Name: integration of miniaturized solid phase extraction and lc-ms/ms detection of 3-nitrotyrosine in human urine for clinical applications
Uploaded: 2017-07-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications at JoVE.com

Yazarlar Scott Howard ve Abigail Marinack&#39;ın bu çalışmanın genel destek ve koordinasyonu için onaylarlar.

İnsan idrar örneklerini içeren tüm çalışmalar, Pharmasan / Neuroscience Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanan prosedüre uyularak gerçekleştirildi. 1. İdrar Numunesi Toplama ve Kreatinin (Cr) Tayini <ol><li> Yaklaşık 5 mL sonra ertesi sabah idrar örnekleri toplayın. Koruyucu olarak 250 μL 3 N HC1 içeren 5 mL&#39;lik bir taşıma tüpünde gece boyunca 10 saat boyunca aç bırakın ve kullanıma kadar -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Çözünür ve vortek...

<ol>
	<li>Dalle-Donne, I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., Milzani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomarkers+of+oxidative+damage+in+human+disease.">Biomarkers of oxidative damage in human disease.</a> Clin. Chem. 52 (4), 601-623 (2006).</li><li>Pacher, P., Beckman, J. S., Liaudet, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+and+peroxynitrite+in+health+and+disease.">Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease.</a> Physiol. Rev. 87 (1), 315-424 (2007).</li><li>Baraldi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Nitrotyrosine,+a+marker+of+nitrosative+stress,+is+increased+in+breath+condensate+of+allergic+asthmatic+children.">3-Nitrotyrosine, a marker of nitrosative stress, is increased in breath condensate of allergic asthmatic children.</a> Allergy. 61 (1), 90-96 (2006).</li><li>Ischiropoulos, H., Beckman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+nitration+in+neurodegeneration:+Cause,+effect,+or+association?.">Oxidative stress and nitration in neurodegeneration: Cause, effect, or association?.</a> J. Clin. Invest. 111 (2), 163-169 (2003).</li><li>Butterfield, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+3-nitrotyrosine+in+brain+from+subjects+with+amnestic+mild+cognitive+impairment:+implications+for+the+role+of+nitration+in+the+progression+of+Alzheimer's+disease.">Elevated levels of 3-nitrotyrosine in brain from subjects with amnestic mild cognitive impairment: implications for the role of nitration in the progression of Alzheimer's disease.</a> Brain Res. 1148, 243-248 (2007).</li><li>Hui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+robust+LC-MS/MS+method+for+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+from+patients+receiving+on-pump+CABG+surgery.">A simple and robust LC-MS/MS method for quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma from patients receiving on-pump CABG surgery.</a> Electrophoresis. 33 (4), 697-704 (2012).</li><li>Kato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+modified+tyrosines+in+healthy+and+diabetic+human+urine+using+liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry.">Quantification of modified tyrosines in healthy and diabetic human urine using liquid chromatography/tandem mass spectrometry.</a> J. Clin. Biochem. Nutr. 44 (1), 67-78 (2009).</li><li>Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+approaches+to+the+analysis+of+3-nitrotyrosine.">A review of approaches to the analysis of 3-nitrotyrosine.</a> Amino acids. 25 (3-4), 351-361 (2003).</li><li>Ryberg, H., Caidahl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatographic+and+mass+spectrometric+methods+for+quantitative+determination+of+3-nitrotyrosine+in+biological+samples+and+their+application+to+human+samples.">Chromatographic and mass spectrometric methods for quantitative determination of 3-nitrotyrosine in biological samples and their application to human samples.</a> J. Chromatogr. B. 851 (1-2), 160-171 (2007).</li><li>Tsikas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+3-nitrotyrosine+quantification+in+biological+samples:+the+unique+role+of+tandem+mass+spectrometry.">Analytical methods for 3-nitrotyrosine quantification in biological samples: the unique role of tandem mass spectrometry.