Name: atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

هذا العمل وتمول وكالة الاستخبارات الوطنية (13-بدك-0017-01 ووكالة الاستخبارات الوطنية-14-CE09-0020-01 للجامعة العربية)، وبرنامج "الاستثمار في المستقبل" أيدكس بوردو/يزار (2016 البارزة إلى) مرجع ANR-10-معرض أيدكس-03-02 إلى، المؤسسة من أجل البحوث لوس أنجليس (ميديكال FRM-AJE20140630090 للجامعة العربية)، برنامج FP7 (FP7-الناس-2013-CIG إلى أ. ل.) ومجلس البحوث الأوروبي (المنسق) ضمن أفق 2020 البحث والابتكار البرنامج الاتحاد الأوروبي في (منحة ابتداء من منسق الإغاثة الطارئة إلى الجامعة العربية، اتفاق لا 639020)، ومشروع " ويكينتيراكت. "

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

الرنين المغناطيسي النووي الصلبة (سنمر) أسلوب الاختيار لوصف الجمعيات البروتين الجزيئات على مستوى الذري. واحدة من القضايا المركزية في تصميم هيكل على أساس سنمر هو نوعية الطيفية نظام التحقيق، الذي يسمح لإنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد الهيكلية للدقة المختلفة، وعادة ما تتراوح بين نماذج ذات الدقة المنخفضة (التي تحتوي على الثانوية تنظيم العناصر والقليل من المعلومات 3D) لهياكل ثلاثية الأبعاد الذرية الزائفة. كمية ونوعية المعلومات الهيكلية المستخرجة من تجارب سنمر متعدد الأبعاد هو المفتاح لحساب هيكل الرنين المغناطيسي عالية الدقة للجمعية.
وصف البروتوكول يعتمد على الكشف عن 13ج-13ج و 15N-13ج الهيكلية القيود التي تتطلب تسجيل عدة أطياف 2D (وفي بعض الأحيان 3D) مع إشارة عالية للضوضاء. ترددات ماس معتدلة (&#60; 25 كيلو هرتز)، يتم إدخال العينة في دوار مع أحجام من 3، 2-4 مم مما يسمح لكميات البروتين يصل إلى ~ 50 ملغ، تعتمد على ترطيب عينة. كمية العينة داخل الدوار طرديا مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء في أطياف سنمر، عاملاً حاسما للكشف عن قيود المسافة البعيدة المدى وهذه الإحالة لا لبس فيها.
القرار الطيفية معلمة حاسمة أثناء التعيين الرنين متسلسلة وجمع القيود. للحصول على أفضل النتائج، تحتاج معلمات إعداد نموذج الأمثل، لا سيما في تنقية وحدة فرعية وشروط الجمعية (درجة الحموضة، المخزن المؤقت، والهز، درجة الحرارة، إلخ). للنموذج الأمثل، من المستحسن لتحضير عينات غير مسمى وقد لوحظ لعدة شروط متميزة للجمعية، وتسجيل د 1 1ح13ج CP طيف (كما هو موضح في الخطوة 2، 1) في كل عينة استعداد. خدمة الأطياف مقارنة الاستبانة الطيفية والتشتت بين الإعداد المختلفة، استناداً إلى الظروف المثلى التي يمكن تحديد.
نوعية البيانات سنمر يعتمد بشدة على الاختيار لبارامترات الرنين المغناطيسي النووي، خاصة بالنسبة لخطوات نقل الاستقطاب. استخدام قوة الحقل المغناطيسي عالية (إيه سيكس زيرو زيرو ميجاهرتز 1ح التردد) ضروري لحساسية عالية والاستبانة الطيفية، المطلوبة عند مواجهة الأهداف المعقدة مثل التجميعات البروتين الجزيئات.
عاملاً مقيداً في كثير من الحالات هو توافر مطياف. ولذلك، ينبغي أن تسبق اختيار العينات حكيم لإعداد الدورة مطياف. في أي حال، شكل موحد 13ج، 15عينة المسمى ن شرط مسبق لإجراء التعيين الرنين متسلسلة والمتبقية داخل. للحصول على البروتينات التي تم تعيينها باستخدام تقنيات الرنين المغناطيسي النووي الصلبة راجع71. يتطلب تصميم هيكل الجزيئات التجميعات ترددات ماس معتدلة بشكل انتقائي 13ج المسمى العينات؛ للكشف عن المدى 13ج-13ج و 13ج-15N الاتصالات عينات استناداً إلى 1، 3-13ج-و 2-13ج-جيلسيرول و/أو 1-13ج-و 2-13ج-الجلوكوز العلامات ويشيع استخدام، كما هو موضح أعلاه. الاختيار بين النظامين التوسيم يستند إلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء الطيفية والقرار. للتمييز بين داخل والجزيئات الاتصالات البعيدة المدى، قد كشفت عن عينات المسمى والمخفف مختلطة كفاءة.
باختصار، خطوات حاسمة لدراسة هيكلية سنمر الذري: (ط) إعداد الوحدات الفرعية وحاجة الجمعية يكون الأمثل للحصول على عينة ممتازة كمية ونوعية، الحقل (ثانيا) مطياف القوة وحيازة المعلمات يجب أن تكون اختيرت بعناية؛ (ثالثا) استراتيجيات التوسيم انتقائية مطلوبة لتحديد هيكل ثلاثي الأبعاد، وكمية البيانات المطلوبة يعتمد على نوعية البيانات وتوافر البيانات التكميلية.
