Name: atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00
Duration: 14 min 55 s
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この作品は、ANR (13-PDOC-0017-01 学と ANR-14-CE09-0020-01 アダムローリー) によって資金を供給、「未来への投資」プログラム アイデックス ボルドー/CNRS (PEP 2016 年学) 参照 ANR-10-アイデックス-03-02 学にこそ注ぐラ凝った Médicale (FRM - アダムローリーに AJE20140630090)、FP7 プログラム (FP7 の人々-2013-セエグ アダムローリーに) および欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新プログラム (アダムローリー、契約なしの 639020 に付与開始 ERC) の下で欧州研究会議 (ERC) とプロジェクト」WEAKINTERACT."

著者が明らかに何もありません。

固体 NMR (SSNMR) は、原子レベルで高分子タンパク質複合体を特徴付けるための選択の方法です。SSNMR ベースの構造決定の中心的な問題の 1 つは通常 (セカンダリを含む低解像度モデルに至る、様々 な高精度の 3次元構造モデルを確立することができる調査システムのスペクトルの質構造要素と小さな 3 D 情報) 疑似原子の 3 D 構造。多次元 SSNMR 実験から抽出された構造情報の質と量はアセンブリの高分解能 nmr による構造を計算するキー。
記述されていたプロトコルは、 13C-13C、 15N-13C 構造拘束高信号にノイズにいくつかの 2 D (および時々 3 D) スペクトルの記録を必要とする検出に依存します。中程度の MAS 周波数 (&#60; 25 kHz)、サンプルがサンプル水和に依存してまで ~ 50 mg の蛋白量を可能にする 3.2 4 mm 径のローターに導入されました。ローター内サンプルの量は SSNMR スペクトルにおける信号対雑音比、長距離距離制約の検出とその明確な割り当てのための決定的な要因に直接比例します。
スペクトル分解能は、シーケンシャル共鳴割り当ておよび拘束コレクション中に重要なパラメーターです。最適な結果を得るためには、サンプルの準備パラメーターは精製サブユニットとアセンブリの条件 (pH、バッファー、振動、温度等) を中心に、最適化する必要があります。サンプルを最適化するためのいくつかの異なる条件のアセンブリを観察されている、ラベルのサンプルを準備して 1 D 1h-13C CP スペクトル (ステップ 2.1 で説明) それぞれ作製した試料を記録するをお勧めします。スペクトルはスペクトル分解能と最適条件を決定することができますに基づいて別の準備の間の分散を比較するのに役立ちます。
SSNMR データの品質は、偏光の転送手順については特に、NMR アクイジション ・ パラメーターの選択によって強く決まります。高感度、スペクトル分解能、高分子タンパク質複合体などの複雑なターゲットに直面するときに必要なは、高磁場の強さ ( 1H 周波数 ≥600 MHz) の使用が欠かせません。
多くの場合、制限要因は、分光器の可用性です。したがって、準備するサンプルの賢い選択分光器セッションを付けます。いずれにせよ、均一に13C、 15N 標識サンプル シーケンシャルと内残留共鳴割り当てを実行する前提条件であります。固体 nmr 測定法によって割り当てられたタンパク質は、「71」を参照してください。選択的13C 標識サンプルが必要です適度な MAS 周波数で高分子アセンブリの構造決定長距離13c-13C と13C ・15N 検出連絡先のサンプルに基づいて 1, 3-13C -、2-13C エステルおよび/または 1-13C -、2 -、13C グルコース ラベリングよく使用される前述のよう。2 つのラベル付けスキーム間の選択は、スペクトルの信号対雑音比と解像度に基づいています。内・分子間の長距離接触を区別するには、混合ラベルおよび希薄化後の試料は効率的で明らかにしました。
一言で言えば、原子の SSNMR 構造研究のための重要なステップは、: (i) の優れたサンプル量と品質を取得するアセンブリの最適化する必要性サブユニットの準備、(ii) 分析計フィールド強さと集録パラメーターする必要があります慎重に選ばれました。(iii) 選択的ラベリング戦略は、3 D 構造決定に必要な必要なデータの量は、データの品質と相補的なデータの可用性によって異なります。
Homomultimeric ナノオブジェクト膜タンパク質に至る超分子システムの広い範囲への適用性、にもかかわらず SSNMR 多い同位体ラベル材料の mg 量の必要性によって制限されます。超高速 MAS (≥100 kHz) SSNMR 1H 検出 NMR への道を開く技術動向とサブ mg 72,,7374最小サンプル量の限界をプッシュ。それにもかかわらず、構造を解明13C 標識サンプルが不可欠、体外組み立てサンプルまたは、セルの最小媒体で生き残る生物で表されるシステムに SSNMR のアプリケーションを制限します。SSNMR は新たな方法です (詳細レビューは、 75,,767778,を参照)。
SSNMR アプリケーションが高解像度の 3 D 構造を得るための重要な要因は、スペクトル分解能: アセンブリの構造不均質性組み込みスペクトル解像度とスペクトル解析を制限できます。残渣特定13C ラベル可能性がありますいくつかのケースで代替手段を提供 (最近の例を参照してください79,80) 構造のモデルを得るために戦略的な残留に関する特定の距離情報を取得します。
3次元定量 SSNMR はまだアプローチおよび 600-1000 MHz (1H 周波数) で週に数日システムによって、洗練された楽器に頻繁に長くデータ収集時間のいくつかのデータセットのコレクションを必要とします。分光器。したがって、分光器時間へのアクセス SSNMR オーナーシッの制限要因になることができます。