</a> Amino acids. 42 (1), 45-63 (2012).</li><li>Tsikas, D., Duncan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+3-nitrotyrosine:+strategies,+controversies,+and+our+current+perspective.">Mass spectrometry and 3-nitrotyrosine: strategies, controversies, and our current perspective.</a> Mass Spectrom. Rev. 33 (4), 237-276 (2014).</li><li>Iwasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+fluorescence+reagents+for+simultaneous+determination+of+hydroxylated+phenylalanine+and+nitrated+tyrosine+by+high-performance+liquid+chromatography+with+fluorescence+detection.">Comparison of fluorescence reagents for simultaneous determination of hydroxylated phenylalanine and nitrated tyrosine by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.</a> Biomed. Chromatogr. 26 (1), 41-50 (2012).</li><li>Saravanabhavan, G., Blais, E., Vincent, R., Kumarathasan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+performance+liquid+chromatography-electrochemical+array+method+for+the+measurement+of+oxidative/nitrative+changes+in+human+urine.">A high performance liquid chromatography-electrochemical array method for the measurement of oxidative/nitrative changes in human urine.</a> J. Chromatogr. A. 1217 (19), 3269-3274 (2010).</li><li>Mergola, L., Scorrano, S., Del Sole, ., Lazzoi, R., R, M., Vasapollo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developments+in+the+synthesis+of+a+water+compatible+molecularly+imprinted+polymer+as+artificial+receptor+for+detection+of+3-nitro-L-tyrosine+in+neurological+diseases.">Developments in the synthesis of a water compatible molecularly imprinted polymer as artificial receptor for detection of 3-nitro-L-tyrosine in neurological diseases.</a> Biosens. Bioelectron. 40 (1), 336-341 (2013).</li><li>Schwedhelm, E., Tsikas, D., Gutzki, F. M., Frolich, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic-tandem+mass+spectrometric+quantification+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+at+the+basal+state.">Gas chromatographic-tandem mass spectrometric quantification of free 3-nitrotyrosine in human plasma at the basal state.</a> Anal. Biochem. 276 (2), 195-203 (1999).</li><li>Tsikas, D., Mitschke, A., Suchy, M. T., Gutzki, F. M., Stichtenoth, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+3-nitrotyrosine+in+human+urine+at+the+basal+state+by+gas+chromatography-tandem+mass+spectrometry+and+evaluation+of+the+excretion+after+oral+intake.">Determination of 3-nitrotyrosine in human urine at the basal state by gas chromatography-tandem mass spectrometry and evaluation of the excretion after oral intake.</a> J. Chromatogr. B. 827 (1), 146-156 (2005).</li><li>Marvin, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+o,o'-dityrosine,+o-nitrotyrosine,+and+o-tyrosine+in+cat+urine+samples+by+LC/electrospray+ionization-MS/MS+using+isotope+dilution.">Quantification of o,o'-dityrosine, o-nitrotyrosine, and o-tyrosine in cat urine samples by LC/electrospray ionization-MS/MS using isotope dilution.</a> Anal. Chem. 75 (2), 261-267 (2003).</li><li>Orhan, H., Vermeulen, N. P., Tump, C., Zappey, H., Meerman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+tyrosine,+phenylalanine+and+deoxyguanosine+oxidation+products+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+as+non-invasive+biomarkers+for+oxidative+damage.">Simultaneous determination of tyrosine, phenylalanine and deoxyguanosine oxidation products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry as non-invasive biomarkers for oxidative damage.</a> J. Chromatogr. B. 799 (2), 245-254 (2004).</li><li>Chen, H. J. C., Chiu, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+and+quantification+of+3-nitrotyrosine+and+3-bromotyrosine+in+human+urine+by+stable+isotope+dilution+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry.">Simultaneous detection and quantification of 3-nitrotyrosine and 3-bromotyrosine in human urine by stable isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Toxicol. Lett. 181 (1), 31-39 (2008).