Name: atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

Questo lavoro è finanziato dalla ANR (13-PDOC-0017-01 B.H. e ANR-14-CE09-0020-01 a A.L.), "Gli investimenti per il futuro" programma IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 al B.H.) fare riferimento ANR-10-IDEX-03-02 al B.H., la Fondation pour la Recherche Médicale ( FRM-AJE20140630090 a A.L.), il programma del 7 ° PQ (7 ° PQ-persone-2013-CIG a A.L.) e del Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma dell'Unione europea Horizon 2020, ricerca e innovazione (ERC Starting Grant di A.L., accordo No 639020) e progetto " WEAKINTERACT."

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

NMR allo stato solido (SSNMR) è un metodo di scelta per caratterizzare gli assembly macromolecolare della proteina a livello atomico. Uno dei temi centrali nella determinazione della struttura di base di SSNMR è la qualità spettrale del sistema oggetto dell'inchiesta, che permette di stabilire modelli strutturali 3D di precisione vari, in genere che vanno dai modelli a bassa risoluzione (contenente il secondario struttura elementi e poche informazioni 3D) per strutture 3D pseudo-atomiche. La quantità e la qualità di informazioni strutturali estratte dal multi-dimensionale SSNMR esperimenti è la chiave per calcolare una struttura NMR ad alta risoluzione dell'Assemblea.
Il protocollo descritto si basa sul rilevamento di 13C -13C e 15N -13C strutturali vincoli che richiedono la registrazione di diversi spettri 2D (e a volte 3D) con alto segnale-rumore. Alle frequenze di MAS moderate (&#60; 25 kHz), il campione è stato introdotto in rotori con dimensioni di 3.2-4 mm di diametro permettendo per le quantità di proteine fino a ~ 50 mg, dipende l'idratazione del campione. La quantità di campione all'interno del rotore è direttamente proporzionale il rapporto segnale-rumore negli spettri di SSNMR, un fattore decisivo per l'individuazione dei vincoli di distanza a lungo raggio e loro assegnazione univoca.
La risoluzione spettrale è un parametro cruciale durante l'assegnazione di risonanza sequenziale e l'insieme di vincoli. Per ottenere risultati ottimali, i parametri di preparazione del campione devono essere ottimizzate, in particolare nella purificazione della subunità e le condizioni di montaggio (pH, buffer, agitazione, temperatura, ecc.). Per l'ottimizzazione del campione, si consiglia di preparare campioni senza etichetta per diverse circostanze distinte per i quali è stato osservato Assemblea e di registrare un 1D 1H -13C CP spettro (descritto al punto 2.1) su ogni campione preparato. Gli spettri servono per confrontare la risoluzione spettrale e dispersione tra le diverse preparazioni, basata che possono essere determinate le condizioni ottimali.
La qualità dei dati SSNMR dipende fortemente la scelta dei parametri di acquisizione NMR, soprattutto per le operazioni di trasferimento di polarizzazione. L'uso di alta intensità di campo magnetico (≥ 600 megahertz di frequenza di 1H) è essenziale per alta sensibilità e risoluzione spettrale, obbligatorio quando affrontare obiettivi complessi come gli assembly macromolecolare della proteina.
Un fattore limitante in molti casi è la disponibilità di spettrometro. Di conseguenza, una scelta giudiziosa dei campioni per essere preparati deve precedere la sessione di spettrometro. In ogni caso, un uniformemente 13C, 15N-etichettato campione è un prerequisito per eseguire l'assegnazione di risonanza sequenziale e intra-residuo. Per proteine assegnate mediante tecniche NMR allo stato solido vedere71. Determinazione della struttura delle assemblee macromolecolari a frequenze MAS moderate in modo selettivo richiede 13marcato C campioni; per la rilevazione di lungo raggio 13C -13C e 13C -15N contatti campioni basati su 1,3 -13C - e 2 -13C-gylcerol e/o 1 -13C - e 2 -13C-glucosio etichettatura sono comunemente utilizzati, come descritto in precedenza. La scelta tra i due schemi di etichettatura è basata sul rapporto segnale-rumore spettrale e risoluzione. Per distinguere tra intra - e intermolecolari contatti a lungo raggio, i campioni etichettati e diluiti misti hanno rivelato efficiente.
