Name: atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

Dette arbejde er finansieret af ANR (13-PDOC-0017-01 til B.H. og ANR-14-CE09-0020-01 til A.L.), "Investeringer for fremtiden"-programmet IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 til B.H.) reference ANR-10-IDEX-03-02 til B.H., Fondation pour la Recherche Médicale ( FRM-AJE20140630090 til A.L.), FP7 programmet (RP7-folk-2013-CIG til A.L.) og det Europæiske Forskningsråd (ERC) under EUs Horisont 2020 forskning og innovation program (ERC starter tilskud til A.L., aftale nej 639020) og projektet " WEAKINTERACT."

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Solid-State NMR (SSNMR) er en metode til kendetegner makromolekylære protein forsamlinger på atomare niveau. Et af de centrale spørgsmål i SSNMR-baserede struktur bestemmelse er den spektrale kvaliteten af den undersøgte ordning, der giver mulighed for oprettelse af 3D strukturelle modeller af forskellige præcision, typisk lige fra lav opløsning modeller (indeholdende sekundært Strukturere elementer og lille 3D-oplysninger) til pseudo atomic 3D strukturer. Mængden og kvaliteten af strukturelle oplysninger fra multi-dimensionelle SSNMR eksperimenter er nøglen til at beregne en høj opløsning NMR strukturen i forsamlingen.
Den beskrevne protokol er baseret på påvisning af 13C -13C og 15N -13C strukturelle begrænsninger der kræver registrering af flere 2D (og undertiden 3D) spektre med høj signal til støj. Ved moderat frekvenser og MAS (&#60; 25 kHz), prøven er indført i rotorer med størrelser på 3.2-4 mm i diameter giver mulighed for protein mængder på op til ~ 50 mg, afhængig af prøven hydrering. Mængden af prøven inde rotoren er direkte proportional med signal-støj-forholdet i SSNMR spektre, en afgørende faktor for påvisning af langtrækkende afstand begrænsninger og deres entydige tildeling.
Den spektrale opløsning er et afgørende parameter under sekventiel resonans tildeling og samlingen begrænsninger. For at opnå optimale resultater skal skal prøve forberedelse parametrene optimeres, navnlig i rensning af subunit og forsamling betingelser (pH, buffer, rysten, temperatur, osv.). For eksempel optimering anbefales det at forberede umærkede prøverne for flere forskellige betingelser som forsamling er blevet observeret og registrere en 1D 1H -13C CP spektrum (beskrevet i trin 2.1) på hver forbehandlede prøve. Spektre tjene til at sammenligne spektrale opløsning og spredningen mellem de forskellige præparater, baseret på hvor de optimale betingelser kan bestemmes.
Kvaliteten af SSNMR dataene afhænger stærkt valg af NMR erhvervelse parametre, især for polarisering overførsel trin. Brugen af høj magnetisk feltstyrke (≥600 MHz 1H frekvens) er afgørende for høj følsomhed og spektrale opløsning, kræves, når står over for komplekse mål såsom makromolekylære protein forsamlinger.
En begrænsende faktor i mange tilfælde er spektrometer tilgængelighed. Derfor bør et velovervejet valg af prøverne forberedes forud spektrometer session. I hvert fald, en ensartet 13C, 15N-mærket prøve er en forudsætning for at udføre den sekventielle og intra resterende resonans tildeling. Se71for proteiner tildelt af solid-state NMR teknikker. Struktur bestemmelse af makromolekylære assemblies ved moderat frekvenser og MAS kræver selektivt 13C-mærket prøver; til påvisning af langtrækkende 13C -13C og 13C -15N kontakter prøver baseret på 1,3 -13C- og 2 -13C-gylcerol og/eller 1 -13C- og 2 -13C-glucose mærkning er almindeligvis anvendes, som beskrevet ovenfor. Valget mellem de to mærkning ordninger er baseret på den spektrale signal / støj-forhold og opløsning. For at skelne mellem intra- og intermolekylære langtrækkende kontakter, har blandet mærket og fortyndede prøver afsløret effektivt.
Kort sagt, de kritiske trin for en atomic SSNMR strukturelle undersøgelse er: (i) udarbejdelse af underenheder og forsamling skal optimeres til at opnå fremragende prøve mængde og kvalitet, (ii) spektrometer felt styrken og Køb parametre skal være valgt omhyggeligt; (iii) selektive mærkning strategier er nødvendig for en 3D-struktur beslutsomhed og mængden af krævede data afhænger af oplysningernes kvalitet og tilgængelighed af supplerende data.
