Name: atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

עבודה זו ממומנת על ידי ANR (13-PDOC-0017-01 ועד B.H. ANR-14-CE09-0020-01 ל א. ל), "השקעות לעתיד" תוכנית IdEx בורדו/CNRS (PEPS 2016 ל B.H.) הפניה ANR-10-IDEX-03-02 כדי B.H., שופכים Fondation la Recherche Médicale ( AJE20140630090 לא. ל), עקרות, התוכנית האיחוד FP7 (האיחוד FP7-אנשים-2013-סיגריה על א. ל) ואת אירופה מחקר המועצה (ERC) תחת של האיחוד האירופי אופק 2020 מחקר וחדשנות התוכנית (ERC החל גרנט על א. ל., ההסכם לא 639020) ופרוייקט " WEAKINTERACT."

המחברים אין לחשוף.

NMR solid-state (SSNMR) היא שיטה של בחירה עבור אפיון חלבון macromolecular מכלולים ברמה האטומית. אחד הנושאים המרכזיים בקביעת מבנה המבוסס על SSNMR היא איכות ספקטרלי של המערכת ובדוקים, המאפשר הקמת תלת-ממד מודלים מבניים של דיוק שונים, החל בדרך כלל מודלים ברזולוציה נמוכה (המכיל המשני מבנה קטן נתוני תלת-ממד ורכיבי) כדי מדומים הבראבה תלת-ממד. כמות ואיכות המידע המבני המופק ניסויים SSNMR רב ממדית היא המפתח לחישוב מבנה NMR ברזולוציה גבוהה של ההרכבה.
הפרוטוקול המתואר מסתמך על הגילוי של 13C -13C ו 15N -13C מבניים ריסון הדורשים את ההקלטה של מספר ספקטרה 2D (וגם לפעמים 3D) עם גבוהה אות לרעש. בתדרים MAS מתונה (&#60; 25 קילו-הרץ), המדגם מוחדרים הרוטורים עם גדלים מקוטר 3.2-4 מ מ ומאפשר חלבון בכמויות של עד ~ 50 מ"ג, תלויים הידרציה מדגם. כמות הדגימה בתוך הרוטור היא ביחס ישר את יחס אות לרעש ספקטרה SSNMR, גורם מכריע עבור הגילוי של ריסון ארוכי טווח מרחק והקצאה ברורה וחד משמעית שלהם.
הרזולוציה ספקטרלי הוא פרמטר קריטי במהלך ההקצאה תהודה רציפים ואת האוסף ריסון. כדי להשיג תוצאות אופטימליות, הפרמטרים הכנת המדגם צריך להיות מותאם במיוחד, בפרט הטיהור של יחידת משנה את ואת התנאים הרכבה (pH, מאגר, רועדת, טמפרטורה וכדומה). למיטוב לדוגמה, מומלץ להכין דוגמאות ללא תווית עבור מספר תנאים ברורים אשר נצפתה הרכבה, וכדי להקליט 1D 1H -13ג CP קשת (שמתואר בשלב 2.1) על כל מדגם מוכן. הספקטרום לשרת השווה רזולוציה ספקטרלי ואת פיזור בין ההכנות שונה, המבוססת על אשר ניתן לקבוע את התנאים אופטימליים.
איכות הנתונים SSNMR תלוי בחום על בחירת הפרמטרים רכישה NMR, במיוחד עבור השלבים העברה קיטוב. השימוש של עוצמות שדה מגנטי גבוה (≥600 מגה-הרץ 1H תדירות) חיוני עבור רגישות גבוהה ורזולוציה ספקטרלי, נדרש כאשר מול יעדים מורכבים כגון חלבון macromolecular הרכבות.
גורם מגביל במקרים רבים הוא הזמינות ספקטרומטר. לכן, בחירה הביוספירה הדגימות כדי להיות מוכנים צריך להקדים את ההפעלה ספקטרומטר. בכל מקרה, בצורה אחידה 13C 15מדגם התווית על-ידי N הוא תנאי הכרחי לביצוע המשימה תהודה רציפות ואף התוך שיורית. חלבונים שהוקצה על-ידי טכניקות NMR של מצב מוצק ראה71. מכשור לקביעת קשיות ומבנה macromolecular להרכבות בתדרים MAS מתון מחייבת באופן סלקטיבי דגימות התווית על-ידי ג 13; עבור זיהוי ארוכי טווח 13C -13C ו- 13C -15N יוצר קשר הדגימות מבוסס על 1, 3 -13C - ו 2 -13C-gylcerol או 1 -13ג - ו 2 -13C-גלוקוז תיוג? נפוץ, כמתואר לעיל. הבחירה בין שתי הערכות תיוג מבוסס על יחס אות לרעש ספקטרלי והרזולוציה. כדי להבחין בין אינטרה - ואנשי קשר ארוך הטווח הבין-מולקולרי, מעורבות דגימות שכותרתו מדולל נחשפו יעיל.
בקיצור, השלבים הקריטיים למחקר מבנית SSNMR אטומי הם: (א) הכנת את subunits והצורך הרכבה ניתן למטב כדי להשיג דגימה מעולה ובאיכות, (ii) ספקטרומטר שדה כוח ורכישה פרמטרים צריכים להיות נבחרו בקפידה; (iii) אסטרטגיות תיוג סלקטיבית נדרשים עבור החלטה במבנה התלת-ממדי, כמות הנתונים הנדרשת תלויה איכות הנתונים ואת הזמינות של נתונים משלימים.