</li><li>Marc, D. T., Ailts, J. W., Campeau, D. C. A., Bull, M. J., Olson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotransmitters+excreted+in+the+urine+as+biomarkers+of+nervous+system+activity:+validity+and+clinical+applicability.">Neurotransmitters excreted in the urine as biomarkers of nervous system activity: validity and clinical applicability.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 35 (3), 635-644 (2011).</li><li>Li, X. G., Li, S., Wynveen, P., Mork, K., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+specific+and+sensitive+LC-MS/MS+method+for+quantification+of+urinary+catecholamines+and+application+in+biological+variation+studies.">Development and validation of a specific and sensitive LC-MS/MS method for quantification of urinary catecholamines and application in biological variation studies.</a> Anal. Bioanal. Chem. 406 (28), 7287-7297 (2014).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-analytical+and+analytical+validations+and+clinical+applications+of+a+miniaturized,+simple+and+cost-effective+solid+phase+extraction+combined+with+LC-MS/MS+for+the+simultaneous+determination+of+catecholamines+and+metanephrines+in+spot+urine+samples.">Pre-analytical and analytical validations and clinical applications of a miniaturized, simple and cost-effective solid phase extraction combined with LC-MS/MS for the simultaneous determination of catecholamines and metanephrines in spot urine samples.</a> Talanta. 159, 238-247 (2016).</li><li>Chao, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+3-nitrotyrosine+and+3-nitro-4-hydroxyphenylacetic+acid+in+human+urine+by+online+SPE+LC-MS/MS+and+their+association+with+oxidative+and+methylated+DNA+lesions.">Simultaneous detection of 3-nitrotyrosine and 3-nitro-4-hydroxyphenylacetic acid in human urine by online SPE LC-MS/MS and their association with oxidative and methylated DNA lesions.</a> Chem. Res. Toxicol. 28 (5), 997-1006 (2015).</li><li>Radabaugh, M. R., Nemirovskiy, O. V., Misko, T. P., Aggarwal, P., Mathews, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+detection+of+nitrotyrosine+in+biological+fluids+development+of+a+clinically+translatable+biomarker.">Immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry detection of nitrotyrosine in biological fluids development of a clinically translatable biomarker.</a> Anal. Biochem. 380 (1), 68-76 (2008).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tailored+96-well+&#181;Elution+solid-phase+extraction+combined+with+UFLC-MS/MS:+a+significantly+improved+approach+for+determination+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+urine.">Tailored 96-well &#181;Elution solid-phase extraction combined with UFLC-MS/MS: a significantly improved approach for determination of free 3-nitrotyrosine in human urine.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (25), 7703-7712 (2015).</li><li>. Roche Creatinine Jaffé Gen.2, package insert 2011-11, V7 Available from: <a target="_blank" href="https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html">https://usdiagnostics.roche.com/products/06407137190/PARAM2083/overlay.html</a> (2011)</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mixed-mode+solid+phase+extraction+coupled+with+LC-MS/MS+for+the+re-evaluation+of+free+3-nitrotyrosine+in+human+plasma+as+an+oxidative+stress+biomarker.">A novel mixed-mode solid phase extraction coupled with LC-MS/MS for the re-evaluation of free 3-nitrotyrosine in human plasma as an oxidative stress biomarker.</a> Talanta. 140, 45-51 (2015).</li><li>Li, X. G., Li, S., Kellermann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry+approach+for+the+ultra-sensitive+determination+of+catecholamines+in+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+assess+neural-immune+communication.">An integrated liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach for the ultra-sensitive determination of catecholamines in human peripheral blood mononuclear cells to assess neural-immune communication.</a> J. Chromatogr. A. 1449, 54-61 (2016).</li></ol>