رغم انطباقها على طائفة واسعة من نظم supramolecular تتراوح بين بروتينات الغشاء هومومولتيميريك نانو-الكائنات، هو غالباً ما تكون محدودة سنمر بالحاجة إلى مغ-كميات المواد نظير مسماة. التطورات التكنولوجية الحديثة في سرعة فائقة سنمر ماس (إيه وان زيرو زيرو كيلو هرتز) تفتح السبيل إلى 1الرنين المغناطيسي الكشف عن ح، ودفع الحد الأقصى لكمية العينة الحد الأدنى إلى sub-مغ 72،،من7374. على الرغم من ذلك، هي عينات المسمى ج 13للدراسات الهيكلية التفصيلية ضرورية، مما يحد من تطبيق سنمر إلى عينات جمعت في المختبر أو إلى نظم المعرب عنها في الكائنات الحية التي البقاء على قيد الحياة في المتوسط الأدنى حيث في الخلية سنمر أسلوب ناشئة (للاطلاع انظر ملاحظات 75،،من7677،78).
هو عامل هام في تطبيق سنمر للحصول على هياكل ثلاثية الأبعاد ذات الدقة العالية الاستبانة الطيفية: التغاير conformational المضمنة في تجميع يمكن أن تحد من التحليل الطيفي القرار والأطياف. العلامات المحددة 13ج بقايا يمكن في بعض الحالات توفير بديل للحصول على معلومات المسافة المحددة على بقايا الاستراتيجي بغية الحصول على النماذج الهيكلية (بالنسبة الأخيرة أمثلة انظر 79،80).
سنمر لتصميم هيكل ثلاثي الأبعاد لا يزال يحتاج إلى جمع عدة مجموعات البيانات مع البيانات طويلة وكثيراً ما جمع الأوقات على أدوات متطورة، تبعاً للنهج والنظام عدة أيام إلى أسابيع 600-1000 ميغاهيرتز (تردد1ح) مطياف. ولذلك، يمكن الوصول إلى وقت مطياف عاملاً مقيداً في سنمر دراسة متعمقة.
وفي حالة الجمعيات البروتين هومومولتيميريك، مما أدى إلى البيانات سنمر من نوعية كافية لتحديد عدد كبير من القيود الهيكلية كما هو الحال في 3،57،،من6470, سنمر لا يزال يعطي لا الوصول إلى الأبعاد المجهرية. ولذلك، في تصميم هيكل سنمر حيثياته جمعية هومومولتيميريك، م أو الكتلة الواحدة طول البيانات (MPL) مثالي تكمل البيانات سنمر لاشتقاق المعلمات التماثل. وتوفر البيانات سنمر وحدها داخل الذري وواجهات الجزيئات
سنمر تكميلية عالية مع تقنيات الهيكلية مثل القياسات EM أو المكتبة ولكن يمكن أيضا تماما الجمع بين البيانات مع الهياكل الذرية التي حصل عليها علم البلورات بالأشعة السينية أو الرنين المغناطيسي النووي الحل على مفارز تحور أو مبتوراً. يمكن العثور على عدد متزايد من الدراسات في الأدب حيث سمح تزامن البيانات الهيكلية المختلفة لتحديد نماذج ثلاثية الأبعاد الذرية من الجزيئات الجمعيات (انظر الشكل 6 للأمثلة التمثيلية).
في ميدان "البيولوجيا الهيكلية"، سنمر يبرز كتقنية واعدة لدراسةغير قابلة للذوبان وغير البلورية التجميعات في الذرية المستوى، أي توفير هيكلية البيانات في الجدول الذري. وفي هذا الصدد، هو سنمر القلادة إلى حل الرنين المغناطيسي النووي وعلم البلورات بالأشعة السينية للتجميعات الجزيئي، بما في ذلك البروتينات الغشاء على جمعيات البيئة والبروتين الأصلي مثل مغلفات الفيروسية، وخيوط البكتيرية أو أميلويدس، فضلا عن الجيش الملكي النيبالي و الجيش الملكي النيبالي-البروتين المجمعات (انظر على سبيل المثال81). في تطبيقات متعدد الاستخدامات بدرجة في المختبر وفي سياق الخلوية، مثل تعقب التغييرات الهيكلية والثانوي والتعليم العالي ورباعي، تحديد الأسطح التفاعل مع جزيئات شريك في المقياس الذري (على سبيل المثال 82) و رسم الخرائط ديناميات الجزيئية في سياق مجمعات المجمعة، تشير إلى إمكانيات هامة سنمر في المستقبل دراسات الهيكلية على التجميعات الجزيئية البيولوجية المعقدة.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>المكون</td>
			<td>M9 المتوسطة</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كلوريد الصوديوم</td>
			<td>0.5 غرام/لتر</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>خ2ص4</td>
			<td>3 غرام/لتر</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>غ2هبو4</td>
			<td>6.7 غرام/لتر</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>مجسو4</td>
			<td>1 مم</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>زنكل2</td>
			<td>10 ميكرومتر</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>فيكل3</td>
			<td>1 ميكرومتر</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>كاكل2</td>
			<td>100 ميكرومتر</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM فيتامين ميكس 100 X</td>
			<td>10 مل/لتر</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 ج-الجلوكوز</td>
			<td>2 غرام/لتر</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 غرام/لتر</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
الجدول 1: تكوين التعبير أدنى متوسط للبروتين المؤتلف الإنتاج في كولاي الخلايا BL21-

