Name: atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00
Duration: 14 min 55 s
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Este trabalho é financiado pela ANR (13-PDOC-0017-01 para B.H. e ANR-14-CE09-0020-01 para A.L.), "Os investimentos para o futuro" programa IdEx Bordeaux/CNRS (PPEs 2016 para B.H.) referência ANR-10-IDEX-03-02 para B.H., da Fondation pour la Recherche Médicale ( FRM-AJE20140630090 para A.L.), o programa do 7PQ (FP7-pessoas-2013-CIG para A.L.) e o Conselho Europeu de investigação (CEI) sob Horizonte 2020 investigação e inovação programa da União Europeia (ERC começando Grant para A.L., acordo n 639020) e o projeto " WEAKINTERACT."

Os autores não têm nada para divulgar.

NMR Solid-State (SSNMR) é um método de escolha para caracterizar assemblies de proteína macromolecular no nível atômico. Uma das questões centrais na determinação da estrutura baseada em SSNMR é a qualidade espectral do sistema investigado, que permite estabelecer modelos estruturais 3D de precisão vários, geralmente variando de modelos de baixa resolução (contendo o secundário estrutura elementos e pouca informação 3D) para estruturas 3D pseudo atômicas. A quantidade e qualidade de informações estruturais, extraídas de experiências multidimensionais de SSNMR é a chave para calcular uma estrutura NMR de alta resolução da Assembleia.
O protocolo descrito baseia-se na detecção de 13C -13C e 15N -13C estruturais restrições que exigem a gravação dos vários espectros 2D (e às vezes 3D) com alto sinal-ruído. Em frequências de MAS moderadas (&#60; 25 kHz), a amostra é introduzida em rotores com tamanhos de 3.2-4 mm de diâmetro permitindo a quantidades de proteína de até ~ 50 mg, dependente da hidratação de amostra. A quantidade de amostra no interior do rotor é diretamente proporcional a relação sinal-ruído em espectros SSNMR, um factor decisivo para a detecção de restrições de distância de longo alcance e sua atribuição inequívoca.
A resolução espectral é um parâmetro crucial durante a atribuição de ressonância sequencial e a coleção de restrições. Para obter melhores resultados, os parâmetros de preparação de amostra precisam ser otimizado, particularmente na purificação da subunidade e as condições de montagem (pH, tampão, agitação, temperatura, etc.). Para a otimização de amostra, é recomendável para preparar amostras sem rótulo para várias condições distintas para as quais tem sido observada a montagem e para gravar um 1D 1H -13C CP espectro (descrito no passo 2.1) em cada amostra preparada. Os espectros servem para comparar a resolução espectral e dispersão entre as preparações diferentes, com base em que as condições ideais podem ser determinadas.
A qualidade dos dados SSNMR depende fortemente da escolha dos parâmetros de aquisição NMR, especialmente para as etapas de transferência de polarização. O uso de alta intensidade de campo magnético (frequência de ≥600 MHz 1H) é essencial para a alta sensibilidade e resolução espectral, necessária quando encaramos o complexos alvos como assemblies de proteína macromolecular.
Em muitos casos, um factor limitativo é a disponibilidade do espectrômetro. Portanto, uma escolha criteriosa das amostras para ser preparado deve preceder a sessão espectrômetro. Em qualquer caso, um uniformemente 13C, 15amostra N-etiquetado é um pré-requisito para realizar a atribuição de ressonância sequencial e intra residual. Para proteínas atribuídas por NMR Solid-State técnicas consulte71. Determinação da estrutura de conjuntos macromoleculares em frequências de MAS moderados seletivamente requer 13C-rotulado de amostras; para a detecção de longo alcance 13C -13C e 13C -15N entra em contato com amostras baseadas em 1,3 -13C - e 2 -13C-gylcerol e/ou 1 -13C - e 2 -13C-glicose rotulagem são comumente utilizados, como descrito acima. A escolha entre os dois esquemas de rotulagem baseia o espectral relação sinal-ruído e resolução. Para distinguir entre intrae intermoleculares contatos de longo alcance, mistas etiquetadas e diluídas amostras revelaram-se eficientes.
Em suma, os passos críticos para um estudo estrutural de SSNMR atômico são: (i) a preparação das subunidades e a necessidade de montagem de ser otimizado para obter a amostra de excelente quantidade e qualidade, (ii) o espectrômetro campo força e aquisição parâmetros precisam ser escolhidas com cuidado; (iii) seletivas estratégias de rotulagem são necessárias para a determinação da estrutura 3D e a quantidade de dados necessárias depende da qualidade dos dados e a disponibilidade de dados complementares.