למרות את תחולתן למגוון רחב של מערכות סופרא מולקולרית ועד קרום חלבונים homomultimeric ננו-אובייקטים, SSNMR לעיתים קרובות מוגבל על ידי הצורך mg-כמויות של חומר isotopically עם תוויות. ההתפתחויות הטכנולוגיות ב- SSNMR MAS (≥100 kHz) אולטרה מהיר פתוח במעלה השדרה 1H מזוהה NMR, רודיש המגבלה של כמות מינימלית מדגם / sub-mg- 72,-73,-74. למרות זאת, ללימודי מבני נתונים היסטוריים הם דוגמאות התווית על-ידי C 13הכרחי, אשר מגביל את היישום של SSNMR דגימות נאסף במבחנה או מערכות לידי ביטוי המיקרואורגניזמים לשרוד על בינונית מזערי שם בתא SSNMR היא שיטה המתעוררים (עבור הדעת ראו 75,76,77,78).
גורם חשוב ביישום SSNMR להשיג מבנים תלת-ממד ברזולוציה גבוהה הוא הרזולוציה ספקטראליים: מהותי הטרוגניות הסתגלותי בהרכבה יכול להגביל את הרזולוציה ספקטרלי וניתוח ספקטרום. שאריות תיוג ספציפית 13C עשוי במקרים מסוימים לספק אלטרנטיבה לקבל מידע מרחק מסוים על שאריות אסטרטגי על מנת לקבל מודלים מבניים (עבור האחרונות דוגמאות ראה 79,80).
SSNMR לקביעת במבנה התלת-ממדי עדיין דורש האוסף של מספר datasets עם נתונים לעתים קרובות רב פעמים אוסף על מכשירים מתוחכמים, בהתאם את הגישה ואת המערכת מספר ימים עד שבועות ב 600-1000 MHz (תדירות1H) ספקטרומטר. לכן, הגישה ספקטרומטר הזמן יכול להיות גורם מגביל בכל מחקר מעמיק SSNMR.
במקרה של מכלולים חלבון homomultimeric, המוביל SSNMR נתונים באיכות מספיקה כדי לזהות מספר גבוה של ריסון מבניים כגון 3,57,64,70, SSNMR עדיין נותן אין גישה לממדים מיקרוסקופיים. לכן, בקביעת דה נובו SSNMR מבנה אסיפה homomultimeric, אותם או מסה לכל-(הזט ב) נתונים באורך אידיאלי משלימים SSNMR נתונים כדי להפיק את הפרמטרים סימטריה. SSNMR הנתונים לבד לספק את אטומי אינטרה - ממשקים הבין-מולקולרי
SSNMR משלימה ביותר עם טכניקות מבניים כגון EM או הזט ב מדידות, אבל הנתונים באופן מושלם גם יכול להיות משולב עם הבראבה מתקבל על ידי קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן או NMR פתרון על מוטציה או חתוכים subunits. מספר גדל והולך של מחקרים ניתן למצוא בספרות שבו אפשרה המפגש של נתונים מבניים שונים לקביעת אטומי דגמי תלת-ממד מכלולים macromolecular (ראה איור 6 דוגמאות מיצגות).
בתחום הביולוגיה המבנית, SSNMR מתגלה טכניקה מבטיח ללמודהרכבות לא מסיסים, הבלתי גבישי-אטומית רמה, קרי מתן מבני הנתונים את המשקל האטומי. במובן זה, SSNMR הוא התליון פתרון NMR, קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן עבור הרכבות מולקולרית, כולל ממברנה חלבונים בהרכבות שלהם ילידי הסביבה וחלבון כגון מעטפות ויראלי, חיידקי חוטים או amyloids, כמו גם RNA ו- מתחמי RNA-חלבון (ראה לדוגמה81). שלה יישומים רב תכליתי במבחנה בהקשר הסלולר, כגון מעקב אחר שינויים מבניים המשני, שלישוני, רבעוני, לזהות משטחים אינטראקציה עם השותף מולקולות על המשקל האטומי (לדוגמה 82), מיפוי דינמיקה מולקולרית בהקשר של קומפלקסים מורכבים, ציין את הפוטנציאל החשוב של SSNMR במחקרים מבניים עתידיים על מכלולים מורכבים למערכות ביולוגיות.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>רכיב</td>
			<td>M9 בינוני</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0.5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2פו ח'4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>נה2HPO4</td>
			<td>6.7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 מ מ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תערובת ויטמינים MEM 100 X</td>
			<td>10 מ ל/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C-גלוקוז</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 מלון NH4קלרנית</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: ההרכב של בינוני ביטוי מינימלית של חלבון רקומביננטי ייצור E. coli תאים BL21.