In breve, i passaggi critici per uno studio strutturale di SSNMR atomico sono: (i) la preparazione di subunità e la necessità di montaggio di essere ottimizzato per ottenere quantità di campione eccellente e qualità, (ii) spettrometro campo forza e acquisizione parametri devono essere scelti con cura; (iii) selettive strategie d'etichettatura sono necessari per una determinazione della struttura 3D e la quantità di dati richiesti dipende dalla qualità dei dati e la disponibilità di dati complementari.
Nonostante la sua applicabilità ad una vasta gamma di sistemi supramolecolari da proteine di membrana a homomultimeric nano-oggetti, SSNMR è spesso limitata dalla necessità per mg-quantità di materiale isotopicamente etichettato. I recenti sviluppi tecnologici nel ultra-veloce MAS (≥ 100 kHz) SSNMR aperta fino all'avenue a 1H-rilevato NMR e spingere il limite della quantità minima di campione a sub-mg 72,73,74. Tuttavia, per gli studi strutturali dettagliati 13C-etichetta campioni sono indispensabili, che limita l'applicazione di SSNMR a campioni assemblati in vitro o sistemi espressi negli organismi che sopravvivono in terreno minimo, dove nella cella SSNMR è un metodo di emergente (per recensioni Vedi 75,76,77,78).
Un fattore importante nell'applicazione di SSNMR per ottenere strutture 3D ad alta risoluzione è la risoluzione spettrale: intrinseca eterogeneità conformazionale in un assembly può limitare l'analisi spettrale spettri e risoluzione. Residuo specifico 13C etichettatura può in alcuni casi fornire un'alternativa per ottenere informazioni di distanza specifica sui residui strategici al fine di ottenere modelli strutturali (per una recente esempi Vedi 79,80).
SSNMR per determinazione della struttura 3D richiede ancora la raccolta di diversi set di dati con tempi di raccolta di dati spesso lunghi su strumenti sofisticati, a seconda l'approccio e il sistema parecchi giorni alle settimane su un 600-1000 MHz (frequenza1H) spettrometro. Di conseguenza, l'accesso al tempo spettrometro può essere un fattore limitante in un approfondito studio SSNMR.
Nel caso di assemblee di proteina di homomultimeric, che conduce ai dati SSNMR di qualità sufficiente per identificare un elevato numero di vincoli strutturali come in 3,57,64,70, SSNMR non dà ancora nessun accesso alle dimensioni microscopiche. Pertanto, in una determinazione della struttura SSNMR de novo di un assembly homomultimeric, EM o dati (MPL) massa-a-lunghezza ideale completano dati SSNMR per derivare i parametri di simmetria. SSNMR dati da soli forniscono l'atomica intra - e intermolecolari interfacce
SSNMR è altamente complementare con tecniche strutturali quali misure EM o MPL ma i dati possono essere combinati anche perfettamente con strutture atomiche ottenute mediante cristallografia a raggi x o soluzione NMR su subunità mutata o troncata. Un numero crescente di studi può essere trovato in letteratura dove la congiunzione di diversi dati strutturali ha permesso per la determinazione di modelli atomici 3D di macromolecolare assembly (vedere la Figura 6 per esempi rappresentativi).
Nel campo della biologia strutturale, SSNMR emerge come una tecnica promettente per lo studioassembly insolubili e non cristallina presso l'atomico livello, cioè fornendo dati strutturali su scala atomica. A questo proposito, SSNMR è la sospensione per soluzione NMR e cristallografia a raggi x per gli assembly molecolari, tra cui proteine di membrana nelle assemblee ambiente e proteina native come buste virale, batteriche filamenti o amiloidi, nonché di RNA e Complessi RNA-proteina (Vedi ad esempio81). Sue applicazioni altamente versatile in vitro e nel contesto cellulare, come il rilevamento delle modifiche strutturali secondarie, terziarie e quaternarie, identificando le superfici di interazione con molecole di partner su scala atomica (ad esempio 82) e mappatura dinamica molecolare nell'ambito di complessi montati, indicano il potenziale importante di SSNMR in futuri studi strutturali sugli assiemi complessi biomolecolari.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>M9 medio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0,5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6,7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamina mix 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C-glucosio</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Composizione del mezzo di espressione minima per proteina ricombinante produzione in Escherichia coli cellule BL21.

