Name: atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00
Duration: 14 min 55 s
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Diese Arbeit wird finanziert durch die ANR (13-PDOC-0017-01 B.H und ANR-14-CE09-0020-01, A.L.), "Investitionen in die Zukunft" Programm IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016, B.H) verweisen ANR-10-IDEX-03-02, b.h., die Fondation pour la Recherche Médicale ( FRM-AJE20140630090, A.L.), das RP7-Programm (RP7-Menschen-2013-CIG, A.L.) und der European Research Council (ERC) unter der Europäischen Union Horizont 2020 Forschung und Innovation Programm (ERC Starting Grant, A.L., Übereinkommen Nr. 639020) und Projekt " WEAKINTERACT."

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Festkörper-NMR (NMR) ist eine Methode der Wahl für die Charakterisierung von Proteinen makromolekularen Versammlungen auf atomarer Ebene. Eines der zentralen Themen in NMR-basierte Strukturaufklärung ist die spektrale Qualität des untersuchten Systems, das ermöglicht die Schaffung struktureller 3D-Modelle von verschiedenen Präzision, in der Regel reichen von niedrig aufgelöste Modelle (mit den sekundären Elemente und wenig 3D Informationen strukturieren), Pseudo-3D Atomstrukturen. Die Quantität und Qualität von strukturellen Informationen aus mehrdimensionale NMR-Experimente ist der Schlüssel um eine hochauflösende NMR-Struktur der Versammlung zu berechnen.
Das beschriebene Protokoll stützt sich auf die Erkennung von 13C -13C und 15N -13C strukturelle Beschränkungen, erfordern die Aufnahme von mehreren 2D (und manchmal 3D) Spektren mit hohen Signal-Rausch. Bei moderaten MAS Frequenzen (&#60; 25 kHz), die Probe wird in Rotoren mit Größen von 3,2-4 mm Durchmesser ermöglicht Proteinmengen von bis zu ~ 50 mg, abhängig von der Probe Hydratation eingeführt. Die Menge der Probe in der Rotor ist direkt proportional zu den Signal-Rausch-Verhältnis in NMR-Spektren, ein entscheidender Faktor für die Erkennung von weiträumigen Entfernung Fesseln und ihre eindeutige Zuordnung.
Die spektrale Auflösung ist ein entscheidender Parameter bei der sequentiellen Resonanz-Zuordnung und die Fesseln-Sammlung. Um optimale Ergebnisse zu erzielen, müssen die Probe Vorbereitung Parameter optimiert werden, besonders bei der Reinigung der Untereinheit und Montagebedingungen (pH-Wert, Puffer, Zittern, Temperatur, etc.). Für Probe-Optimierung empfiehlt es sich, unbeschriftete Proben vorzubereiten für mehrere unterschiedliche, die Bedingungen für die Montage beobachtet wurde, und ein 1D 1H -13C CP Spektrum (in Schritt 2.1 beschrieben) auf jede vorbereitete Probe aufzeichnen. Die Spektren dienen zu vergleichen, spektrale Auflösung und Streuung zwischen den verschiedenen Zubereitungen, basierend auf deren optimalen Bedingungen ermittelt werden können.
Die Qualität der NMR-Daten hängt stark von der Wahl der NMR-Aufnahmeparameter, vor allem für die Polarisation Transfer Schritte. Die Verwendung von hohen Magnetfeldstärken ( 1H-Frequenz ≥600 MHz) ist Voraussetzung für hohe Empfindlichkeit und spektrale Auflösung erforderlich, wenn komplexe Ziele wie makromolekularen Protein Baugruppen vor.
Ein limitierender Faktor in vielen Fällen ist die Spektrometer-Verfügbarkeit. Daher sollte eine vernünftige Auswahl der Proben vorbereitet werden die Spektrometer-Sitzung vorausgehen. In jedem Fall, eine einheitlich 13C, 15N beschriftet Probe ist eine Voraussetzung für die sequentielle und Intra residual Resonanz Zuweisung durchzuführen. Proteine vom Festkörper-NMR-Techniken finden Sie unter71. Strukturaufklärung von makromolekularen Versammlungen auf moderate MAS Frequenzen erfordert selektiv 13C-markierten Proben; für die Erkennung von Langstrecken- 13C -13C und 13C -15N Proben basierend auf 1,3 - Kontakte13C- und 2 -13C-Gylcerol und/oder 1 -13C- und 2 -13C-Glukose Kennzeichnung sind häufig verwendet, wie oben beschrieben. Die Wahl zwischen zwei Kennzeichnung Systeme basiert auf der spektralen Signal-Rausch-Verhältnis und der Auflösung. Zur Unterscheidung zwischen Intra- und intermolekularen weitreichende Kontakte ergaben beschriftete und verdünnte Mischproben effizient.