ההתקדמות קסם-זווית ספינינג ספקטרוסקופיה של מצב מוצק תהודה מגנטית גרעינית (SSNMR) מציעים כלי יעיל עבור אפיון מבניים חלבון macromolecular הרכבות ברזולוציה האטום. מהרכבות חלבונים אלה הן מערכות בכל מקום זה ממלאים תפקידים חיוניים תהליכים ביולוגיים רבים. מבנים מולקולריים שלהם, אינטראקציות, דינמיקה הינן נגישות באמצעות מחקרים SSNMR, כפי שהוצגה עבור נגיפי (capsids1) ואת מנגנוני זיהום חיידקי (הפרשת מערכות2,3, pili4), קרום חלבון מתחמי5,6,7,8 , amyloids תפקודית 9,10,11. הרכבה מולקולרי מסוג זה יכול גם לעורר פתולוגיות כגון מחלות ניווניות היכן חלבונים להרכיב במדינות misfolded, עמילואיד ולגרום בהתנהגות התא חריגה או לתא המוות 12,13. חלבון הרכבות, שנבנו על ידי oligomerization סימטרי עותקים בכפולות של החלבוניות לעצמים סופרא מולקולרית גדולים של צורות שונות כולל הסיבים, חוטים, נקבוביות, צינורות או חלקיקים. הארכיטקטורה רבעוני מוגדרת על ידי החלשים האינטראקציות בין החלבוניות כדי לארגן את מכלול יכולות וכדי לאפשר תפקודים ביולוגיים מתוחכמים. חקירות מבניים בקנה מידה אטומי על מהרכבות אלה הם אתגר עבור טכניקות ברזולוציה גבוהה מאז insolubility מהותי שלהם, לעיתים קרובות שלהם crystallinity ללא הגבלת השימוש קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן קונבנציונאלי או פתרון NMR גישות. קסם-זווית ספינינג (MAS) SSNMR המתעוררים הטכניקה כדי לקבל נתונים ברזולוציה אטומית על הרכבות macromolecular לא מסיסים, הוכיחה את יעילותה לפתרון אטומי דגמי תלת-ממד עבור מספר גדל והולך של מערכות למערכות ביולוגיות מורכבות כולל חוטים חיידקי, הרכבות עמילואיד, נגיפים 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. ההתקדמות הטכנית על שדות מגנטיים גבוהה, התפתחויות מתודולוגיות הכנת הדוגמא הקימה MAS SSNMR לתוך שיטה חזקה לחקור חלבונים לא מסיסים בסביבות שונות, ובייחוד ב שלהם מבחינה ביולוגית רלוונטיות macromolecular התאספו המדינה או ממברנות הסלולר, ביצוע הטכניקה מאוד משלים הקפאה-מיקרוסקופ. במקרים רבים, רמה גבוהה מאוד של סימטריה מאפיינת את הרכבות חלבון כזה. MAS SSNMR מנצל תכונה זו, כמו כל החלבוניות בהרכבה homomolecular באותו מבנה מקומי, ולכן כמעט זהה SSNMR חתימה, באופן דרסטי הפחתת המורכבות של הניתוח.
פרוטוקול יעילה ללימודי מבנית של חלבון macromolecular הרכבות על ידי MAS מתונה (&#60; 25 kHz) SSNMR מוצג בסרטון הזה, נחלקים שלבים שונים (איור 1). נדגים את השלבים הקריטיים של זרימת העבודה של מחקר מבנית SSNMR ביטוי על חלבון filamentous אסיפה (ראה מודגש צעדים באיור1), למעט חלבון יחידה משנית-טיהור, שונות עבור כל חלבון הרכבה, אבל חשיבות קריטית ללימודי מבניים, ומבלי אכנס לפרטי פרטים טכניים/מתודולוגיים SSNMR ספקטרוסקופיה ומבנה חישוב עבור מה הדרכות מיוחדות זמינים באינטרנט. בעוד בפרוטוקול הנוכחי יתמקד בעיקר ניסויים NMR של מצב מוצק תחת תנאים MAS, השימוש מיושר סביבות ביולוגי 23,24,25,26 , 27, כגון bicelles מיושר, לאפשר החקירה של חלבון קונפורמציה ואינטראקציה דינמי חלבון קרום דמוי בתקשורת ללא טכנולוגיית MAS. אנחנו נראה את הביטוי חלבון, מכלול צעדים, כמו גם את ההקלטה של ספקטרום SSNMR מכריע, ניתוח ופרשנות שלהם. המטרה שלנו היא לספק תובנות לתוך הצינור ניתוח מבנה המאפשר לקורא לבצע מחקר מבנית של אטומי ברזולוציה של אסיפה macromolecular בטכניקות SSNMR.
הפרוטוקול כוללת 3 סעיפים:
1. מוצק NMR לדוגמה ייצור