التقدم في الزاوية ماجيك الغزل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي الصلبة (سنمر) توفر أداة فعالة لتحديد خصائص الهيكلية للتجميعات البروتين الجزيئات في قرار ذرية. هذه التجميعات البروتين هي نظم في كل مكان التي تلعب دوراً أساسيا في العديد من العمليات البيولوجية. هياكلها الجزيئي والتفاعلات والديناميات يتم الوصول إليها عن طريق الدراسات سنمر، كما أظهرت الفيروسية (كابسيدس1) وآليات العدوى البكتيرية (إفراز أنظمة2،3، بيلي4)، والغشاء البروتين المجمعات5،6،،من78 والوظيفية أميلويدس 9،،من1011. يمكن أيضا أن تثير هذا النوع من الجمعية الجزيئية الأمراض كما هو الحال في أمراض الأعصاب حيث التجمع في تجمعات، اميلويد الدول البروتينات ويسبب السلوك الشاذ الخلية أو الخلايا وفاة 12،13. غالباً ما يتم بناؤها التجميعات البروتين قبل أوليجوميريزاتيون متماثل من مضاعفات نسخاً من مفارز البروتين في الكائنات سوبراموليكولار كبيرة من مختلف الأشكال بما في ذلك ييفات، خيوط، المسام، وأنابيب، أو جسيمات نانوية. ويعرف هيكل رباعي التفاعلات الضعيفة بين مفارز البروتين لتنظيم الجمعية المكانية والزمانية والسماح للوظائف البيولوجية المتطورة. التحقيقات الهيكلية على نطاق الذري في هذه التجميعات تحديا لتقنيات عالية الدقة منذ على إينسولوبيليتي الذاتية وفي كثير من الأحيان على غير كريستالينيتي يقيد استخدام علم البلورات بالأشعة السينية التقليدية أو حل الرنين المغناطيسي النووي النهج. زاوية ماجيك الغزل سنمر (ماس) هو أسلوب ناشئة للحصول على بيانات القرار الذري على التجميعات الجزيئات غير قابلة للذوبان وأثبتت كفاءتها لحل نماذج ثلاثية الأبعاد الذرية لعدد متزايد من الأنظمة الجزيئية البيولوجية المعقدة، بما في ذلك خيوط البكتيرية وجمعيات اميلويد والجسيمات الفيروسية 14،،من1516،17،،من1819،20، ،من 2122. وقد أنشأت التقدم التقني في مجالات مغناطيسية عالية والتطورات المنهجية وإعداد نموذج "سنمر ماس" إلى وسيلة قوية للتحقيق في البروتينات غير قابلة للذوبان في بيئات مختلفة، لا سيما في تلك الناحية البيولوجية ذات الصلة بالجزيئات جمعت الدولة أو في الأغشية الخلوية، مما يجعل التقنية عالية مكملة الميكروسكوب الإلكتروني cryo. في كثير من الحالات، تميز بدرجة عالية جداً من التماثل هذه التجميعات البروتين. سنمر ماس يستغل هذه الميزة، كما أن جميع وحدات البروتين في تجميع هوموموليكولار نفس الهيكل المحلي وبالتالي تقريبا نفس سنمر التوقيع، الحد بشكل كبير إلى تعقيد التحليل.
بروتوكولا تتسم بكفاءة للدراسات الهيكلية للتجميعات البروتين الجزيئات بماس معتدلة (&#60; 25 كيلو هرتز) سنمر يرد في هذا الفيديو، ويمكن تقسيمها إلى خطوات مختلفة (الشكل 1). وسوف نظهر المراحل الحرجة لسير العمل لدراسة هيكلية سنمر مثالاً على تجميع البروتينات الخيطية (انظر أبرز الخطوات في الشكل رقم 1)، باستثناء تنقية البروتين الوحيدات، مختلفة لكل بروتين الجمعية العامة ولكن من الأهمية الحاسمة للدراسات الهيكلية، ودون الخوض في التفاصيل التقنية/المنهجية سنمر حساب التحليل الطيفي، وهيكل لما البرامج التعليمية المتخصصة على شبكة الإنترنت. في حين أن هذا البروتوكول سوف تركز في المقام الأول على تجارب الرنين المغناطيسي النووي الصلبة المؤداة بموجب شروط ماس، الاستخدام محاذاة البيئات البيولوجية 23،24،،من2526 , 27، مثل محاذاة بيسيليس، تسمح للتحقيق في تشكيل البروتين والتفاعل البروتين البروتين الحيوي في وسائل الإعلام مثل الغشاء دون تكنولوجيا ماس. ونحن سوف تظهر تعبير البروتين وخطوات الجمعية، فضلا عن تسجيل الأطياف سنمر الحاسمة، والتحليل والتفسير. أن هدفنا تقديم رؤى في خط الأنابيب التحليل الهيكلي مما يتيح للقارئ لإجراء دراسة هيكلية الذرية قرار جمعية الجزيئات بتقنيات سنمر.
ويشمل البروتوكول 3 أقسام:
1-الحالة الصلبة إنتاج نموذج الرنين المغناطيسي النووي
شرطا مسبقاً لإجراء تحليل الرنين المغناطيسي النووي الصلبة، مكونات البروتين من الجزيئات الجمعية الحاجة إلى التعبير عن، المسماة النظائر والمنقاه وتجميعها في المختبر في الدولة معقدة مثل أصلي (بالنسبة مثال انظر الشكل 2) . مطلوب تخصيب النظائر في 13ج و 15ن وسم لضمان حساسية الرنين المغناطيسي عالية، من خلال استخدام وسائط التعبير البكتيرية الحد الأدنى تستكمل مع 13ج و 15ن المصادر، مثل شكل موحد 13 ج-يسمى الجلوكوز/الجلسرين و 15NH4Cl على التوالي. في مرحلة لاحقة من البروتوكول، بشكل انتقائي عينات المسمى ج 13المنتجة بشكل انتقائي 13ج-وصفت مصادر مثل (1، 3-13ج)-و (2-13ج)-الجلسرين (أو (1-13ج)-و (2-13ج)- الجلوكوز) وتستخدم لتسهيل تحليل الرنين المغناطيسي النووي. عينة المسمى مختلطة المقابلة لأن خليط اكويمولار أما من 50% 15N-و 50% 13ج المسمى أو 50% (1، 3-13ج)-و 50% (2-13ج)-يتم إدخال الجلوكوز لوصف الكشف عن الجزيئات التفاعلات. درجة عالية من النقاء البروتين، فضلا عن شروط صارمة أثناء الخطوة الجمعية هي العوامل الرئيسية لضمان نظام هيكلية متجانسة من العينة النهائية.
2-أولى توصيف الهيكلية استناداً إلى الحالة الصلبة الرنين المغناطيسي النووي أحادي البعد (1-د)
نحن نقدم هذه التجارب ضرورية لإجراء تحليل هيكلية التي سنمر. أحادي البعد (1-د) عبر الاستقطاب (CP) وعنبة/رينيبت28 التجارب، والكشف عن نواة 13ج تستخدم للكشف عن شرائح البروتين جامدة ومرنة في الجمعية العامة، على التوالي، وتقدير درجة الهيكلية التجانس وتعدد الأشكال المحلية (بالنسبة مثال انظر الشكل 3).
<st></st>رونغ > 3. تحليل كونفورماشونال و 3D تصميم هيكل