Kurz gesagt, die entscheidenden Schritte für eine atomare NMR strukturelle Studie sind: (i) die Vorbereitung der Untereinheiten und Montage müssen optimiert werden, ausgezeichnete Probenmenge und Qualität zu erhalten, (Ii) Spektrometer-Parameter für Feld Stärke "und" Erwerb müssen sein sorgfältig ausgewählt; (Iii) selektive Strategien zur Kennzeichnung sind erforderlich für eine 3D-Struktur und die erforderliche Datenmenge hängt die Qualität der Daten und der Verfügbarkeit von ergänzenden Daten.
Trotz seiner Anwendbarkeit auf eine Vielzahl von supramolekularen Systemen von Membranproteinen bis hin zu Homomultimeric Nano-Objekte ist NMR oft durch die Notwendigkeit der mg-Mengen isotopisch beschriftete Material begrenzt. Die jüngsten technologischen Entwicklungen in Ultra-schnelle MAS (≥100 kHz) NMR eröffnen die Allee 1H erkannt NMR, und schieben die Grenze der geringe Probenmenge zu Sub-mg 72,73,74. 13C-markierten Proben sind für strukturelle Detailstudien jedoch unverzichtbar, die schränkt die Anwendung der NMR Proben montiert in Vitro oder Systeme ausgedrückt in Organismen, die auf minimaler Medium zu, wo überleben in der Zelle NMR ist eine neue Methode (für Bewertungen 75,76,77,78siehe).
Ein wichtiger Faktor im NMR Anwendung, hochauflösende 3D Strukturen zu erhalten ist die spektrale Auflösung: intrinsische Konformationsänderungen Heterogenität in einer Baugruppe kann Auflösung und Spektren Spektralanalyse einschränken. Rückstände spezifische 13C Kennzeichnung können in manchen Fällen eine Alternative zu bestimmten Abstand über strategische Rückstände zu informieren um strukturelle Modelle (für eine aktuelle Beispiele siehe 79,80) zu erhalten.
NMR für 3D Strukturbestimmung erfordert noch die Sammlung von mehreren Datensätzen mit oft langen Daten Abholzeiten auf ausgefeilte Instrumente, je nach der Ansatz und das System mehrere Tage bis Wochen auf einem 600-1000 MHz (1H-Frequenz) Spektrometer. Daher kann der Zugang zum Spektrometer Zeit ein limitierender Faktor in einer eingehenden Studie NMR.
Bei Homomultimeric Protein Baugruppen zur NMR-Daten von ausreichender Qualität, eine hohe Anzahl von strukturellen Beschränkungen wie in 3,57,64,70, NMR zu identifizieren gibt immer noch keinen Zugang zu den mikroskopischen Dimensionen. Daher ergänzen eine de Novo NMR Strukturaufklärung einer Homomultimeric Versammlung, EM oder Masse pro Länge (MPL) Daten im Idealfall NMR-Daten, um die Symmetrie Parameter ableiten. NMR-Daten allein bieten die atomare Intra- und intermolekularen Schnittstellen
NMR ist höchst komplementär mit strukturellen Techniken wie EM oder MPL Messungen, sondern die Daten ist auch perfekt kombinierbar mit atomaren Strukturen durch Röntgen-Kristallographie oder Lösung NMR auf mutierte oder abgeschnittene Untereinheiten erhalten. Eine wachsende Zahl von Studien kann in Literatur gefunden werden, wo die Verbindung von verschiedenen Strukturdaten zur Bestimmung atomarer 3D-Modelle von makromolekularen Versammlungen (siehe Abbildung 6 für repräsentative Beispiele) erlaubt hat.