תנאי לביצוע ניתוח NMR של מצב מוצק, רכיבי חלבון בצורך הרכבה macromolecular לבוא לידי ביטוי, התווית על-ידי איזוטופ, מטוהרים, שהורכבו במבחנה למצב מורכב כמו מקורי (עבור לדוגמה ראה איור 2) . כדי להבטיח רגישות גבוהה NMR, איזוטופ העשרה 13C ו 15N תיוג נדרש באמצעות מדיה ביטוי חיידקי מינימלי בתוספת 13C ו 15N מקורות, כגון בצורה אחידה 13 התווית על-ידי C גלוקוז/גליצרול ו -15NH4Cl בהתאמה. בשלב מאוחר יותר של הפרוטוקול, באופן סלקטיבי 13התווית על-ידי C דגימות הופק באופן סלקטיבי 13מקורות התווית על-ידי C כגון (1, 3 -13ג)- ו (2 -13C)-גליצרול (או (1 -13ג)- ו (2 -13ג)- גלוקוז) נעשה שימוש כדי להקל על הניתוח NMR. מעורבות מדגם שכותרתו המתאים תערובת equimolar של 50% 15N - או 50% 13התווית על-ידי ג או 50% (1, 3 -13C)-50% (2 -13C)-גלוקוז מוצגים כדי לתאר את הגילוי של הבין-מולקולרי אינטראקציות. רמה גבוהה של חלבון טוהר, כמו גם תנאים קפדניים במהלך השלב הרכבה הם גורמי מפתח כדי להבטיח צו מבניים הומוגנית של המדגם הסופי.
2. ראשוני אפיון מבניים בהתבסס על מימדי NMR solid-state (1 ד)
אנו מציגים את הניסויים חיוני עבור ניתוח מבניים על-ידי SSNMR. (1 ד) חד-ממדי קרוס-קיטוב (CP), INEPT / RINEPT28 ניסויים, שאותרו על הגרעינים 13C משמשים כדי לזהות מקטעי חלבון גמיש הנוקשה בהרכבה, בהתאמה, הערכת מידת מבנית הומוגניות, פולימורפיזם המקומי (עבור לדוגמה ראה איור 3).
<st></st>רונג > 3. ניתוח הסתגלותי ותלת מימד מבנה נחישות
סעיפים קטנים 1 ו-2 נוגע הניתוח הסתגלותי, אשר מבוססת על ההקצאה תהודה SSNMR של כל שאריות נוקשה ההרכבה חלבון, כמו המשמרות כימיים הם רגשים רגיש מאוד בסביבה המקומית והוא יכול לשמש כדי לחזות את פי/psi דו-מישור זוויות, ובכך לקבוע את מבנה שניוני. איור 4 מתארת דוגמה הקצאת תהודה רציפים הליבה נוקשה של אסיפה חלבון. קביעת מבנה תלת-ממדי מבוסס על האוסף של נתונים מבניים כגון מרחק ריסון קידוד קרוב proximities (&#60; Å 7-9), המכיל גם אינטרה - וגם מידע הבין-מולקולרי. 3 ו- 4 מתארים איפוק מרוחק לטווח ארוך אוסף ופרשנות. קשרים ארוכי טווח מוגדרים התפלגות 13C -13C proximities הנובעות שאריות אני כדי ג'יי, עם | i-j | ≥4, הגדרת ובכך הקיפול חלבון שלישוני של יחידת משנה monomeric את, או הבין-מולקולרי 13C -13C proximities, הגדרת הממשקים הבין-מולקולרי בין החלבוניות בהרכבה. אינטרה - וממשקים הבין-מולקולרי מומחשים באיור5. SSNMR ריסון זוהה עד 13C -13C ו 15N -13C recoupling ניסויים בדרך כלל לקודד למרחקים internuclear &#60; 1 ננומטר. סעיף קטן 4 מסביר את הגילוי של ריסון המרחק הבין-מולקולרי. בהרכבות חלבון סימטרית, השימוש homogeneously שכותרתו דגימות (כלומר 100% בצורה אחידה, או בצורה סלקטיבית עם התווית) עבור זיהוי האינטראקציות הבין-מולקולרי יחידה משנית-יחידת משנה הוא מוגבל, כמו שני אינטרה - ולא בין - molecular אנשי קשר להוביל הסימנים לזיהוי. גילוי ברורה וחד משמעית של proximities הבין-מולקולרי מושגת באמצעות דגימות שכותרתו מעורבת, המכיל תערובת equimolar של שני מדגמים שכותרתו באופן שונה, בשילוב לפני צבירת. סעיף קטן 5 מציג בקצרה את מבנה דוגמנות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
איור 1 : זרימת העבודה ברזולוציה אטומית המחקר המבני מאת NMR של מצב מוצק. 13 ג', 15N איזוטופ שכותרתו ייצור החלבון, טיהור יחידה משנית, יחידת משנה הרכבה, שליטה על היווצרות הרכבה, ניסויים SSNMR, SSNMR ניסוי ניתוח והפקת מרחק ריסון, מידול המבנה מוצגות. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Instruments</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR Spectrometer (&#62; 11.7 Tesla)</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">triple resonance MAS SSNMR probehead&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SSNMR rotors 4mm</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">K1910</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Centrifuge 5804 R&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5805000629</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">GeneQuant 1300 spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">28-9182-13</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">228001</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MaxQ 4450 bench top orbital shaker</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">78376</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tube Revolver Agitator</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">79547</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sonopuls HD 3100</td>
			<td style="width:117px;">Bandelin</td>
			<td style="width:119px;">3680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MicroPulser electroporator</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">mini-PROTEAN tetra cell system</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AKTA pure system</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-24</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillary microman M25 pipet</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148502</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Materials</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">amiconR ultra-15</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z740199-8EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillaries and pistons</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148112</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">spatula</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13263799</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">D-glucose 13C6</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">389374</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Ammonium-15N-chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">299251</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">1,3 13C2 glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">492639</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">2 13C glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">489484</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K1876</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3416</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7907</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71380</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208094</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Iron Chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">157740</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Zinc chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">793523</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MEM Vitamin Solution (100&#215;)</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M68954</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">IPTG</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tricine</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SDS</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">436143</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sodium azide</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">71289</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">178837</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Softwares</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Unicorn 6.3</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Akta systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">ccpNMR</td>
			<td style="width:117px;">CCPN&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">spectrometer systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy

חלבון סופרא מולקולרית הרכבות ממלאים תפקידים מהותי בתהליכים ביולוגיים החל פתוגן-פונדקאי אינטראקציה, זיהום נגיפי כדי התפשטות של מחלות ניווניות. כזה מכלולים מורכבים ב מרובים החלבוניות מאורגנות בדרך שאינה קוולנטיות כדי ליצור אובייקטים macromolecular גדולים זה יכול לבצע מגוון רחב של פונקציות הסלולר או לגרום לכך השלכות מזיקות. אטומי תובנות המנגנונים הרכבה לבין תפקוד הרכבות macromolecular האלה נשארים לעיתים קרובות נדיר מאז שלהם insolubility הגלום ומפחית הלא-crystallinity לעיתים קרובות באופן דרסטי את איכות הנתונים המתקבלים רוב טכניקות בשימוש הביולוגיה המבנית כדוגמת קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן והפתרון תהודה מגנטית גרעינית (NMR). אנו מציגים כאן הקסם-זווית ספינינג NMR של מצב מוצק ספקטרוסקופיה (SSNMR) כשיטת רבי עוצמה כדי לחקור מבנים מכלולים macromolecular ברזולוציה אטומית. SSNMR יכול לחשוף פרטים אטומית על המתחם שהורכב ללא מגבלות גודל, המסיסות. פרוטוקול המובאת כאן מתאר את השלבים החיוניים מן הייצור של 13C /15N התווית על-ידי איזוטופ חלבון macromolecular להרכבות רכישת סטנדרטי SSNMR ספקטרה, שלהם ניתוח ופרשנות. לדוגמה, אנו מראים את הצינור של ניתוח מבני SSNMR של אסיפה חלבון filamentous.