Apesar de sua aplicabilidade a uma ampla gama de sistemas supramoleculares variando de proteínas de membrana de homomultimeric nano-objetos, SSNMR é muitas vezes limitada pela necessidade de mg-quantidades de material desvendar rotulada. Os recentes desenvolvimentos tecnológicos no ultra rápido MAS (≥100 kHz) SSNMR aberta uma via para 1H-detectado NMR e empurrar o limite da quantidade de amostra mínima para sub-mg 72,73,74. No entanto, para estudos detalhados estruturais 13C-rotulado amostras são indispensável, que limita a aplicação de SSNMR para amostras montadas em vitro ou sistemas expressados em organismos que sobrevivem em meio mínimo onde na célula SSNMR é um método emergente (para comentários Veja 75,,76,7778).
Um fator importante na aplicação de SSNMR para obter estruturas 3D de alta resolução é a resolução espectral: heterogeneidade conformacional intrínseca em um assembly pode limitar a análise de espectros e resolução espectral. Resíduo específico 13C rotulagem pode em alguns casos fornecem uma alternativa para obter informações específicas de distância estratégicas resíduos a fim de obter modelos estruturais (para uma recente exemplos ver 79,,80).
SSNMR para determinação da estrutura 3D ainda requer a recolha de vários conjuntos de dados com tempos de coleção de dados muitas vezes longos em instrumentos sofisticados, dependendo da abordagem e o sistema de vários dias ou semanas em um 600-1000 MHz (frequência de1H) espectrômetro. Portanto, o acesso ao tempo de espectrômetro pode ser um fator limitante em um estudo aprofundado de SSNMR.
No caso de conjuntos de proteínas homomultimeric, levando a dados SSNMR de qualidade suficiente para identificar um elevado número de apoios estruturais, tais como em 3,57,64,70, SSNMR Ainda dá sem acesso às dimensões microscópicas. Portanto, em uma determinação de estrutura de novo SSNMR de um conjunto de homomultimeric, EM ou massa-por-comprimento (MPL) dados complementam idealmente SSNMR dados para derivar os parâmetros de simetria. SSNMR dados sozinhos fornecer o atômica intrae intermoleculares interfaces
SSNMR é altamente complementar com técnicas estruturais, tais como medições EM ou MPL, mas os dados também perfeitamente podem ser combinados com estruturas atômicas obtidas por cristalografia de raios x ou NMR do solução em subunidades mutadas ou truncadas. Um número crescente de estudos pode ser encontrado na literatura, onde o conjunto de dados estruturais diferentes permitiu determinar atômicos modelos 3D de conjuntos macromoleculares (consulte a Figura 6 para exemplos representativos).
No campo da biologia estrutural, SSNMR surge como uma técnica promissora para estudarinsolúveis e não cristalina assemblies nos atômico nível, ou seja, fornecendo dados estruturais na escala atômica. A este respeito, SSNMR é o pendente de solução NMR e cristalografia de raios x para assemblies moleculares, incluindo proteínas de membrana em seus conjuntos de ambiente e proteína nativos como envelopes virais, bacterianos filamentos ou amiloides, bem como a RNA e Complexos de RNA-proteína (ver, por exemplo,81). Suas aplicações altamente versátil em vitro e no contexto celular, tais como o acompanhamento de alterações estruturais secundárias, terciárias e quaternários, identificação de superfícies de interação com moléculas de parceiro na escala atômica (por exemplo, 82) e mapeamento de dinâmica molecular no contexto dos complexos montados, indicam o potencial importante de SSNMR em futuros estudos estruturais complexas biomolecular assemblies.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente de</td>
			<td>M9 médio</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0,5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6,7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mistura de vitamina MEM 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C-glicose</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Composição do meio de expressão mínima para a proteína recombinante produção em Escherichia coli células de BL21.