Im Bereich der Strukturbiologie entpuppt sich NMR als vielversprechende Technik studierenunlösliche und nichtkristalline Assemblys auf atomarer Ebene, d. h. die Strukturdaten auf atomarer Skala. In dieser Hinsicht NMR ist das Gegenstück zur Lösung NMR und Röntgen-Kristallographie für molekulare Baugruppen, einschließlich Membranproteine in ihren nativen Umgebung und Protein Versammlungen wie virale Umschläge, bakterielle Filamente oder amyloiden sowie RNA und RNA-Protein-komplexe (siehe zum Beispiel81). Die äußerst vielseitige Anwendungen in-vitro- und in der zellulären Kontext, z. B. verfolgen von sekundären, tertiären und quartären strukturelle Änderungen, Interaktion Oberflächen mit Partner Moleküle auf atomarer Skala (z. B. 82) zu identifizieren und Mapping Molekulardynamik im Zusammenhang mit der montierten Anlagen zeigen das wichtige Potenzial der NMR in zukünftige strukturelle Studien bei komplexen biomolekularen Baugruppen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponente</td>
			<td>M9 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0,5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6,7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM-Vitamin-Mix 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C-Glukose</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabelle 1: Zusammensetzung des Mediums minimale Ausdruck für rekombinante protein Produktion in E. Coli BL21 Zellen.

Fortschritte in der Magie-Winkel drehen Festkörper-Kernspinresonanz-Spektroskopie (NMR) bieten ein effizientes Werkzeug für die strukturelle Charakterisierung von Proteinen makromolekularen Versammlungen in atomarer Auflösung. Diese Protein-Baugruppen sind ubiquitäre Systeme, die wesentliche Rollen in vielen biologischen Prozessen spielen. Ihre molekularen Strukturen, Interaktionen und Dynamik sind zugänglich durch NMR-Studien, wie für virale (Capsids1) und bakterielle Infektionsmechanismen (Sekretion Systeme2,3, Pili4), Membran Protein-komplexe5,6,7,8 und funktionale amyloiden 9,10,11. Diese molekularen Montageart kann auch Erkrankungen wie z. B. bei neurodegenerativen Erkrankungen provozieren, wo Proteine in fehlgefaltete, Amyloid Staaten montieren und dazu führen, dass aberrante Zelle Verhalten oder Zelle Tod 12,13. Protein-Baugruppen werden oft durch die symmetrische Oligomerisierung von vielfachen Kopien von Protein-Untereinheiten in großen supramolekularen Objekte in verschiedenen Formen, einschließlich Fibrillen, Filamente, Poren, Röhren oder Nanopartikel gebaut. Die quartäre Architektur ist definiert durch schwachen Wechselwirkungen zwischen Protein-Untereinheiten, die räumliche und zeitliche Versammlung zu organisieren und für anspruchsvolle biologischen Funktionen ermöglichen. Strukturelle Untersuchungen auf atomarer Skala auf diese Assemblys sind eine Herausforderung für hochauflösenden Techniken seit ihrer intrinsischen Unlöslichkeit und sehr oft ihre nicht-Kristallinität schränkt die Verwendung von konventionellen Röntgen-Kristallographie oder NMR-Lösung Ansätze. Magie-Winkel dreht (MAS) NMR ist eine neue Technik, atomarer Auflösung Daten über unlösliche makromolekularen Versammlungen und beweist seine Leistungsfähigkeit, atomare 3D-Modelle für eine wachsende Zahl von komplexen biomolekularen Systemen einschließlich zu lösen bakterielle Filamente, Amyloid Baugruppen und Viruspartikel 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Technischen Fortschritt auf hohen Magnetfeldern, methodischen Entwicklungen und Probenvorbereitung hat MAS-NMR in eine robuste Methode zu untersuchen, unlösliche Proteine in verschiedenen Umgebungen, insbesondere ihre biologisch relevante makromolekularen Staat oder in Zellmembranen, wodurch die Technik sehr komplementär zur Kryo-Elektronenmikroskopie montiert. In vielen Fällen kennzeichnet ein sehr hohes Maß an Symmetrie solche Protein-Baugruppen. MAS-NMR nutzt diese Funktion, wie alle Protein-Untereinheiten in einer Homomolecular Versammlung die gleiche lokale Struktur hätte und damit praktisch die gleiche NMR-Signatur, drastische Reduzierung der Komplexität der Analyse.