זרימת העבודה SSNMR טיפוסית כוללת מספר שלבים מאויר באיור1. בדרך כלל החלבוניות המיוצר על ידי במבחנה heterologous ביטוי ב e. coli, מטוהרים, התאספו תחת רועד אך לפעמים גם בתנאים סטטי. הביטוי ולטיהור יחידת משנה של חלבונים, מלוות מרחביות ג'ל כרומטוגרפיה (איור 2 א). היווצרות של הרכבות macromolecular ואז יכול להיות מאושרות על ידי ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) (ראה איור 2B לקבלת דוגמה של אסיפה filamentous).
לאחר הקדמה של ההרכבה החלבון לתוך הרוטור SSNMR, הרוטור מוכנס לתוך ספקטרומטר, תדירות MAS וטמפרטורה מוסדרים, הספקטרום נרשמים. תובנות הראשון ניתן להשיג על ידי טכניקות SSNMR 1 י. איור 3 מראה FID SSNMR טיפוסי זוהה בערוץ 13C על מדגם הומוגני מבחינה מבנית חלבון, 1H -13ג CP קשת, חושף את מגנטיים13C נוכח הגרעין נוקשה של יחידת משנה של חלבונים ב- הרכבה, 2D 1H -13C מיומן קשת, המייצג את שאריות ניידים. בשביל אטומי תובנות הליבה נוקשה של מבנה ההרכבה, ניסויים SSNMR רב-ממדי צריך להיות מוקלטת על בצורה אחידה, באופן סלקטיבי שכותרתו דגימות כדי להקצות תחילה את ושעמומו SSNMR, ואז לזהות proximities ארוכי טווח (ראה איור 4 ).
הספקטרום מעובדים נותחו בתוכנת נאותה כדי להקצות את ושעמומו SSNMR ואת תמצית אינטרה - ואת המרחק הבין-מולקולרי ריסון (איור 5). הרצועות מרחק SSNMR משמשים גם לבד או בשילוב עם נתונים שיטות משלימות, אשר ניתן לשלב את הסימולטור.
עבור נציג הבראבה מכלולים macromolecular נפתרה על-ידי SSNMR טכניקות איור 6 מדגים מספר הרכבות filamentous תוספות חיידקי, הסיבים עמילואיד.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
איור 6:Filamentous מבנים macromolecular נקבע על ידי בגישה NMR של מצב מוצק: חוטים חיידקי, הסיבים חלבון עמילואיד. A) pilus סוג 1 של uropathogenic e. coli, PDB קוד 2N7H 4; B) עולה נימה, PDB קוד 2N1F 63; C) סוג III הפרשת מערכת מחטים, PDB קודים 2MME, 2LPZ ו- 2MEX 2,3,64; D) בטא עמילואיד AB42 הסיבים, PDB קוד 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 , אוסקה מוטציה PDB קוד 2MVX 57, איווה מוטציה PDB קוד 2MPZ 58; E) הסיבים אלפא-synuclein, 2N0A קוד PDB 68; F) תחום פריון הט-s, PDB קוד 2RNM, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

מבנים של חלבון סופרא מולקולרית הרכבות ברזולוציה אטומית הם רלוונטיות גבוהה בשל התפקידים מכריע שלהם במגוון רחב של תופעות ביולוגיות. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה על הרכבות לא מסיסים, הבלתי גבישי החלבון macromolecular על-ידי קסם-זווית ספינינג ספקטרוסקופיה של מצב מוצק תהודה מגנטית גרעינית (MAS SSNMR).

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Interpreting Nuclear Magnetic Resonance Spectra

SCIENTISTS IN ACTION

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, Filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

לימודי המבנית של מקרומולקולות בפתרון באמצעות פיזור קרני רנטגן זווית קטנה

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות NMR של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

ספקטרוסקופיה לספיגה אטומית כדי למדוד בריכות אבץ תאיים בתאי מיונקים

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

הסרה והחלפה של ליגנדים אנדוגניים מחלבונים ואלרגנים הקשורים לשומנים

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...