with Acoustic Cavitation

Aktivera molekyler, joner, och fasta partiklar med Acoustic Kavitation

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic ...

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Syntetisk Metodik för Asymmetric Ferrocen Härledda Bio-konjugerade system via Solid Phase Harts-metodik

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X pulverröntgendiffraktionsmönster i Conservation Science: Mot Rutin Crystal strukturbestämning av korrosionsprodukter på Heritage konstföremål

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Mätning av partikelstorleksfördelning i grumliga lösningar genom dynamisk ljusspridning Mikroskopi

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Protokoll för fastfassyntesen av oligomerer av RNA innehållande en 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -tiofenylmetylmodifiering och karakterisering via cirkulär dikroism

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

En behändig metod för extraktion och analys med vätskekromatografi högtrycks av katekolamin signalsubstanser och deras metaboliter

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Surface Properties of Synthesized Nanoporous Carbon and Silica Matrices

Ytans egenskaper av syntetiserade nanoporösa kol och kisel matriser

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) ...

Solid-phase Synthesis of [4.4] Spirocyclic Oximes

Fasta fasen syntes av [4.4] gröna Oximes

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of ...

Development and Validation of Chromium Getters for Solid Oxide Fuel Cell Power Systems

Utveckling och validering av krom Getters för fast oxid bränsle cell kraftsystem

Degradation of cathode in solid oxide fuel cells (SOFC) remains a major concern for the long-term performance stability and operational reliability. The ...