Avanços na magia-ângulo girando espectroscopia da ressonância magnética nuclear Solid-State (SSNMR) para oferecer uma ferramenta eficiente para a caracterização estrutural de assemblies de proteína macromolecular em uma resolução atômica. Esses assemblies de proteína são onipresentes sistemas que desempenham funções essenciais em muitos processos biológicos. Suas estruturas moleculares, interações e a dinâmica é acessível através de estudos SSNMR, como foi demonstrado por viral (capsids1) e mecanismos de infecção bacteriana (secreção sistemas2,3, pili4), a membrana proteína complexos5,6,7,8 e funcional amiloides 9,10,11. Este tipo de montagem molecular pode também provocar patologias tais como em doenças neurodegenerativas onde proteínas montar nos Estados de misfolded, amiloides e causam comportamento aberrante cela ou célula morte 12,13. Assemblies de proteína são construídos frequentemente pela oligomerização simétrica de cópias múltiplas de subunidades proteicas em grandes objetos supramoleculares de várias formas, incluindo fibras, filamentos, poros, tubos ou nanopartículas. A arquitetura do quaternária é definida por interações fracas entre subunidades proteicas para organizar a montagem espacial e temporal e para permitir a sofisticadas funções biológicas. Investigações estruturais em uma escala atômica sobre esses assemblies são um desafio para técnicas de alta resolução desde sua insolubilidade intrínseca e muitas vezes sua cristalinidade-não restringe o uso de cristalografia de raios x convencional ou solução NMR aproxima-se. Magia-ângulo girando SSNMR (MAS) é uma técnica emergente para obter dados de resolução atômica sobre conjuntos macromoleculares insolúveis e provou sua eficiência para resolver 3D modelos atômicos para um número crescente de sistemas biomoleculares complexas incluindo filamentos bacterianos, assemblies amiloides e partículas virais 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Avanços técnicos na altos campos magnéticos, desenvolvimentos metodológicos e preparação da amostra estabeleceu SSNMR MAS em um método robusto para investigar proteínas insolúveis em vários ambientes, nomeadamente na sua biologicamente relevantes macromoleculares montados estaduais ou nas membranas celulares, tornando a técnica altamente complementares para microscopia cryo-elétron. Em muitos casos, um elevado grau de simetria caracteriza tais conjuntos de proteína. MAS SSNMR explora esse recurso, como todas as subunidades de proteína em uma montagem de homomolecular teria a mesma estrutura local e, portanto, praticamente a mesma SSNMR assinatura, reduzindo drasticamente a complexidade da análise.
Um protocolo eficiente para estudos estruturais de assemblies de proteína macromolecular por MAS moderadas (&#60; 25 kHz) SSNMR é apresentado neste vídeo e pode ser subdividido em diferentes etapas (Figura 1). Vamos demonstrar as fases críticas de fluxo de trabalho de um estudo estrutural de SSNMR, exemplificado em um conjunto de proteínas filamentosas (consulte destacada as etapas na Figura 1), com exceção de purificação de proteínas subunidade, diferindo para cada proteína montagem, mas de fundamental importância para estudos estruturais e sem entrar nos detalhes técnicos/metodológicos de cálculo de estrutura e espectroscopia SSNMR de que tutoriais especializados estão disponíveis online. Enquanto o presente protocolo terá como principal foco no estado sólido NMR experimentos, realizados em condições MAS, o uso de alinhado ambientes biológicos 23,24,25,26 , 27, tais como bicelles alinhados, permitem a investigação de conformação de proteínas e interação dinâmica da proteína-proteína na membrana, como mídia sem tecnologia MAS. Vamos mostrar a expressão da proteína e passos de montagem, bem como a gravação de espectros de SSNMR cruciais e sua análise e interpretação. O nosso objectivo é fornecer insights sobre o pipeline de análise estrutural, permitindo o leitor a realizar um estudo estrutural de resolução atômica de um assembly macromolecular por técnicas SSNMR.
O protocolo abrange 3 seções:
1. produção de amostra NMR Solid-State
Como um pré-requisito para uma análise de NMR Solid-State, os componentes proteicos da montagem macromolecular precisam ser expressos, isótopo-etiquetadas, purificada e montado em vitro no estado complexo como de um nativo (para um ver exemplo Figura 2) . Para garantir alta sensibilidade NMR, enriquecimento de isótopo em 13C e 15N rotulagem é necessário através da utilização de meios de expressão bacteriana mínimo suplementados com 13C e fontes de N 15, como uniformemente 13 C-rotulado glicose/glicerol e 15NH4Cl respectivamente. Em fase posterior do protocolo, 13C-rotulado amostras produziram seletivamente com seletivamente 13fontes C-rotulados como (1,3 -13C)- e (2 -13. C)-glicerol (ou (1 -13. C)- e (2 -13. C)- glicose) são usados para facilitar a análise de NMR. Mista rotulada amostra correspondente a uma mistura equimolar de 50% 13C-rotulados ou 50% e 50% 15N - (1,3 -13C)- e 50% (2 -13. C)-glicose são introduzidos para descrever a detecção de intermoleculares interações. Um alto grau de pureza da proteína, bem como condições rigorosas durante a etapa de montagem são factores-chave para garantir uma ordem estrutural homogênea da amostra final.