I progressi nella magia-angolo filatura spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido (SSNMR) offrono un efficace strumento per la caratterizzazione strutturale delle assemblee di proteina macromolecolari a una risoluzione atomica. Questi assembly di proteina sono onnipresenti sistemi che svolgono un ruolo essenziale in molti processi biologici. Le strutture molecolari, interazioni e dinamiche sono accessibili dagli studi SSNMR, come è stato dimostrato per virale (capsidi1) e meccanismi di infezione batterica (secrezione sistemi2,3, pili4), membrana proteina complessi5,6,7,8 e funzionale amiloidi 9,10,11. Questo tipo di assemblaggio molecolare può anche provocare patologie come ad esempio nelle malattie neurodegenerative dove proteine assemblare negli stati misfolded, amiloide e causano un comportamento aberrante delle cellule o delle cellule morte 12,13. Assembly di proteine sono spesso costruiti dall'oligomerizzazione simmetrica di copie multiple di subunità proteiche in oggetti grandi supramolecolari di varie forme tra cui fibrille, filamenti, pori, tubi o nanoparticelle. L'architettura quaternario è definita da interazioni deboli tra subunità proteiche per organizzare l'Assemblea spazio e temporale e per consentire sofisticate funzioni biologiche. Indagini strutturali scala atomica su questi assembly sono una sfida per le tecniche ad alta risoluzione dal loro insolubilità intrinseca e molto spesso loro cristallinità-non limita l'uso di convenzionale cristallografia a raggi x o soluzione NMR si avvicina. Angolo di magia filatura SSNMR (MAS) è una tecnica emergente per ottenere dati di risoluzione atomica su assembly macromolecolari insolubile e ha dimostrato la sua efficacia per risolvere modelli 3D atomiche per un numero crescente di sistemi biomolecolari complessi tra cui filamenti batterici, assemblee dell'amiloide e particelle virali 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Progressi tecnici su alti campi magnetici, sviluppi metodologici e preparazione del campione ha stabilito SSNMR MAS in un robusto metodo per studiare le proteine insolubili in vari ambienti, in particolare nel loro biologicamente rilevanti macromolecolari assemblati statali o nelle membrane cellulari, rendendo la tecnica altamente complementari per cryo-microscopia elettronica. In molti casi, un altissimo grado di simmetria caratterizza tali assemblee di proteina. MAS SSNMR sfrutta questa caratteristica, come tutte le unità secondarie della proteina in un assembly di inerti avrebbe la stessa struttura locale e quindi praticamente la stessa firma SSNMR, riducendo drasticamente la complessità dell'analisi.
Un efficiente protocollo per studi strutturali delle assemblee di proteina macromolecolari di MAS moderata (&#60; 25 kHz) SSNMR è presentato in questo video e può essere suddivisa in diverse fasi (Figura 1). Mostreremo le fasi critiche del flusso di lavoro di uno studio strutturale SSNMR esemplificato su un assembly di proteine filamentose (Vedi evidenziato i passaggi nella Figura 1), con l'eccezione di purificazione della proteina di subunità, differenti per ogni proteina Assemblea ma di fondamentale importanza per gli studi strutturali e senza entrare nei dettagli tecnici/metodologico di calcolo di spettroscopia e struttura SSNMR per quale tutorial specializzati sono disponibili online. Mentre il presente protocollo si concentrerà principalmente su esperimenti NMR allo stato solido eseguiti in condizioni di MAS, l'uso di allineati ambienti biologici 23,24,25,26 , 27, ad esempio bicelles allineato, consentire per l'indagine di conformazione della proteina e interazione dinamica proteina-proteina membrana-come media senza tecnologia MAS. Vi mostreremo l'espressione della proteina e fasi di montaggio, nonché la registrazione di spettri SSNMR cruciali e loro analisi e interpretazione. Il nostro obiettivo è quello di fornire le comprensioni nella pipeline di analisi strutturale che permette al lettore di eseguire uno studio strutturale di risoluzione atomica di un assembly macromolecolare mediante tecniche di SSNMR.
Il protocollo comprende 3 sezioni:
1. la produzione del campione NMR a stato solido
Come un prerequisito per un'analisi NMR allo stato solido, le componenti proteiche della necessità di essere espressa assemblaggio macromolecolare, isotopo-etichettati, purificata e assemblati in vitro nello stato nativo-come complesso (per vedere un esempio nella figura 2) . Per garantire alta sensibilità di NMR, arricchimento dell'isotopo 13C e 15N etichettatura è necessario attraverso l'uso di media minima espressione batterica completati con 13C e 15N fonti, come uniformemente 13 C-etichetta glucosio/glicerolo e 15NH4Cl rispettivamente. Nella fase successiva del protocollo, selettivamente 13C-etichetta campioni prodotto con selettivamente 13fonti C-etichettato come (1,3 -13C)- e (2 -13C)-glicerolo (o (1 -13C)- e (2 -13C)- glucosio) vengono utilizzati per facilitare l'analisi NMR. Misto con etichettato campione corrispondente una miscela equimolare di 50% 13C-etichetta o 50% e 50% 15N - (1,3 -13C)- e il 50% (2 -13C)-glucosio sono stati introdotti per descrivere l'individuazione di intermolecolari interazioni farmacologiche. Un elevato grado di purezza della proteina, nonché a rigorose condizioni durante la fase di assemblaggio sono fattori chiave per assicurare un ordine strutturale omogeneo del campione finale.
2. preliminare caratterizzazione strutturale basata su NMR allo stato solido di unidimensionale (1D)
Vi presentiamo gli esperimenti essenziali per un'analisi strutturale di SSNMR. Unidimensionale (1D) cross-polarizzazione (CP) e inetto / RINEPT28 gli esperimenti, rilevati su nuclei di 13C sono utilizzati per rilevare segmenti rigidi e flessibili della proteina nell'Assemblea, rispettivamente e di stimare il grado di strutturale omogeneità e polimorfismo locale (per vedere un esempio nella figura 3).
<st></st>Rong &gt; 3. Determinazione della struttura analisi conformazionale e 3D