Homomultimeric 蛋白質のアセンブリの3,57,64,70, SSNMR 構造規制の高番号を識別するために十分な品質の SSNMR データにつながる場合まだ顕微鏡次元にないアクセスを与えます。したがって、homomultimeric アセンブリのde novo SSNMR 構造決定、EM または長さあたりの質量 (MPL) データ理想的にはデータを補完 SSNMR 対称性パラメーターを取得します。SSNMR データだけでは原子と分子間のインタ フェースを提供します。
SSNMR は EM または MPL の測定などの構造技術の高い補完性が、データは変異または切り捨てられたサブユニットの溶液 NMR や x 線結晶構造解析による原子構造と完全に結合できます。研究数の増加は、異なる構造データの連動が高分子アセンブリ (代表的な例については、図 6を参照) の原子の 3 D モデルを決定するため許可されている文献で見つけることができます。
構造生物学の分野、研究する有望な手法として現れる SSNMR不溶解性および非晶質アセンブリ、原子レベル、すなわち構造データを提供する原子スケールで。この点で、SSNMR はウイルスの封筒、細菌のフィラメント、アミロイド、RNA などのネイティブ環境および蛋白質のアセンブリ内膜タンパク質を含む分子の x 線結晶解析および溶液 NMR にペンダントとRNA 蛋白質の複合体 (たとえば、81を参照してください)。その汎用性の高いアプリケーションの in vitro細胞において、二次、第三紀と第四紀の構造変化の追跡などパートナー分子原子スケール (たとえば82) とインタラクション サーフェスを識別してマッピング分子動力学組み立てられた複合体のコンテキストでは、複雑な生体分子のアセンブリの将来の構造研究で SSNMR の重要な可能性を示します。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>コンポーネント</td>
			<td>M9 媒体</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>0.5 グラム/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 グラム/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6.7 グラム/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 Μ M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>した FeCl3</td>
			<td>1 Μ M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 Μ M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM ビタミン ミックス 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13C グルコース</td>
			<td>2 グラム/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15NH4Cl</td>
			<td>1 グラム/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表 1:組換え蛋白質の最小限の式中の組成の生産大腸菌 BL21 セル。

マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (SSNMR) の進歩は、原子分解高分子タンパク質複合体の構造解析のための効率的なツールを提供しています。これらの蛋白質のアセンブリは、多くの生物学的プロセスに重要な役割を果たすユビキタス システムです。その分子構造と相互作用とダイナミクスの示されているように SSNMR 研究によってアクセス可能ウイルス (カプシド1) 細菌感染メカニズム (分泌システム2,3、4ピリ pili)、膜タンパク質複合体5,6,7,8と機能性アミロイド9,10,11。この型分子集合体のタンパク質が変性、アミロイドの状態で組み立てる、異常細胞の挙動や細胞死12,13の原因と神経変性疾患のように病態を引き起こすことができるも。タンパク質複合体は頻繁に対称線維、フィラメント、毛穴、チューブ、ナノ粒子など様々 な形状の大きな分子オブジェクトに蛋白質の亜単位の倍数コピー重合によって造られます。第四紀のアーキテクチャは、空間的で、一時的なアセンブリを編成し、高度な生物学的機能を可能にする蛋白質の亜単位間の弱い相互作用によって定義されます。彼らの非結晶性が従来の x 線結晶構造解析や nmr の使用を制限する非常によくとこれらのアセンブリの原子スケールでの構造の調査は高解像度技術のための挑戦の本質的な不溶性近づきます。マジック角回転 (MAS) SSNMR は不溶性高分子アセンブリの原子分解能データを取得する新興技法など複雑な生体システムの増加する数の 3 D 原子モデルを解決するその効率を証明されています細菌のフィラメント、アミロイドのアセンブリおよびウイルス粒子14,15,16,17,18,19,20、 21,22。強磁場、方法論開発、前処理技術の進歩が顕著で、生物学的に関連した、さまざまな環境で、高分子不溶性タンパク質を調査する手法に MAS SSNMR を確立します。組み立て状態や細胞膜、技術の高いクライオ電子顕微鏡法を補完するものを作るします。多くの場合、対称性の非常に高いこのようなタンパク質複合体の特徴です。Homomolecular アセンブリ内のすべてのタンパク質サブユニットが同じローカル構造であることとして、MAS SSNMR はこの機能を悪用し、したがって事実上同じ SSNMR 署名、分析の複雑さを大幅に削減します。