2. preliminar caracterização estrutural baseada em NMR Solid-State de unidimensional (1D)
Apresentamos as experiências essenciais para uma análise estrutural por SSNMR. Unidimensional (1D) polarização cruzada (CP) e INEPT / experimentos de28 RINEPT, detectados no 13C núcleos são usados para detectar segmentos de proteína rígida e flexível na montagem, respectivamente e para estimar o grau de estrutural homogeneidade e polimorfismo local (para um ver exemplo, Figura 3).
<st></st>rong &gt; 3. Determinação da estrutura de análise conformacional e 3D
Subseções 1 e 2 dizem respeito a análise conformacional, que baseia-se na atribuição de ressonância SSNMR de todos os resíduos rígidos da Assembleia de proteína, como as mudanças químicas são sondas muito sensíveis ao ambiente local e podem ser usadas para prever a phi/psi diedro ângulos e, assim, determinar a estrutura secundária. A Figura 4 ilustra um exemplo de uma atribuição de ressonância sequencial no núcleo rígida de um conjunto de proteínas. A determinação da estrutura 3D baseia-se a recolha de dados estruturais tais como restrições de distância codificação fechem proximidades (&#60; Å 7-9), que contém ambos intrae intermoleculares informações. Subseções, 3 e 4 descrevem interpretação e coleção de contenção distante de longo alcance. Contatos de longo alcance são definidos como intramolecular 13C -13C proximidades provenientes de resíduos a j, com | i-j | ≥4, definindo assim a dobra de proteína terciária de subunidade monomérica, ou como intermoleculares 13C -13C proximidades, definir as interfaces intermoleculares entre subunidades proteicas no assembly. Intrae intermoleculares interfaces são ilustrados na Figura 5. Apoios SSNMR detectado através de 13C -13C e 15N -13C reassociação experimentos geralmente codificam para distâncias internuclear &#60; 1 nm. Subsecção 4 explica a detecção de restrições de distância intermolecular. Nas assembleias de proteína simétrica, o uso de amostras homogeneamente rotulados (ou seja, 100% uniformemente ou seletivamente rotulado) para identificar as interações intermoleculares subunidade-subunidade é limitado, como ambos intrae inter - molecular contatos levam a sinais detectáveis. A detecção inequívoca de proximidades intermoleculares é conseguida usando amostras etiquetadas mistas, contendo uma mistura equimolar de duas amostras diferente rotuladas, combinado antes da agregação. Subseção 5 introduz brevemente a modelagem da estrutura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
Figura 1 : Fluxo de trabalho de um estudo estrutural de resolução atômica por NMR Solid-State. 13 C, 15N isótopo rotulado de produção de proteína, purificação de subunidade, montagem de subunidade, controle de formação de montagem, SSNMR experiências, análise do experimento SSNMR e extração de restrições de distância, e modelagem da estrutura são mostrados. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Instruments</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR Spectrometer (&#62; 11.7 Tesla)</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">triple resonance MAS SSNMR probehead&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SSNMR rotors 4mm</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">K1910</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Centrifuge 5804 R&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5805000629</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">GeneQuant 1300 spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">28-9182-13</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">228001</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MaxQ 4450 bench top orbital shaker</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">78376</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tube Revolver Agitator</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">79547</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sonopuls HD 3100</td>
			<td style="width:117px;">Bandelin</td>
			<td style="width:119px;">3680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MicroPulser electroporator</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">mini-PROTEAN tetra cell system</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AKTA pure system</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-24</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillary microman M25 pipet</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148502</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Materials</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">amiconR ultra-15</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z740199-8EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillaries and pistons</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148112</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">spatula</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13263799</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">D-glucose 13C6</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">389374</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Ammonium-15N-chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">299251</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">1,3 13C2 glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">492639</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">2 13C glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">489484</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K1876</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3416</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7907</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71380</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208094</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Iron Chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">157740</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Zinc chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">793523</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MEM Vitamin Solution (100&#215;)</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M68954</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">IPTG</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tricine</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SDS</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">436143</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sodium azide</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">71289</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">178837</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Softwares</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Unicorn 6.3</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Akta systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">ccpNMR</td>
			<td style="width:117px;">CCPN&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">spectrometer systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy

Conjuntos supramoleculares proteína papel fundamental nos processos biológicos variando de interação patógeno-hospedeiro, infecção viral para a propagação de doenças neurodegenerativas. Esses assemblies consistem em múltiplas subunidades proteicas, organizadas de forma não-covalente para formar objetos macromoleculares grandes que podem executar uma variedade de funções celulares ou causar consequências prejudiciais. Atômicas insights sobre os mecanismos de montagem e o funcionamento desses assemblies macromoleculares frequentemente permanecem escassos desde sua insolubilidade inerente e não-cristalinidade reduz muitas vezes drasticamente a qualidade dos dados obtidos da maioria das técnicas de usado em biologia estrutural, tais como a cristalografia de raio-x e ressonância magnética Nuclear (NMR) de solução. Aqui apresentamos a espectroscopia de RMN Solid-State de magia-ângulo de giro (SSNMR) como um método poderoso para investigar estruturas de conjuntos macromoleculares em resolução atômica. SSNMR podem revelar detalhes atômicos no complexo montado sem limitações de tamanho e solubilidade. O protocolo aqui apresentado descreve as etapas essenciais da produção de 13C / conjuntos de isótopo-etiquetou a proteína macromolecular15N à aquisição de padrão SSNMR de espectros e sua análise e interpretação. Como exemplo, mostramos o pipeline de uma análise estrutural do SSNMR de um conjunto de proteínas filamentosas.