Paragrafi 1 e 2 riguardano l'analisi conformazionale, che si basa sull'assegnazione di risonanza del SSNMR rigida tutti i residui dell'Assemblea della proteina, come gli spostamenti chimici sono sonde molto sensibile all'ambiente locale e possono essere usati per predire il phi/psi diedro angoli e quindi determinare la struttura secondaria. La figura 4 illustra un esempio di un'assegnazione di risonanza sequenziale nell'anima rigida di un assemblaggio di proteine. La determinazione della struttura 3D è basata sulla raccolta di dati strutturali, ad esempio vincoli di distanza codifica chiudere vicinanze (&#60; Å 7-9), che contiene sia intra - e intermolecolari informazioni. Interpretazione e a lungo raggio ritenuta distante collezione descrivono sottosezioni 3 e 4. Contatti a lungo raggio sono definiti come intramolecolare 13C -13C vicinanze derivanti da residui da i a j, con | i-j | ≥ 4, definendo quindi la piega terziaria della proteina dell'unità secondaria monomerica, o come intermolecolari 13C -13C vicinanze, definendo le interfacce intermolecolari tra subunità proteiche nell'assembly. Intra - e intermolecolari interfacce sono illustrate nella Figura 5. Vincoli SSNMR rilevato attraverso 13C -13C e 15N -13C accoppiamento esperimenti solitamente codificano per distanze internuclear &#60; 1 nm. Sottosezione 4 spiega l'individuazione dei vincoli di distanza intermolecolare. Negli assembly di proteina simmetrico, l'uso di campioni etichettati in modo omogeneo (cioè 100% uniformemente o selettivamente con l'etichetta) per identificare interazioni intermolecolari subunità-unità secondaria è limitato, come entrambi intra - e inter - molecolari contatti portano a segnali rilevabili. L'individuazione univoca di vicinanze intermolecolari è ottenuta utilizzando campioni etichettati misti, contenenti una miscela equimolare di due campioni etichettati in modo diverso, combinato prima dell'aggregazione. Sottosezione 5 introduce brevemente la modellazione della struttura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
Figura 1 : Flusso di lavoro di uno studio strutturale di risoluzione atomica di NMR allo stato solido. 13 C, 15N isotopo etichettato produzione di proteine, purificazione di subunità, assemblaggio di subunità, controllo della formazione di assemblaggio, esperimenti SSNMR, SSNMR esperimento analisi e l'estrazione dei vincoli di distanza e modellazione della struttura sono indicati. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Instruments</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR Spectrometer (&#62; 11.7 Tesla)</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">triple resonance MAS SSNMR probehead&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SSNMR rotors 4mm</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">K1910</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Centrifuge 5804 R&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5805000629</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">GeneQuant 1300 spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">28-9182-13</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">228001</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MaxQ 4450 bench top orbital shaker</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">78376</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tube Revolver Agitator</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">79547</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sonopuls HD 3100</td>
			<td style="width:117px;">Bandelin</td>
			<td style="width:119px;">3680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MicroPulser electroporator</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">mini-PROTEAN tetra cell system</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AKTA pure system</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-24</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillary microman M25 pipet</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148502</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Materials</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">amiconR ultra-15</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z740199-8EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillaries and pistons</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148112</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">spatula</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13263799</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">D-glucose 13C6</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">389374</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Ammonium-15N-chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">299251</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">1,3 13C2 glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">492639</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">2 13C glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">489484</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K1876</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3416</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7907</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71380</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208094</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Iron Chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">157740</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Zinc chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">793523</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MEM Vitamin Solution (100&#215;)</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M68954</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">IPTG</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tricine</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SDS</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">436143</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sodium azide</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">71289</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">178837</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Softwares</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Unicorn 6.3</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Akta systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">ccpNMR</td>
			<td style="width:117px;">CCPN&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">spectrometer systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy

Gli assembly supramolecolari proteina giocano un ruolo fondamentale nei processi biologici che vanno dall'interazione ospite-patogeno, infezione virale alla propagazione di malattie neurodegenerative. Tali assemblee consistono in più subunità proteiche organizzata in un modo non-covalenti per formare grandi oggetti macromolecolari che possono eseguire una varietà di funzioni cellulari o causare conseguenze dannose. Intuizioni atomici dei meccanismi di assemblaggio e il funzionamento di tali assembly macromolecolari spesso rimangono scarse dal loro insolubilità intrinseca e non-cristallinità spesso drasticamente riduce la qualità dei dati ottenuti dalla maggior parte delle tecniche utilizzato in biologia strutturale, come la cristallografia a raggi x e risonanza magnetica nucleare (NMR) soluzione. Presentiamo qui la spettroscopia NMR allo stato solido di angolo di magia filatura (SSNMR) come un potente metodo per indagare strutture macromolecolari assembly a risoluzione atomica. SSNMR può rivelare dettagli atomici del complesso assemblato senza limitazioni di dimensioni e solubilità. Il protocollo presentato qui descrive i passi essenziali dalla produzione di 13C / assembly proteina macromolecolari isotopo-labeled15N per l'acquisizione di spettri SSNMR standard e loro analisi e interpretazione. Ad esempio, mostriamo la pipeline di un'analisi strutturale di SSNMR di un assemblaggio di proteine filamentose.