İnsan idrar örneklerinde endojen serbest 3-NT için literatürde daha önce bildirilen konsantrasyonlarda önemli değişiklikler, mevcut testler 8 , 9 , 10 , 11 ile ilgili metodolojik problemleri ortaya çıkarmaktadır. İnsan idrarı altındaki düşük 3-NT seviyesinin doğru tespiti, örnek hazırlama ve LC-MS / MS analizi için özel tedbirler gerektiren zorlu bir görev olmaya devam e...

Son yıllarda oksidatif stresin klinik sunum üzerindeki etkileri ön plana çıkmaktadır 1 . Araştırılan biyolojik belirteçlerden biri, reaktif azot türleri (RNS), katekolamin nörotransmitter öncüsü olan tirozin ile etkileşime girdiğinde oluşan, uçta dengeli bir ürün olan 3-nitrotirosin (3-NT) &#39;dir. 3-NT, in vivo RNS için bir biyolojik belirteç olarak klinik değeri olabileceği gibi, tirozin özelliklerinin ve işlevlerinin önemli değişiklikleriyle karşılık gelen proteinleri ve hücresel işlevleri olumsuz şekilde etkileyebilir 1 , 2 . Yükselen araştırmalar, 3-NT&#39;nin inflamatuar koşullar 3 , nörodejeneratif bozukluklar 4 , 5 , kardiyovasküler hastalık 6 ve diyabet 7&#39;de ve oksidatif stresle ilgili koşullarda önemli bir rol oynayabileceğini önermektedir. Ancak, bu observations sensitivite ve / veya seçicilik 8, 9, 10, 11 eksik metodolojileri sonuçlarına dayanmaktadır. Daha önce literatürde bildirilen biyolojik numuneler için muazzam 3-NT konsantrasyon aralıkları, ciddi analitik problemlerin bu tahliller ile ilişkili olduğunu ve 3-NT seviyelerini doğru bir şekilde ölçmek ve bu koşulların patolojisindeki rolünü doğrulamak için teknik iyileştirmenin gerek duyulduğunu ortaya koymaktadır . Biyolojik matristeki serbest 3-NT&#39;nin nicelendirilmesi, insan ve enstrüman için 8 , 9 , 10 , 11 özel bir zorluk ortaya koymaktadır. Birincisi, endojen 3-NT&#39;nin iz seviyesi aşırı duyarlı bir tespit gerektirir; İkincisi, çok sayıda yapısal olarak benzer analogların varlığı, özellikle de tirozin,Aşırı derecede fazlalık, yüksek oranda seçicilik gerektirir; Üçüncüsü, her yerde bulunan nitrat ve nitrit ile tirozin nitrasyonuyla 3-NT&#39;nin artefaktik oluşumu, 3-NT&#39;nin sahte aşırı tahmin edilmesini önlemek için numune hazırlama esnasında özel olarak düşünülmesini gerektirir. 3-NT ölçmek için kullanılan metodolojilerin çeşitli arasında, MS / MS nedeniyle üstün hassasiyet ve seçicilik 11, 12, 13, 14, altın standart yöntem olarak kabul edilmiştir. Gaz kromatografisi (GC), MS / MS en yüksek duyarlılık, ancak, zorunlu örnek türetme adımları çok sıkıcı ve vardır sunmaktadır bağlanmış klinik kullanım 15, 16 için etkili olduğu zaman alır. LC-MS / MS karmaşık numune türetme işlemine ihtiyaç duymaz, bu da daha umut vericidir. Bununla birlikte, üstesinden gelinmesi gereken bazı engeller var.Literatürde bildirilen LC-MS / MS yöntemlerinin nsitivitesi, düşük miktarda 3-NT 7 , 17 , 18 ölçümü için iyileştirilmesi ve yüksek verimli uygulamalar için nispeten uzun dönüş süresi kısaltılmalıdır 12 , 13 , 17 , 19 . Ek olarak, klinik uygulamalar göz önüne alındığında, kullanılan biyolojik matris önemli bir rol oynamaktadır. Mümkünse bulaşıcı olmayan, kolay ve ucuz olmalıdır 20 , 21 , 22 . Literatürde geleneksel olarak kullanılan örnek olan plazma klinik olarak istenen bir matristir, bu nedenle invaziv olmayan ve maliyet-etkinliği olan idrarı kullanan bir metod aranmıştır. Rel geliştirmek için çeşitli girişimlerKullanılabilir ve spesifik LC-MS / MS metodolojileri idrar 9 , 10 , 11 kullanılarak yapılmıştır . Bununla birlikte, hepsi seçici, güvenilir ya da klinik kullanım için yeterince etkili olmamaktadır. Geleneksel ters fazlı kartuş (C18 tipi) kullanılarak 3-NT analizi için numune temizliği olarak baskın SPE&#39;nin etkinliği sorgulanmış ve ardışık bir şekilde güçlü katyon değişimi (SCX) ve ters faz C18-OH SPE&#39;si önerilmiştir 6 , 7 , 19 . Yakın zamanda geliştirilen bir LC-MS / MS yöntemi, manuel C18 SPE, preparatif yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ve 3-NT 23&#39;ün analizi için online SPE&#39;nin çok aşamalı bir saflaştırma prosesini kullanmıştır. Bu yöntem 0.041 nM LLOQ ile klinik amaçlar için yeterince hassas olsa da, temizleme işlemi yoğun ve sıkıcıydı ve requiKırmızı 3 mL idrar, yüksek verim için fizibilitesini sınırlıyor. Bir moleküler olarak basılmış bir polimer temizleme işlemi 14 verimliliğini artırmak için SPE emici olarak kullanıldı, ancak elde edilen LLOQ (0.7 ug / mL) klinik örnekler için yeterince düşük değildi. Bir başka yöntem, 0.022 nM 24&#39;lük bir saptama limiti (LOD) elde etmek için numunenin temizlenmesi için iki boyutlu (2D) LC-MS / MS ve immünoafinite kromatografisini gerektirdi. Tüm bu yöntemler 3-NT değerlendirmesinde ilerleme kaydederken, hiçbiri klinik uygulamalar için gerekli duyarlılık, güvenilirlik ve verimliliği sağlamamıştır. Serbest 3-NT patolojisini ve bunun klinik ortamdaki oksidatif stresin bir biyobelirteç olarak rolünü araştırmak için basit, verimli, doğru ve kesin, yüksek