قلق الفقرتين الفرعيتين 1 و 2 في التحليل كونفورماشونال، الذي يرتكز على إحالة جميع المخلفات الصلبة الجمعية البروتين، صدى سنمر التحولات الكيميائية هي تحقيقات حساسة جداً للبيئة المحلية، ويمكن استخدامها للتنبؤ phi/المبادرة زوايا زوجية وثم تحديد هيكل الثانوية. ويبين الشكل 4 مثال على مهمة الرنين متسلسلة في صلب جامد جمعية البروتين. تحديد هيكل 3D يستند إلى جمع البيانات الهيكلية مثل إغلاق قيود المسافة ترميز التقارب (&#60; Å 7-9)، التي تتضمن على حد سواء داخل ومعلومات الجزيئات. تصف الفقرتان الفرعيتان 3 و 4 جمع النفس بعيدة المدى وتفسيرها. يتم تعريف اتصالات بعيدة المدى كالتقارب13ج إينتراموليكولار 13ج-الناجمة عن بقايا أنا إلى ياء، مع | i-ي | إيه فور، تحديد وبالتالي إضعاف البروتين العالي فرعية أحادي، أو ك الجزيئات 13ج-13ج التقارب، وتعريف الواجهات الجزيئات بين مفارز البروتين في الجمعية العامة. داخلها وواجهات الجزيئات موضحة في الشكل 5. الكشف عن القيود سنمر من خلال 13ج-13ج وترميز 15N-13ج ريكوبلينج التجارب عادة لمسافات إينتيرنوكليار &#60; 1 نانومتر. ويوضح البند الفرعي 4 الكشف عن قيود المسافة الجزيئات. في التجميعات البروتين متناظرة، استخدام عينات البلوتينيوم المسمى (أي 100% شكل موحد أو بشكل انتقائي المسمى) لتحديد التفاعلات بين الجزيئات وحدة فرعية-فرعية محدودة، ككل داخل-وبينها-موليكولار اتصالات تؤدي إلى إشارات قابلة للاكتشاف. ويتحقق الكشف لا لبس فيه عن التقارب الجزيئات باستخدام عينات المسمى المختلطة، التي تحتوي على خليط مادة اكويمولار من عينتين مسماة بشكل مختلف، جنبا إلى جنب قبل التجميع. ويدخل الجزء الفرعي 5 بإيجاز النمذجة هيكل.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
الشكل 1 : سير العمل دراسة الهيكلية الذرية القرار بالرنين المغناطيسي النووي الصلبة. 13 ج، 15ن النظائر المسمى إنتاج البروتين، تنقية وحدة فرعية، فرعية للجمعية العامة، والسيطرة على تشكيل الجمعية وسنمر التجارب وتحليل التجربة سنمر والاستخراج من قيود المسافة، وتظهر بنية النمذجة. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Instruments</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR Spectrometer (&#62; 11.7 Tesla)</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">triple resonance MAS SSNMR probehead&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SSNMR rotors 4mm</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">K1910</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Centrifuge 5804 R&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5805000629</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">GeneQuant 1300 spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">28-9182-13</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">228001</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MaxQ 4450 bench top orbital shaker</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">78376</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tube Revolver Agitator</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">79547</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sonopuls HD 3100</td>
			<td style="width:117px;">Bandelin</td>
			<td style="width:119px;">3680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MicroPulser electroporator</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">mini-PROTEAN tetra cell system</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AKTA pure system</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-24</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillary microman M25 pipet</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148502</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Materials</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">amiconR ultra-15</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z740199-8EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillaries and pistons</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148112</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">spatula</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13263799</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">D-glucose 13C6</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">389374</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Ammonium-15N-chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">299251</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">1,3 13C2 glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">492639</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">2 13C glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">489484</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K1876</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3416</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7907</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71380</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208094</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Iron Chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">157740</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Zinc chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">793523</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MEM Vitamin Solution (100&#215;)</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M68954</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">IPTG</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tricine</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SDS</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">436143</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sodium azide</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">71289</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">178837</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Softwares</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Unicorn 6.3</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Akta systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">ccpNMR</td>
			<td style="width:117px;">CCPN&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">spectrometer systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy

التجميعات البروتين supramolecular أدواراً أساسية في العمليات البيولوجية التي تتراوح بين المضيف الممرض التفاعل، العدوى الفيروسية للدعوة لاضطرابات الأعصاب. هذه التجميعات تتألف من عدة مفارز البروتين نظمت بطريقة غير التساهمية لتشكل الأجسام الجزيئات الكبيرة التي يمكن تنفيذ مجموعة متنوعة من الوظائف الخلوية أو التسبب في آثار ضارة. الذرية ثاقبة آليات الجمعية وسير عمل هذه الجمعيات الجزيئات تظل غالباً النادرة منذ بهم إينسولوبيليتي الأصيل وغير كريستالينيتي يخفض بشكل كبير وكثيراً ما نوعية البيانات التي تم الحصول عليها من معظم التقنيات وتستخدم في علم الأحياء الهيكلية، مثل حل "الرنين المغناطيسي النووي" (الرنين المغناطيسي النووي) وعلم البلورات بالأشعة السينية. ونقدم هنا الغزل ماجيك-زاوية أطياف الرنين المغناطيسي النووي الصلبة (سنمر) كوسيلة قوية للتحقيق في هياكل الجمعيات الجزيئات في القرار الذري. سنمر يمكن أن تكشف عن تفاصيل الذري في المجمع تجميعها دون قيود الحجم والقابلية للذوبان. البروتوكول المقدمة هنا توضح الخطوات الأساسية من إنتاج 13ج/التجميعات المسماة النظائر الجزيئات بروتين15N للحصول على معيار سنمر الأطياف وتحليلها وتفسيرها. على سبيل مثال، نعرض الأنبوب التحليل الهيكلي سنمر جمعية البروتينات الخيطية.