Trods dens anvendelighed til en bred vifte af Supramolekylær systemer spænder fra Membranproteiner til homomultimeric nano-objekter, er SSNMR ofte begrænset af behovet for mg-mængder af brændselsfremstilling navngivet materiale. Seneste teknologiske udvikling i ultra-hurtig MAS (≥100 kHz) SSNMR åbne op avenue til 1H-opdaget NMR, og tryk grænsen for minimal vareprøveantal og sub-mg 72,73,74. Ikke desto mindre for detaljerede strukturelle studier er 13C-mærket prøver uundværlig, som begrænser anvendelsen af SSNMR til prøverne samles i in vitro eller systemer udtrykt i organismer, der overlever på minimal medium hvor i celle SSNMR er en spirende metode (for anmeldelser Se 75,76,77,78).
En vigtig faktor i SSNMR ansøgning om at få høj opløsning 3D strukturer er den spektrale opløsning: iboende konformationelle heterogenitet i en forsamling kan begrænse opløsning og spectra spektralanalyse. Rest specifikke 13C mærkning kan i nogle tilfælde give et alternativ for at få specifikke afstand oplysninger om strategiske restkoncentrationer for at opnå strukturelle modeller (for en nyere eksempler Se 79,80).
SSNMR for 3D-struktur bestemmelse kræver stadig indsamling af flere datasæt med ofte lange data indsamling gange på avancerede instrumenter, afhængigt af tilgangen og system flere dage til uger på en 600-1000 MHz (1H frekvens) spektrometer. Adgang til spektrometer tid kan derfor være en begrænsende faktor i en SSNMR undersøgelse.
I tilfælde af homomultimeric protein forsamlinger, fører til SSNMR data af tilstrækkelig kvalitet til at identificere et stort antal af strukturelle begrænsninger såsom i 3,57,64,70, SSNMR stadig giver ikke adgang til de mikroskopiske dimensioner. Derfor, i en de novo SSNMR struktur bestemmelse af en homomultimeric forsamling, EM eller masse pr. længde (MPL) data ideelt supplement SSNMR data for at udlede symmetri parametrene. SSNMR data alene give atomic intra- og intermolekylære grænseflader
SSNMR er et stærkt supplement med strukturelle teknikker som EM eller MPL målinger, men data kan også perfekt kombineres med atomic strukturer fremkommer ved røntgenkrystallografi eller løsning NMR på muterede eller afkortede underenheder. Et stigende antal undersøgelser kan findes i litteraturen hvor sammen af forskellige strukturelle data har lov til at bestemme atomic 3D modeller af makromolekylære forsamlinger (Se figur 6 for repræsentative eksempler).
Inden for strukturbiologi fremstår SSNMR som lovende teknik til at studereuopløseligt og ikke-krystallinsk forsamlinger på det atomare niveau, dvs giver strukturelle data på atomar skala. I denne henseende, SSNMR er vedhæng til løsning NMR og røntgenkrystallografi for Molekylær forsamlinger, herunder Membranproteiner i deres oprindelige miljø og protein forsamlinger såsom viral konvolutter, bakteriel filamenter eller amyloids, samt RNA og RNA-protein komplekser (Se for eksempel81). Dens meget alsidige programmer i in vitro og i cellulære forbindelse, såsom sporing af sekundær, tertiær og kvaternære strukturelle ændringer, identificere interaktion overflader med partner molekyler på atomar skala (for eksempel 82) og kortlægning af Molekylær dynamik i forbindelse med samlet komplekser, angive SSNMR vigtigt potentiale i fremtidige strukturelle undersøgelser af komplekse Biomolekylær forsamlinger.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>M9 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0,5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6,7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin mix 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C-glukose</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel 1: Sammensætning af minimal udtryk medium for rekombinante protein produktion i E. coli BL21 celler.