Ein effizientes Protokoll für strukturelle Studien von makromolekularen Protein Baugruppen durch moderate MAS (&#60; 25 kHz) NMR wird in diesem Video präsentiert und können unterteilt werden in verschiedenen Stufen (Abbildung 1). Wir zeigen die kritischen Phasen des Workflows eine NMR strukturelle Studie am Beispiel einer faserigen Protein Baugruppe (siehe markierte Schritte in Abbildung 1), mit Ausnahme der Untereinheit Proteinreinigung, unterschiedlich für jedes protein Montage sind aber von entscheidender Bedeutung für strukturelle Studien und ohne auf die technischen/methodische Details der NMR-Spektroskopie und Struktur Berechnung für welche spezialisierten Tutorials online verfügbar. Während dieses Protokolls in erster Linie auf Festkörper-NMR-Experimente unter MAS Bedingungen durchgeführt wird, ausgerichtet die Verwendung von biologischen Umgebungen 23,24,25,26 , 27, wie z. B. ausgerichteten Bicelles ermöglichen die Untersuchung von Protein-Konformation und dynamische Proteinprotein Interaktion in Membran-ähnliche Medien ohne MAS-Technologie. Wir zeigen die Proteinexpression und Montageschritte sowie die Aufnahme von entscheidenden NMR-Spektren und deren Analyse und Interpretation. Unser Ziel ist es, Einblicke in die strukturelle Analyse Pipeline ermöglicht den Leser, eine atomarer Auflösung strukturelle Studie einer makromolekularen Versammlung durch NMR-Techniken durchzuführen.
Das Protokoll umfasst 3 Bereiche:
(1) Festkörper-NMR-Musterfertigung
Als Voraussetzung für einen Festkörper-NMR-Analyse, die Proteinbestandteile des makromolekularen Montage müssen ausgedrückt werden, Isotopen-Label, gereinigt und montiert in Vitro in der Native-ähnlichen komplexen Zustand (für ein Beispiel siehe Abbildung 2) . Damit hohen Empfindlichkeit der NMR, ist Isotop Bereicherung in 13C und 15N Kennzeichnung erforderlich durch minimale bakterielle Ausdruck Medien ergänzt mit 13C und 15N Quellen, wie einheitlich 13 C-markierten Glukose/Glycerin und 15NH4Cl bzw.. In der späteren Phase des Protokolls, selektiv 13C-markierten Proben produziert mit selektiv 13C-Label Quellen wie z. B. (1,3 -13C)- und (2 -13C)-Glycerin (oder (1 -13C)- und (2 -13C)- Glukose) werden verwendet, um die NMR-Analyse zu erleichtern. Beschriftete Mischprobe entspricht einer äquimolaren Mischung von entweder 50 % 15N- und 50 % 13C beschriftet oder 50 % (1,3 -13C)- und 50 % (2 -13C)-Glukose werden eingeführt, um die Erkennung von intermolekularen beschreiben Interaktionen. Ein hohes Maß an Protein Reinheit sowie strenge Bedingungen während der Montageschritt sind Schlüsselfaktoren, um eine homogene strukturelle Ordnung der Endprobe zu versichern.
2. vorläufige strukturelle Charakterisierung basierend auf eindimensionale (1D) Festkörper-NMR
Wir präsentieren Ihnen die wesentlichen Experimente für eine strukturelle Analyse von NMR. Eindimensionale (1D) Kreuz-Polarisation (CP) und WERTAUSPRÄGUNGEN / RINEPT28 Experimente, auf 13C-Kerne erkannt werden verwendet, starre und flexible Protein Segmente bzw. in der Baugruppe zu erkennen und zur Schätzung der Struktur- Homogenität und lokalen Polymorphismus (für ein Beispiel siehe Abbildung 3).