verimli klinik uygulamalar için bir yöntem geliştirdik 25 . Minyatür karışık mod katyonuTürevlendirme, buharlaştırma ve 2D-LC&#39;yi gerektiren mevcut yöntemlerde görülen dezavantajları atlayarak basit ve etkili numune temizleme ve 3-NT&#39;nin zenginleştirilmesi için tek bir ekstraksiyonda elde edilen hange (MCX) 96 oyuklu ekstraksiyon mikroplağı uygulandı. Hareketli fazda katkı maddesi olarak% 0.01 HCOOH ile sıvı kromatografisi hızlı çevrim süresi ile gelişmiş bir sinyal yanıtı sundu. Seçicilik daha 3-NT ve iç standart (IS) her ikisi içinde selektif 3-NT ayrıştırma ve MRM geçişi kullanımı için hafif bir NH4OAc elüsyon çözeltisi uygulamasıyla geliştirilmiştir. Matris etkisi, kantifikasyon için indirgenmiş miktarda bir 13 C işaretli izotopik IS kullanılarak telafi edildi. Bu metodolojinin ortaya çıkmasıyla araştırmacılar ve klinisyenler klinik koşullardaki 3-NT rolünü doğrulayacak ve oksidatif stresin etkisini daha da keşfedebileceklerdir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="912">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">3-Nitro-L-tyrosine</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">N7389-5g</td>
			<td style="width:263px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">3-Nitro-L-tyrosine-13C9</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>652296-5.0mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mass Spec Gold Urine</td>
			<td>Golden West Biologicals</td>
			<td>MSG 5000-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oasis MCX 96-well &#181;Elution plate</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>186001830BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2mL 96 well collection plate</td>
			<td style="width:161px;">Phenomenex&#160;&#160;</td>
			<td style="width:115px;">AH0-7194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 positive processor</td>
			<td style="width:161px;">Waters&#160;</td>
			<td style="width:115px;">186005521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS Ultra CHROMASOLV methanol&#160;&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">14262-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LC-MS Ultra CHROMASOLV water</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">14263-2L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formic acid for mass spectrometry</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td>94318-50ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium hydroxide solution</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">338818-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra PFP propyl columns</td>
			<td style="width:161px;">Restek</td>
			<td style="width:115px;">9179362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5500 Triple quad</td>
			<td style="width:161px;">AB Sciex&#160;</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Contact manufacture for more detail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UFLC-XR</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu&#160;</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Contact manufacture for more detail</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Integra 400 Plus&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:115px;">/</td>
			<td style="width:263px;">Urinary Creatinine Jaff&#233; Gen 2 method</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LCMS certified 12 x 32mm screw neck vial</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>600000751CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LCGC certified 12 x 32mm screw neck total recovery vial</td>
			<td style="width:161px;">Waters</td>
			<td>186000384C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5 mL transport tube</td>
			<td style="width:161px;">Phenix</td>
			<td>TT-3205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">50 mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:161px;">Crystalgen&#160;</td>
			<td style="width:115px;">23-2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:375px;">15 mL Centrifuge tube</td>
			<td style="width:161px;">Crystalgen&#160;</td>
			<td style="width:115px;">23-2266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">eLine electronic pipette</td>
			<td style="width:161px;">Sartorius</td>
			<td style="width:115px;">730391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microfuge centrifuge&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:115px;">A46474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">OHAUS balance&#160;&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Kennedy Scales, inc.</td>
			<td style="width:115px;">735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vortex mixer&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Bernstead Thermolyne</td>
			<td style="width:115px;">M16715</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