中程度の MAS の高分子タンパク質複合体の構造の研究のための効率的なプロトコル (&#60; 25 kHz) SSNMR このビデオで提示し、別の手順 (図 1) に分割することができます。糸状のタンパク質のアセンブリ (図 1のステップを強調表示を参照してください)、蛋白質サブユニットの浄化を除いて各蛋白質の異なる例示 SSNMR 構造研究のワークフローの重要な段階を目指しますアセンブリが極めて重要な構造の研究とどのような専門的なチュートリアルは SSNMR 分光法で構造計算の技術・方法論の詳細に入ることがなく、利用可能なオンライン。現在のプロトコル MAS 条件下で固体 NMR 実験に焦点を当てますの使用対応して生物的環境23,24,25,26,27、配向膜などタンパク質の立体構造と膜のようなメディアの MAS 技術なし動的蛋白質間相互作用の調査を可能にします。タンパク質発現アセンブリ手順と重要な SSNMR スペクトル解析と解釈の記録を紹介します。SSNMR 法による高分子アセンブリの原子分解能構造解析を実行するリーダーを有効にする構造解析パイプラインへの洞察を提供するためを目指しています。
プロトコルには、3 つのセクションが含まれます。
1. 固体 NMR サンプル生産
固体 NMR 解析の前提条件、[表現される高分子アセンブリの必要性のタンパク質成分、同位体標識、精製され、組み立てられた生体外で(使用例は図 2) ネイティブのような複雑な状態に.確実に高感度 NMR、 13C、 15N 標識同位体濃縮は最小限細菌式培地13C や15N など、一様に13を使用して必要ですC 標識グルコース/グリセリンと15NH4Cl それぞれ。プロトコルの後の段階で選択的に13C 標識サンプル生成選択的13C 標識ソースなど (1, 3-13C)-、(2-13C)-グリセロール (または (1-13C)-、(2-13C)-ブドウ糖) NMR 解析を容易にするために使用されます。50 15n-と 50 13C 標識または 50% の等モル混合物に対応する混合ラベル サンプル (1, 3-13C)-50% (2-13C)-グルコース分子の検出を説明する導入相互作用。アセンブリ ステップの間に厳密な条件と同様、蛋白質の純度の高度は、最後のサンプルの均質構造秩序を保証するために重要な要因です。
2 一次元 (1 D) 固体 nmr 法に基づく予備の構造評価
SSNMR による構造解析のための重要な実験を紹介します。一次元 (1 D) 交差偏波 (CP) と INEPT/RINEPT28実験、 13C 核の検出を使用アセンブリでそれぞれ、剛構造と柔構造のタンパク質セグメントを検出し、構造のある程度を推定するには均一性とローカル ポリモーフィズム (の例が、図 3を参照としている場合)。
<st></st>栄 > 3。立体配座解析と 3次元構造の決定
1 と 2 のサブセクションにかかわる化学シフトはローカル環境に非常に敏感なプローブとピピ/psi を予測するために蛋白質のアセンブリのすべての剛体残留 SSNMR 共鳴割り当てに基づく立体構造の解析二面角し、それによって二次構造を決定します。図 4は、蛋白質のアセンブリ.の硬質コアでシーケンシャル共鳴割り当ての例を示します3 D 構造の決定は構造のデータのコレクションなどに基づいてエンコード距離拘束高速交通 (&#60; 7-9 Å)、内と分子間情報の両方を含みます。3 と 4 では、長距離の遠い拘束コレクションと解釈を説明します。長距離接触が生じる残渣から私 j、すると分子内13c-13C 近接電波として定義されます | i j |≥4、それによりタンパク質における立体折り単量体のサブユニットの分子間13c-13C の近接電波としての定義、アセンブリ内の蛋白質の亜単位の分子間のインターフェイスを定義します。内・分子間のインターフェイスを図 5に示します。SSNMR 拘束検出13c-13C、 15N-13C シフトリ実験は通常流行り廃り距離エンコード &#60; 1 nm。第四款は、分子間の距離の制約の検出を説明します。対称的なタンパク質複合体、同質ラベル サンプル (すなわち一様にまたは選択的に標識 100%) の使用のサブユニットの分子間相互作用の特定の限られたのとして両方内- と間分子連絡先につながる検出信号。分子間の近接電波の明確な検出は、集計前に組み合わせる 2 つの異なるラベルのサンプルの等モル混合物を含む混合のラベル サンプルを使用して実現されます。第 5 款構造のモデリングを簡単に紹介します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
図 1:固体 nmr 法による原子分解能構造解析のワークフロー 。13C、 15N 同位体標識タンパク質の生産、精製サブユニット、サブユニット集合、集合体の形成、SSNMR 実験、SSNMR 実験解析、距離拘束の抽出の制御および構造のモデリングが表示されます。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Instruments</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR Spectrometer (&#62; 11.7 Tesla)</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">triple resonance MAS SSNMR probehead&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SSNMR rotors 4mm</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">K1910</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Centrifuge 5804 R&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5805000629</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">GeneQuant 1300 spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">28-9182-13</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">228001</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MaxQ 4450 bench top orbital shaker</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">78376</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tube Revolver Agitator</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">79547</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sonopuls HD 3100</td>
			<td style="width:117px;">Bandelin</td>
			<td style="width:119px;">3680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MicroPulser electroporator</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">mini-PROTEAN tetra cell system</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AKTA pure system</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-24</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillary microman M25 pipet</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148502</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Materials</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">amiconR ultra-15</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z740199-8EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillaries and pistons</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148112</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">spatula</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13263799</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">D-glucose 13C6</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">389374</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Ammonium-15N-chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">299251</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">1,3 13C2 glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">492639</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">2 13C glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">489484</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K1876</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3416</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7907</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71380</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208094</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Iron Chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">157740</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Zinc chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">793523</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MEM Vitamin Solution (100&#215;)</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M68954</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">IPTG</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tricine</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SDS</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">436143</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sodium azide</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">71289</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">178837</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Softwares</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Unicorn 6.3</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Akta systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">ccpNMR</td>
			<td style="width:117px;">CCPN&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">spectrometer systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy

超分子タンパク質複合体は、宿主-病原体相互作用、神経変性疾患の伝播にウイルス感染に至る生物学的プロセスの基本的な役割を果たします。このようなアセンブリは、複数の蛋白質の亜単位が様々 な細胞機能を実行したり、有害な結果を引き起こす大きい高分子オブジェクトを形成する非共有結合方法で編成で成っています。原子力洞察力アセンブリ機構、高分子アセンブリの機能が頻繁に彼らの固有の不溶性以来乏しいと非結晶性しばしば劇的にほとんどの技術から得られたデータの品質が低下構造生物学、x 線結晶構造解析や核磁気共鳴 (NMR) ソリューションなどで使用されます。我々 は原子分解能での高分子アセンブリの構造を調査するための強力な方法としてマジック角回転固体 NMR 分光法 (SSNMR) を紹介します。SSNMR は原子サイズと溶解性の制限なし組み立てられた複雑な詳細を明らかにできます。ここで提示されたプロトコルは、 13C の生産に不可欠な手順をについて説明します/15N 同位体標識高分子蛋白質アセンブリ SSNMR スペクトルとその分析と解釈の標準の獲得に。例として、糸状タンパク質アセンブリの SSNMR 構造解析のパイプラインを示します。

典型的な SSNMR ワークフローには、図 1に示すいくつかの手順が含まれています。通常蛋白質の亜単位はエシェリヒア属大腸菌の異種発現の in vitroによる生産・浄化・静的な条件でも揺れが時々 を組み立ています。蛋白質の亜単位の表現そして浄化は、SDS ゲル クロマトグラフィー (図 2 a) が続いています。電子顕微鏡 (EM) 解析による高分子アセンブリの形成を確認しことができます (糸状のアセンブリの例は図 2 bを参照)。
SSNMR ローターに蛋白質のアセンブリの導入後分光計にローターを挿入、MAS 周波数および温度を規制、スペクトルが記録されます。1 D SSNMR による最初の洞察が得られます。図 3は、構造的に均質な蛋白質のサンプル、 1h-13C CP スペクトル、13C 共鳴で蛋白質の亜単位の硬質コアの存在を明らかに13C のチャネル上で検出された典型的な SSNMR FID を示しています、アセンブリ、およびモバイルの残基を表す 2D 1h-13C 不適切なスペクトル。アセンブリ構造の硬質コアの原子洞察は、多次元 SSNMR 実験する必要がありますに記録される均一に、選択的に標識 SSNMR 共鳴を最初に割り当てるし、(の図 4 を参照してください長距離近接電波を検出する試料).
すべてのスペクトルは、割り当てる SSNMR 共鳴し内と分子間距離拘束条件 (図 5) を抽出する適切なソフトウェアで解析処理します。SSNMR 距離拘束が単独で使用されるかまたは相補的な技術からのデータと組み合わせて、これは、モデリング プログラムに統合できます。
SSNMR 技術によって解決高分子アセンブリの代表的な原子構造は、図 6は、細菌の付属とアミロイド線維から糸状のアセンブリのいくつかを示します。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
図 6:固体 NMR 手法によって決定された糸状高分子構造: 細菌のフィラメントおよびアミロイド線維。A)尿路エシェリヒア属大腸菌、PDB コード 2N7H 4の 1 型線毛B) ASC フィラメント、PDB コード 2N1F 63;C) III 型分泌システム針、PDB コード 2MME、2LPZ、2MEX 2,3,64;D) AB42 β アミロイド線維、PDB コード 2NAO、5KK3、2MXU 65,66,67大阪変異 PDB コード 2MVX 57, アイオワ州変異 PDB コード 2MPZ 58;E) α-シヌクレイン線維、PDB コード 2N0A 68;F) ヘットのプリオン ドメイン、PDB コード 2RNM、2KJ3 69,70。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

原子分解能で分子タンパク質複合体の構造は、多様な生命現象で重要な役割のため関連性が高いです。ここで、マジック角回転固体核磁気共鳴分光法 (MAS SSNMR) による不溶性と非晶質高分子タンパク質複合体の高分解能構造解析を実行するためのプロトコルを提案する.

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