Fremskridt i magic angle spinning solid-state Kernemagnetisk resonans-spektroskopi (SSNMR) tilbyder et effektivt redskab til strukturel karakterisering af makromolekylære protein forsamlinger på en atomic opløsning. Disse protein forsamlinger er allestedsnærværende systemer, der spiller en afgørende rolle i mange biologiske processer. Deres molekylære strukturer, interaktioner og dynamik er tilgængelig af SSNMR undersøgelser, som har været vist viral (capsids1) og bakteriel infektion mekanismer (sekretion systemer2,3, pili4), membran protein komplekser5,6,7,8 og funktionelle amyloids 9,10,11. Denne type af molekylære forsamling kan også provokere patologier såsom i neurodegenerative sygdomme, hvor proteiner samles i fejlfoldede, amyloid stater og forårsage afvigende celle adfærd eller celle død 12,13. Protein forsamlinger er ofte bygget af den symmetriske oligomerisering af multipla kopier af protein-underenheder i store Supramolekylær objekter af forskellige figurer herunder fibriller, filamenter, porer, rør eller nanopartikler. Kvaternære arkitekturen er defineret af svage interaktioner mellem protein underenheder til at organisere den rumlige og tidsmæssige forsamling og giver mulighed for avancerede biologiske funktioner. Strukturelle undersøgelser på en atomar skala på disse forsamlinger er en udfordring for høj opløsning teknikker siden deres iboende kan og meget ofte deres ikke-crystallinity begrænser brugen af konventionelle røntgenkrystallografi eller løsning NMR tilgange. Magic angle spinning (MAS) SSNMR er en spirende teknik til at opnå atomare opløsning data om uopløselige makromolekylære forsamlinger og har bevist sin effektivitet til at løse 3D atomic modeller for et stigende antal komplekse Biomolekylær systemer herunder bakteriel filamenter, amyloid forsamlinger og viruspartikler 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Tekniske fremskridt på høje magnetfelter, metodologiske udviklinger og prøveforberedelse har etableret MAS SSNMR i en robust metode til at undersøge uopløselige proteiner i forskellige miljøer, især i deres biologisk relevante makromolekylære samlet stat eller i cellemembranerne, hvilket gør teknikken meget komplementære til kryo-elektronmikroskopi. I mange tilfælde karakteriserer en meget høj grad af symmetri sådanne protein forsamlinger. MAS SSNMR udnytter denne funktion, som alle protein underenheder i en homomolecular forsamling ville have den samme lokale struktur og derfor stort set samme SSNMR signatur, drastisk at reducere kompleksiteten af analysen.
En effektiv protokol for strukturelle undersøgelser af makromolekylære protein forsamlinger af moderat MAS (&#60; 25 kHz) SSNMR præsenteres i denne video og kan opdeles i forskellige trin (figur 1). Vi vil demonstrere de kritiske stadier af arbejdsprocessen en SSNMR strukturelle studier eksemplificeret på en tråddannende protein Forsamling (se det markerede skridt i figur 1), med undtagelse af protein-underenheder rensning, forskellige for hver protein forsamling men af afgørende betydning for strukturelle studier, og uden at gå nærmere ind på tekniske/metodiske SSNMR spektroskopi og struktur beregning for hvad specialiserede tutorials er tilgængelige online. Mens denne protokol vil primært fokusere på solid-state NMR eksperimenter udført MAS betingelser, tilpasset brug af biologiske miljøer 23,24,25,26 , 27, såsom justeret bicelles, giver mulighed for undersøgelse af protein kropsbygning og dynamisk protein-protein interaktion i membran-lignende medier uden MAS teknologi. Vi vil vise protein udtryk samt forsamlingen trinene og optagelse af afgørende SSNMR spektra og deres analyse og fortolkning. Vores mål er at give indsigt i den strukturelle analyse pipeline gør det muligt for læseren at udføre en atomic-opløsning strukturelle undersøgelse af en makromolekylære forsamling af SSNMR teknikker.
Protokollen omfatter 3 sektioner:
1. solid-state NMR prøve produktion
Som en forudsætning for en solid-state NMR-analyse, proteinkomponenter makromolekylære forsamling skal udtrykkes, isotop-mærket, renset og samlet i vitro i native-lignende kompleks tilstand (for et eksempel Se figur 2) . For at sikre høj NMR følsomhed, er isotop berigelse i 13C og 15N mærkning påkrævet ved brug af minimal bakteriel expression media suppleret med 13C og 15N kilder, såsom ensartet 13 C-mærket glukose/glycerol og 15NH4Cl henholdsvis. I det senere i protokollen-selektivt 13C-mærket prøver fremstillet med selektivt 13C-mærket kilder såsom (1,3 -13C)- og (2 -13C)-glycerol (eller (1 -13C)- og (2 -13C)- glukose) bruges til at lette NMR-analyse. Blandet mærket stikprøve svarende til en equimolar blanding af enten 50% 15N- og 50% 13C-mærket eller 50% (1,3 -13C)- og 50% (2 -13C)-glucose er indført for at beskrive påvisning af intermolekylære interaktioner. En høj grad af protein renhed samt strenge betingelser under trinnet forsamling er vigtige faktorer til at forsikre en homogen strukturel orden af slutprøven.
2. foreløbig strukturel karakterisering baseret på endimensional (1D) solid-state NMR
Vi præsenterer de væsentlige forsøg for en strukturel analyse af SSNMR. Endimensional (1D) Kors-polarisering (CP) og INEPT / RINEPT28 eksperimenter, fundet på 13C kerner bruges til at registrere stive og fleksible protein segmenter i forsamlingen, henholdsvis og vurdere graden af struktur ensartethed og lokale polymorfisme (for et eksempel Se figur 3).
<st></st>Rong > 3. Konformationelle analyse og 3D struktur bestemmelse