<st></st>Rong > 3. Conformational Analyse und 3D Struktur Bestimmung
Abs. 1 und 2 betreffen die conformational Analyse, die über die NMR-Resonanz-Zuordnung von alle starren Rückstände der Assemblée Protein basiert, wie die chemischen Verschiebungen sehr empfindlich-Sonden an die lokalen Gegebenheiten sind und verwendet werden, können um vorherzusagen, die Phi/psi Verschneidung Winkel und damit bestimmen die Sekundärstruktur. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für eine sequentielle Resonanz-Zuordnung in der starren Kern einer Protein-Versammlung. Die 3D-Struktur Bestimmung basiert auf der Sammlung von Strukturdaten, z. B. Abstand Beschränkungen Codierung Nähen schließen (&#60; 7-9 Å), sowohl intra- und intermolekularen Informationen enthalten. Abs. 3 und 4 beschreiben Langstrecken entfernten Zurückhaltung Sammlung und Interpretation. Weitreichende Kontakte sind definiert als intramolekulare 13C -13C Nähe durch Rückstand ich j, mit | i-j | ≥4, definieren dabei die tertiären Protein-Falte der Monomere Untereinheit oder als intermolekulare 13C -13C nähen, die intermolekularen Schnittstellen zwischen Protein Untereinheiten in der Baugruppe zu definieren. Intra- und intermolekularen Schnittstellen sind in Abbildung 5dargestellt. NMR-Beschränkungen erkannt durch 13C -13C und 15N -13C Wiederankoppelung Experimente in der Regel kodieren für internuklearen Entfernungen &#60; 1 nm. Abs. 4 erklärt die Erkennung von intermolekulare Abstand Beschränkungen. In symmetrischen Proteins Baugruppen, die Verwendung von homogen beschrifteten Proben (d. h. 100 % gleichmäßig oder selektiv beschriftet) Untereinheit-Untereinheit intermolekularen Wechselwirkungen identifizieren begrenzt sind, als beide Intra - und inter - molecular Kontakte führen zu nachweisbare Signale. Die eindeutige Erkennung der intermolekularen Nähen wird erreicht, indem beschrifteten Mischproben, mit einer äquimolaren Mischung aus zwei unterschiedlich beschriftete Proben vor der Aggregation kombiniert. Unterabschnitt 5 führt kurz Struktur Modellierung.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Workflow ein atomarer Auflösung strukturelle Studie von Festkörper-NMR. 13 C, 15N Isotop mit der Bezeichnung Proteinproduktion, Untereinheit Reinigung, Untereinheit Montage, Kontrolle der Montage Bildung, NMR-Experimente, NMR-Experiment-Analyse und Gewinnung von Abstand Beschränkungen und Modellierung der Struktur werden angezeigt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Instruments</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR Spectrometer (&#62; 11.7 Tesla)</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">triple resonance MAS SSNMR probehead&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SSNMR rotors 4mm</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">K1910</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Centrifuge 5804 R&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5805000629</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">GeneQuant 1300 spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">28-9182-13</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">228001</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MaxQ 4450 bench top orbital shaker</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">78376</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tube Revolver Agitator</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">79547</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sonopuls HD 3100</td>
			<td style="width:117px;">Bandelin</td>
			<td style="width:119px;">3680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MicroPulser electroporator</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">mini-PROTEAN tetra cell system</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AKTA pure system</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-24</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillary microman M25 pipet</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148502</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Materials</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">amiconR ultra-15</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z740199-8EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillaries and pistons</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148112</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">spatula</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13263799</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">D-glucose 13C6</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">389374</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Ammonium-15N-chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">299251</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">1,3 13C2 glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">492639</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">2 13C glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">489484</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K1876</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3416</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7907</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71380</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208094</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Iron Chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">157740</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Zinc chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">793523</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MEM Vitamin Solution (100&#215;)</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M68954</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">IPTG</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tricine</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SDS</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">436143</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sodium azide</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">71289</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">178837</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Softwares</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Unicorn 6.3</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Akta systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">ccpNMR</td>
			<td style="width:117px;">CCPN&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">spectrometer systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy

Supramolekulare Protein Baugruppen Rolle grundlegende in biologischen Prozessen von Wirt-Pathogen-Interaktion, virale Infektion, die Ausbreitung von neurodegenerativen Erkrankungen. Solche Baugruppen bestehen in mehreren Protein-Untereinheiten organisiert in einer nicht-kovalente Weise makromolekularen Großobjekte zu bilden, die eine Vielzahl von zellulären Funktionen ausführen oder nachteilige Folgen nach sich ziehen können. Atomare Einblicke in die Versammlung Mechanismen und das Funktionieren des makromolekularen Assemblys bleiben oft knappen seit ihrer inhärenten Unlöslichkeit und nicht Kristallinität oft drastisch reduziert die Qualität der von den meisten Techniken gewonnenen Daten in der Strukturbiologie, wie Röntgen-Kristallographie und Lösung Kernspinresonanz (NMR) verwendet. Wir präsentieren hier Magic-Angle-Spinning Festkörper-NMR-Spektroskopie (NMR) als eine leistungsfähige Methode, um Strukturen der makromolekularen Versammlungen in atomarer Auflösung zu untersuchen. NMR kann atomare Details auf der montierten Anlage Größe und Löslichkeit uneingeschränkt offenbaren. Die hier vorgestellten Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte aus der Produktion von 13C /15N Isotopen-Label makromolekularen Protein Baugruppen für den Erwerb von standard NMR-Spektren und deren Analyse und Interpretation. Als Beispiel zeigen wir die Pipeline eine NMR-Strukturanalyse einer faserigen Protein-Versammlung.