integration of miniaturized solid phase extraction and lc-ms/ms detection of 3-nitrotyrosine in human urine for clinical applications

Serbest 3-nitrotirosin (3-NT), oksidatif stres için olası bir biyolojik belirteç olarak yaygın şekilde kullanılmıştır. Çok çeşitli patolojik koşullarda artan 3-NT seviyeleri bildirilmiştir. Bununla birlikte, mevcut yöntemler, düşük endojen seviyedeki 3-NT&#39;yi güvenilir bir şekilde ölçmek için gerekli olan yeterli duyarlılık ve / veya özgüllükten yoksundur ve klinik uygulamalar için çok hantaldır. Bu nedenle, 3-NT düzeylerini doğru bir şekilde ölçmek ve patolojik koşullardaki 3-NT rolünü doğrulamak için analitik iyileştirmeye acilen ihtiyaç duyulmaktadır. Bu protokol, non-invaziv biyolojik belirteç olarak insan idrarında 3-NT&#39;nin hızlı ve doğru ölçümü için minik bir katı faz ekstraksiyonu (SPE) ile birlikte yeni bir sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi (LC-MS / MS) algılamasının gelişimini sunar Oksidatif stres için. 96 yuvalı bir plak kullanarak SPE, numune temizleme ve analit zenginleştirmeyi sıkıcı türetme ve buharlaştırma adımları olmadan birleştirerek işlemi basitçe belirginleştirdi, Solvent tüketimini azaltmak, atık bertaraf etmek, kirlenme riski ve genel işlem süresi. SPE elüsyon çözeltisi, pH 9, 25 mM amonyum asetat iş (NH4OAc) esas olarak seçicilik geliştirilmiş. Kütle spektrometresi sinyal tepkisi, çoklu reaksiyon izleme (MRM) geçişlerinin ayarlanması yoluyla geliştirildi. Bir pentaflorofenil (PFP) kolonuna (150 mm x 2.1 mm, 3 μm) katkı maddesi olarak% 0.01 HCOOH kullanılması, sinyal tepkisini 2.5 kat daha geliştirmiş ve toplam çalışma süresini 7 dakikaya kısaltmıştır. 10 pg / mL&#39;nin (0.044 nM) düşük bir niceleme limiti (LLOQ) elde edildi, bu da bildirilen testlere kıyasla önemli bir duyarlılık geliştirmeyi temsil etti. Bu basitleştirilmiş, hızlı, seçici ve duyarlı yöntem, iki pleyt numunesi (n = 192) 24 saatlik bir süre içinde işlenmesine izin verir. Geliştirilen analitik performans ve invaziv olmayan ve ucuz idrar örneklemesi göz önüne alındığında, önerilen test, klinik öncesi ve klinikte faydalıdırçalışmaları.

Şekil 1 , 3-NT&#39;nin, optimize edilmiş LC koşulu altında diğer yapısal olarak benzer tirosin analoglarından tamamen kromatografik olarak ayrıldığını göstermekte olup, bu da aşırı derecede aşırı bileşikler nedeniyle oluşan birlikte müdahale etkileşimlerini ortadan kaldırmakta ve dolayısıyla tahlil seçiciliğini arttırmaktadır. Ek olarak MA ve metanolde katkı maddesi olarak% 0.01 HCOOH ile 0.45 mL / dak&#39;lık bir akış oran?...