Il flusso di lavoro tipico di SSNMR prevede diversi passaggi illustrati nella Figura 1. Solitamente la subunità proteiche sono prodotto da in vitro l'espressione eterologa in Escherichia coli, purificata e montate sotto agitazione, ma a volte anche in condizioni statiche. Espressione e purificazione della subunità della proteina sono seguiti da cromatografia di gel di SDS (Figura 2A). La formazione delle assemblee macromolecolari quindi può essere confermata dall'analisi di microscopia elettronica (EM) (Vedi Figura 2B per un esempio di un assemblaggio filamentosa).
Dopo l'introduzione dell'Assemblea della proteina nel rotore SSNMR, il rotore viene inserito nello spettrometro, il MAS frequenza e temperatura sono regolati e gli spettri sono registrati. Prime intuizioni possono essere ottenuti mediante tecniche SSNMR 1D. La figura 3 Mostra un tipico FID SSNMR rilevato sul canale 13C su un campione della proteina strutturalmente omogeneo, un 1H -13C CP spettro, rivelando le risonanze di13C presenti nel nucleo rigido della subunità della proteina nella assembly e uno spettro 2D 1H -13C inetto, che rappresentano i residui cellulari. Per atomici intuizioni il nucleo rigido della struttura dell'assieme, multidimensionale SSNMR esperimenti devono essere registrate su uniformemente e in modo selettivo etichettato i campioni per assegnare innanzitutto le risonanze SSNMR e quindi rilevare la prossimità a lungo raggio (Vedi figura 4 ).
Tutti gli spettri vengono elaborati e analizzati con software adeguato per assegnare le risonanze SSNMR ed estrarre intra - e intermolecolari distanza vincoli (Figura 5). I vincoli di distanza SSNMR vengono utilizzati da soli o in combinazione con i dati di tecniche complementari, che può essere integrato nel programma di modellazione.
Per strutture rappresentative atomiche di macromolecolare assembly risolto mediante tecniche di SSNMR la figura 6 illustra diversi assembly filamentose da appendici batteriche e fibrille amiloidi.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
Figura 6:strutture macromolecolari filamentose, determinate da un approccio di NMR allo stato solido: filamenti batterici e fibrille della proteina amiloide. A) tipo 1 pilus di uropathogenic Escherichia coli, PDB codice 2N7H 4; B) ASC filamento, PDB codice 2N1F 63; C) gli aghi sistema di secrezione di tipo III, PDB codici 2MME, 2LPZ e 2MEX 2,3,64; D) fibrille di amiloide-beta AB42, PDB codice 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 e Osaka mutante PDB codice 2MVX 57, Iowa mutante PDB codice 2MPZ 58; E) dell'alfa-synuclein fibrille, PDB codice 2N0A 68; F) dominio di prioni HET-s, PDB codice 2RNM, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Strutture di assiemi di proteina supramolecolari a risoluzione atomica sono di grande rilevanza a causa della loro un ruolo cruciale in una varietà di fenomeni biologici. Qui, presentiamo un protocollo per eseguire studi strutturali ad alta risoluzione su assiemi di proteina insolubile e non cristallini macromolecolari di magia-angolo filatura spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido (SSNMR MAS).

Studi strutturali su scala atomica degli assembly macromolecolari di spettroscopia a risonanza magnetica di nucleare allo stato solido

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Interpreting Nuclear Magnetic Resonance Spectra

SCIENTISTS IN ACTION

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l&#39;identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Ricerca

Biochimica

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Spettroscopia della forza delle singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Interazioni di proteine globulari e filamentose di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) e Microscala submicronica (MST) di misura

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Studi strutturali di macromolecole in soluzione con piccolo angolo x-ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Preparazione di funghi e materiali vegetali per delucidazione strutturale utilizzando dinamico polarizzazione nucleare NMR allo stato solido

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imaging delle vescibole extracellulari mediante microscopia a forza atomica

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Spettroscopia di assorbanza atomica per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caratterizzazione degli aggregati proteici individuali mediante nanospettroscopia a infrarossi e microscopia a forza atomica

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Flusso di lavoro per spettrometria di massa per l'immunoprecipitazioni nucleari senza etichetta per la profilazione del contraglio nucleare su larga scala

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Rimozione e sostituzione di ligandi endogeni da proteine e allergeni legati ai lipidi

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...