Underafdeling 1 og 2 vedrører den konformationelle analyse, som er baseret på SSNMR resonans tildeling af alle stiv rester af protein forsamling, som de kemiske Skift er meget følsomme sonder til det lokale miljø og kan bruges til at forudsige phi/psi planer vinkler og bestemme derved den sekundær struktur. Figur 4 viser et eksempel på en sekventiel resonans tildeling i stive kernen af en protein forsamling. 3D-struktur bestemmelse er baseret på indsamling af strukturelle oplysninger såsom afstand begrænsninger kodning lukke nærliggende (&#60; 7-9 Å), der indeholder både intra- og intermolekylære oplysninger. Underafdeling 3 og 4 beskriver langtrækkende Fjern tilbageholdenhed indsamling og fortolkning. Langtrækkende kontakter er defineret som intramolekylære 13C -13C nærliggende som følge af restkoncentrationer jeg j, med | i-j | ≥4, definere dermed tertiære protein fold af monomere subunit, eller som intermolekylære 13C -13C proximities, definere de intermolekylære grænseflader mellem protein underenheder i forsamlingen. Intra- og intermolekylære grænseflader er illustreret i figur 5. SSNMR begrænsninger opdaget gennem 13C -13C og 15N -13C produktionsnedgang eksperimenter normalt indkode for internuclear afstande &#60; 1 nm. Underafdeling 4 forklarer påvisning af intermolekylære afstand begrænsninger. I symmetriske protein forsamlinger, brugen af administrationsprocedurerne mærket prøver (dvs. 100% ensartet eller selektivt mærket) for at identificere intermolekylære subunit-subunit interaktioner er begrænset, som både intra - og Inter-Diesel - molecular kontakter føre til påviselige signaler. Entydig påvisning af intermolekylære proximities er opnået ved hjælp af blandet mærket prøver, indeholdende en equimolar blanding af to anderledes mærket prøver, kombineret inden sammenlægning. Underafdeling 5 kort introducerer strukturen modellering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
Figur 1 : Arbejdsproces en atomic-opløsning strukturelle studier af solid-state NMR. 13 C, 15N isotop mærket protein produktion, subunit rensning, subunit forsamling, kontrol af forsamling dannelse, SSNMR forsøg, SSNMR eksperiment analyse og udvinding af afstand begrænsninger og struktur modellering er vist. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Instruments</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR Spectrometer (&#62; 11.7 Tesla)</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">triple resonance MAS SSNMR probehead&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SSNMR rotors 4mm</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">K1910</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Centrifuge 5804 R&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5805000629</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">GeneQuant 1300 spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">28-9182-13</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">228001</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MaxQ 4450 bench top orbital shaker</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">78376</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tube Revolver Agitator</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">79547</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sonopuls HD 3100</td>
			<td style="width:117px;">Bandelin</td>
			<td style="width:119px;">3680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MicroPulser electroporator</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">mini-PROTEAN tetra cell system</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AKTA pure system</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-24</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillary microman M25 pipet</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148502</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Materials</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">amiconR ultra-15</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z740199-8EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillaries and pistons</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148112</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">spatula</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13263799</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">D-glucose 13C6</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">389374</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Ammonium-15N-chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">299251</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">1,3 13C2 glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">492639</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">2 13C glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">489484</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K1876</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3416</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7907</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71380</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208094</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Iron Chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">157740</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Zinc chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">793523</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MEM Vitamin Solution (100&#215;)</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M68954</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">IPTG</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tricine</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SDS</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">436143</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sodium azide</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">71289</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">178837</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Softwares</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Unicorn 6.3</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Akta systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">ccpNMR</td>
			<td style="width:117px;">CCPN&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">spectrometer systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy

Supramolekylær kemi protein forsamlinger spiller en grundlæggende rolle i biologiske processer lige fra vært-patogen interaktion, viral infektion for udbredelse af neurodegenerative sygdomme. Sådanne forsamlinger består i flere protein underenheder organiseret i en ikke-kovalente måde at danne store makromolekylære objekter, der kan udføre en række cellulære funktioner eller forårsage skadelige konsekvenser. Atomic indsigt i forsamlingen mekanismer og driften af disse makromolekylære forsamlinger forbliver ofte knappe siden deres iboende kan og ikke-crystallinity ofte drastisk reducerer kvaliteten af oplysningerne fra de fleste teknikker bruges i strukturbiologi, såsom røntgenkrystallografi og løsning Kernemagnetisk resonans (NMR). Her præsenterer vi magic angle spinning solid-state NMR spektroskopi (SSNMR) som en kraftfuld metode til at undersøge strukturer af makromolekylære forsamlinger på atomare opløsning. SSNMR kan afsløre atomic detaljer på de forsamlede kompleks uden størrelse og opløselighed begrænsninger. Protokollen præsenteres her beskriver de væsentlige skridt fra produktionen af 13C /15N isotop-mærket makromolekylære protein forsamlinger til erhvervelse af standard SSNMR spektra og deres analyse og fortolkning. Som et eksempel viser vi pipeline af en SSNMR strukturel analyse for en tråddannende protein forsamling.