Watch this Scientific Journal Video about Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications at JoVE.com

Integration of Miniaturized Solid Phase Extraction and LC-MS/MS Detection of 3-Nitrotyrosine in Human Urine for Clinical Applications

Karma mod katyon değiştirme (MCX) 96-kuyulu bir mikroplak üzerinde verimli bir katı faz ekstraksiyonu ile birleşmiş seçici ve duyarlı bir sıvı kromatografi tandem kütle spektrometresi (LC-MS / MS) yöntemi, serbest 3-nitrotirosin 3-NT) insan idrarında yüksek verimle, klinik uygulamalar için uygundur.

Klinik Uygulamalar İçin İnsan İdrarında 3-Nitrotirosinin Minyatür Katı Faz Çıkarma ve LC-MS / MS Algılamasının Entegrasyonu

Free 3-nitrotyrosine (3-NT) has been extensively used as a possible biomarker for oxidative stress. Increased levels of 3-NT have been reported in a wide ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Chemistry

Human Biology

Osmoregulation and Excretion

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of Hydrophobic Metal-Organic Frameworks via Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition of Perfluoroalkanes for the Removal of Ammonia

Plazma ile Hidrofobik Metal-Organik Altyapıları hazırlanması Amonyak Kaldırma için perfluorobütanlar Kimyasal Buhar Kaplama Geliştirilmiş

Plasma enhanced chemical vapor deposition (PECVD) of perfluoroalkanes has long been studied for tuning the wetting properties of surfaces. For high ...

Activating Molecules, Ions, and Solid Particles with Acoustic Cavitation

Moleküller, İyonlar, ve Akustik Kavitasyon ile Katı Parçacıklar etkinleştirilmesi

The chemical and physical effects of ultrasound arise not from a direct interaction of molecules with sound waves, but rather from the acoustic ...

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

Katı Faz Reçine-tabanlı Metodoloji aracılığıyla Asimetrik Ferrosen Türetilmiş Bio-konjuge Sistemleri Sentetik Metodoloji

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

Koruma Bilimi X-ışını Toz Kırınım: Miras Sanat Objects Korozyon Ürünleri Rutin Kristal Yapı Tayini Doğru

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Dinamik ışık saçılımı Mikroskopi Bulanık Çözümleri Tane Büyüklüğü Dağılımının Ölçümü

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

Bir 2&#39;-amino asit içeren RNA Oligomerlerinin Katı Faz Sentezi Protokolü<em&gt; Ç</em&gt; Tiyofenilmetil Değiştirme ve Sirküler Dikroizm ile Karakterizasyonlar

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

A Convenient Method for Extraction and Analysis with High-Pressure Liquid Chromatography of Catecholamine Neurotransmitters and Their Metabolites

Ayıklama ve çözümleme katekoiamin nörotransmitter ve onların metabolitleri yüksek basınçlı sıvı Kromatografi ile uygun bir yöntem

The extraction and analysis of catecholamine neurotransmitters in biological fluids is of great importance in assessing nervous system function and ...

Surface Properties of Synthesized Nanoporous Carbon and Silica Matrices

Silikat Matrisler ve sentezlenmiş Nanoporous karbon yüzey özellikleri

In this work, we report the synthesis and characterization of ordered nanoporous carbon material (also called ordered mesoporous carbon material [OMC]) ...

Solid-phase Synthesis of [4.4] Spirocyclic Oximes

Katı faz [4.4] Spirocyclic Oximes sentezi

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of ...

Development and Validation of Chromium Getters for Solid Oxide Fuel Cell Power Systems

Solid oksit yakıt hücresi güç sistemleri için Chromium Getterlerin geliştirilmesi ve doğrulanması

Degradation of cathode in solid oxide fuel cells (SOFC) remains a major concern for the long-term performance stability and operational reliability. The ...