سير العمل سنمر نموذجي يتضمن العديد من الخطوات الموضحة في الشكل 1. عادة مفارز البروتين هي التي تنتجها في المختبر تعبير مغايرة في كولايوتنقيته وتجميعها تحت تهتز ولكن في بعض الأحيان أيضا في ظروف ثابتة. وتليها التعبير وتنقية فرعية البروتين اللوني هلام مخزونات النشر الاستراتيجي (الشكل 2A). تشكيل جمعيات الجزيئات يمكن أن تؤكده ثم تحليل المجهر الإلكتروني (م) (انظر الشكل 2 على سبيل مثال جمعية الخيطية).
بعد مقدمة للجمعية البروتين إلى الدوار سنمر، الدوار ويتم إدراج والمطياف وينظم تكرار ماس ودرجة الحرارة وتسجل الأطياف. يمكن الحصول على رؤى الأولى بتقنيات سنمر د 1. ويبين الشكل 3 FID سنمر نموذجي الكشف على القناة 13ج على عينة متجانسة هيكلياً بروتين، 1ح13ج CP طيف، كشف الأصداء13ج موجودة في صلب جامد فرعية البروتين في الجمعية العامة، و 2D 1ح-13"ج كفؤ" طائفة، تمثل مخلفات المتنقلة. لرؤى الذري في صلب جامد هيكل الجمعية العامة، متعددة الأبعاد سنمر تجارب بحاجة إلى تسجيلها على شكل موحد وانتقائية المسمى عينات تعيين الأصداء سنمر أولاً وثم الكشف عن التقارب بعيد المدى (انظر الشكل 4 ).
تجهيز جميع الأطياف وتحليلها مع البرامج الكافية تعيين الأصداء سنمر واستخراج داخل وقيود المسافة الجزيئات (الشكل 5). لقيود المسافة سنمر تستخدم أما وحدها أو بالاقتران مع بيانات من التقنيات التكميلية، التي يمكن أن تدمج في برنامج التصميم.
لهياكل ذرية تمثيلية الجمعيات الجزيئات حلها عن طريق تقنيات سنمر يبين الشكل 6 العديد من التجميعات الخيطية من الملاحق البكتيرية وييفات اميلويد.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
الشكل 6:هياكل الجزيئات الخيطية مصممة بأسلوب الرنين المغناطيسي النووي الصلبة: خيوط البكتيرية وبروتين اميلويد ييفات- A) الهياكل 1 نوع من أوروباثوجينيك كولايPDB التعليمات البرمجية 2N7H 4؛ ب) ASC الشعيرة، PDB التعليمات البرمجية 2N1F 63؛ ج) "النوع الثالث" إفراز نظام الإبر، 2MME رموز PDB، 2LPZ و 2MEX 2،،من364؛ د) ييفات AB42 بيتا اميلويد، PDB تعليمات برمجية 2NAO، 5KK3، 2MXU 65،،من6667 وأوساكا متحولة PDB التعليمات البرمجية 2MVX 57، آيوا متحولة PDB التعليمات البرمجية 2MPZ 58؛ ﻫ) ألفا سينوكلين ييفات، 2N0A رمز PDB 68؛ و) المجال بريون HET-s، PDB تعليمات برمجية 2RNM، 2KJ3،من 6970. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