Den typiske SSNMR workflow omfatter flere trin illustreret i figur 1. Normalt er protein-underenheder produceret ved in vitro- Heterolog ekspression i E. coli, renset og samlet under omrystning, men undertiden også under statiske forhold. Proteinekspression og -oprensning af protein-underenheder er efterfulgt af SDS gel kromatografi (figur 2A). Dannelsen af makromolekylære forsamlinger kan derefter bekræftes ved elektronmikroskopi (EM) analyse (Se figur 2B for et eksempel på en tråddannende forsamling).
Efter indførelsen af protein forsamlingen i SSNMR rotor, rotoren er indsat i spektrometeret, MAS frekvens og temperatur reguleres og spektre registreres. Første indsigt kan opnås ved 1D SSNMR teknikker. Figur 3 viser en typisk SSNMR FID opdaget på 13C-kanal på et strukturelt homogene protein prøve, en 1H -13C CP spektrum, afslørende13C resonanser i stive kernen af protein-underenheder i den forsamling, og en 2D 1H -13C UDUELIGE spektrum, der repræsenterer de mobile restkoncentrationer. Atomic indsigt i de stive kerne af samlingsstrukturen skal multidimensional SSNMR eksperimenter registreres på ensartet og selektivt mærket prøver først tildele SSNMR resonanser og derefter registrere langtrækkende proximities (Se figur 4 ).
Alle spektre behandles og analyseres med passende software til at tildele SSNMR resonanser og udtrække intra- og intermolekylære afstand begrænsninger (figur 5). SSNMR afstand begrænsninger anvendes enten alene eller sammen med data fra supplerende teknikker, som kan integreres i programmet modellering.
For repræsentative atomic strukturer af makromolekylære forsamlinger løst af SSNMR teknikker illustrerer figur 6 flere trådet samlinger fra bakteriel vedhæng og amyloid fibriller.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
Figur 6:trådformede makromolekylære strukturer bestemmes af en solid-state NMR tilgang: bakteriel filamenter og amyloid protein fibriller. A) Type 1 pilus af uropathogenic E. coli, FBF kode 2N7H 4; B) ASC glødetråd, FBF kode 2N1F 63; C) Type III sekretion system nåle, FBF koder 2MME, 2LPZ og 2MEX 2,3,64; D) Amyloid beta AB42 fibriller, FBF kode 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 og Osaka mutant FBF kode 2MVX 57, Iowa mutant FBF kode 2MPZ 58; E) Alpha-synuclein fibriller, FBF kode 2N0A 68; F) HET-s prion domæne, FBF kode 2RNM, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Strukturer af Supramolekylær protein forsamlinger på atomare opløsning er for høj relevans på grund af deres afgørende roller i en række forskellige biologiske fænomener. Heri, præsenterer vi en protokol til at udføre høj opløsning strukturelle studier på uopløseligt og ikke-krystallinsk makromolekylære protein forsamlinger af magic-angle spinning solid-state Kernemagnetisk resonans-spektroskopi (MAS SSNMR).

Atomar skala strukturelle undersøgelser af makromolekylære forsamlinger af Solid-state Kernemagnetisk resonans-spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Interpreting Nuclear Magnetic Resonance Spectra

SCIENTISTS IN ACTION

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for Identifikation af flere fosforyleringer af Intrinsically Disordered Proteiner

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Måling af interaktioner af kugleformede og fintrådede proteiner af Kernemagnetisk resonans-spektroskopi (NMR) og individuel Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturelle undersøgelser af makromolekyler i løsning ved hjælp af små vinkel X-Ray spredning

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Forberedelse af svampe og plantematerialer for strukturelle udredning ved hjælp af dynamisk nuklear polarisering Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Billeddannelse af ekstracellulære vesikler ved atomkraften mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomabsorptionsspektroskopi til måling af intracellulære zink puljer i pattedyrsceller

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisering af individuelle protein aggregater ved infrarød Nanospektroskopi og atomkraften mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri Immunoprecipitation massespektrometri workflow for storstilet nuklear Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Fjernelse og udskiftning af endogene ligands fra Lipid-Bound Proteiner og allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...