Der typische NMR-Workflow umfasst mehrere Schritte, die in Abbildung 1dargestellt. In der Regel sind die Protein-Untereinheiten von in-vitro- heterologen Expression in E. Coliproduziert, gereinigt und montiert unter schütteln, aber manchmal auch unter statischen Bedingungen. Ausdruck und Reinigung des Protein-Untereinheit folgen SDS-Gel-Chromatographie (Abbildung 2A). Die Bildung von makromolekularen Versammlungen kann dann durch Elektronenmikroskopie (EM) Analyse bestätigt werden (siehe Abb. 2 b für ein Beispiel einer faserigen Versammlung).
Nach Einführung der Protein-Versammlung in der NMR-Rotor der Rotor wird eingefügt in das Spektrometer, MAS Frequenz und Temperatur geregelt und die Spektren aufgezeichnet. Erste Einblicke erhalten Sie von 1D NMR-Techniken. Abbildung 3 zeigt eine typische NMR FID erkannt auf dem 13C-Kanal auf einer Stichprobe von strukturell homogenen Protein, ein 1H -13C CP Spektrum, enthüllt die13C Resonanzen im starren Kern der Protein-Untereinheit in der Montage und ein 2D 1H -13C UNFÄHIGEN Spektrum, repräsentieren die mobile Rückstände. Für atomare Einblicke in den starren Kern der Baugruppenstruktur müssen multidimensional NMR-Experimente auf aufgezeichnet werden einheitlich und selektiv beschriftet Proben weisen Sie zuerst die NMR-Resonanzen und dann erkennen Langstrecke Nähen (siehe Abb. 4 ).
Alle Spektren werden verarbeitet und analysiert mit entsprechender Software zuweisen die NMR-Resonanzen und Extrahieren von Intra- und intermolekularen Abstand Beschränkungen (Abbildung 5). Die NMR Abstand Beschränkungen dienen entweder allein oder in Verbindung mit Daten aus komplementären Techniken, die in dem Modellierungsprogramm integriert werden können.
Abbildung 6 veranschaulicht für repräsentative Atomstrukturen makromolekularen Versammlungen durch NMR-Techniken gelöst mehrere filamentöse Baugruppen aus bakteriellen Anhängsel und Amyloid-Fibrillen.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
Abbildung 6:filamentösen makromolekulare Strukturen bestimmt durch einen Festkörper-NMR-Ansatz: bakterielle Filamente und Amyloid-Protein Fibrillen. A) Typ1 Pilus von adhärent E. Coli, PDB Code 2N7H 4; B) ASC Filament, PDB Code 2N1F 63; ( C) Typ-III-Sekretion System Nadeln, PDB-Codes 2MME, 2LPZ und 2MEX zu 2,3,64; D) PDB Code 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 , Amyloid-Beta-AB42-Fibrillen und Osaka mutierten PDB Code 2MVX 57, Iowa mutierten PDB Code 2MPZ 58; E) Alpha-Synuclein Fibrillen, PDB Code 2N0A 68; F) HET-s Prion Domain, PDB Code 2RNM, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Strukturen der supramolekularen Protein Baugruppen in atomarer Auflösung sind wegen ihre entscheidende Rolle in einer Vielzahl von biologischen Erscheinungen von hoher Relevanz. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um hochauflösende strukturelle Studien unlöslich und nichtkristalline makromolekularen Protein-Assemblys durch Magie-Winkel drehen Festkörper-Kernspinresonanz-Spektroskopie (MAS-NMR) durchführen.

Atomarer Skala strukturelle Studien der makromolekularen Versammlungen von Festkörper-NMR-Spektroskopie

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

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