هياكل الجمعيات البروتين سوبراموليكولار في قرار الذرية ذات أهمية عالية نظراً لدورهم الحاسم في مجموعة متنوعة من الظواهر البيولوجية. وهنا، نقدم بروتوكولا لإجراء دراسات الهيكلية ذات الدقة العالية على التجميعات البروتين الجزيئات غير قابلة للذوبان وغير البلورية بالسحر-زاوية الغزل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي الصلبة (سنمر ماس).

الحجم الذري الدراسات الهيكلية للتجميعات الجزيئات بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي الصلبة

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Interpreting Nuclear Magnetic Resonance Spectra

SCIENTISTS IN ACTION

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

النووي التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي لتحديد Phosphorylations متعددة من جوهريا المختلين البروتينات

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

قياس تفاعلات البروتينات كروي والخيطية مطيافية الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي) وعبارة ثيرموفوريسيس (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

الدراسات الهيكلية "للجزيئات الكبيرة" في الحل باستخدام "تبعثر الأشعة السينية زاوية صغيرة"

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

إعداد الفطريات والمواد النباتية لتوضيح الهيكلية باستخدام الرنين المغناطيسي النووي الصلبة دينامية الاستقطاب النووي

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

تصوير الحويصلات خارج الخلية عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

الطيفية الامتصاص الذري لقياس برك الزنك داخل خلايا الثدييات

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

وصف مجاميع البروتين الفردية عن طريق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

التسمية خاليه ايمونوبريسيبيتيشن الطيف الطيفي سير العمل لتحديد المواقع النووية علي نطاق واسع التنميط

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

إزالة واستبدال الليغندات الذاتية من البروتينات والمواد المسببة للحساسية المرتبطة بالدهون

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...