O fluxo de trabalho típico de SSNMR inclui várias etapas, ilustradas na Figura 1. Geralmente as subunidades de proteína são produzidas por em vitro expressão heteróloga em e. coli, purificadas e montadas sob a tremer, mas às vezes também em condições estáticas. Expressão e purificação de subunidade proteína são seguidos por cromatografia em gel de SDS (Figura 2A). A formação de conjuntos macromoleculares então pode ser confirmada pela análise de microscopia de elétron (EM) (ver Figura 2B para obter um exemplo de um assembly filamentoso).
Após a introdução da assembleia para o rotor SSNMR de proteína, o rotor é inserido o espectrômetro, a frequência de MAS e a temperatura são regulamentadas e registam-se os espectros. Primeiras percepções podem ser obtidas por técnicas SSNMR 1, D. A Figura 3 mostra um típico FID SSNMR, detectado no canal 13C em uma amostra de proteína estruturalmente homogênea, uma 1H -13C CP espectro, revelando as ressonâncias13C presentes no núcleo rígido de subunidade em proteína a montagem e um espectro C INEPTO 2D 1H -13, que representa os resíduos móveis. Para atômicas insights sobre o núcleo rígido da estrutura de montagem, multidimensional SSNMR experiências precisam ser gravadas em uniformemente e seletivamente rotulado amostras para atribuir primeiro as ressonâncias SSNMR e então detectar proximidades de longo alcance (ver Figura 4 de ).
Todos os espectros são processados e analisados com o software adequado para atribuir as ressonâncias SSNMR e extrair intrae apoios de distância intermolecular (Figura 5). As restrições de distância SSNMR também são utilizadas isoladamente ou em conjunto com dados de técnicas complementares, que podem ser integrados ao programa de modelagem.
Para estruturas atômicas representativas dos conjuntos macromoleculares resolvidos por técnicas SSNMR Figura 6 ilustra vários assemblies filamentos de apêndices bacterianas e amiloides.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
Figura 6:estruturas filamentosas macromoleculares, determinadas por uma abordagem de NMR Solid-State: filamentos bacterianos e fibrilas de proteína amiloide. A) tipo 1 pilus de uropathogenic e. coli, PDB código 2N7H 4; B) ASC filamento, PDB código 2N1F 63; C) agulhas de sistema de secreção tipo III, PDB códigos 2MME, 2LPZ e 2MEX 2,3,64; D) fibrilas de amiloide-beta AB42, PDB código 2NAO, 5KK3, 2MXU, 65,,66,67 e Osaka mutante PDB código 2MVX 57, Iowa mutante PDB código 2MPZ 58; E) fibrilas de alfa-synuclein, 2N0A de código PDB 68; F) domínio do prião HET-s, 2RNM de código PDB, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Estruturas de conjuntos supramoleculares proteína em resolução atômica são de alta relevância, por causa de seus papéis cruciais em uma variedade de fenômenos biológicos. Neste documento, apresentamos um protocolo para realizar estudos estruturais de alta resolução em assemblies de proteína macromolecular insolúvel e não cristalina por magia-ângulo girando espectroscopia da ressonância magnética nuclear Solid-State (MAS SSNMR).

Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear

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