Name: atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

Эта работа финансируется НРУ (13-PDOC-0017-01 B.H. и АНР-14-CE09-0020-01-а.л.), «Инвестиции в будущее» программы IdEx Бордо/CNRS (ПЗЛ 2016 в б.х.) Справочник АНР-10-IDEX-03-02 для б.х., Фонд pour la исследований сообщала ( FRM-AJE20140630090 до а.л.), FP7 программы (FP7-люди-2013-CIG до а.л.) и Совет европейских исследований (ERC) под исследовательской и инновационной программы Европейского союза по Horizon 2020 (ERC начиная Грант а.л., соглашение не 639020) и проект " WEAKINTERACT.»

Авторы не имеют ничего сообщать.

Твердотельного ЯМР (SSNMR) является методом выбора для характеризующие высокомолекулярных белков сборок на атомарном уровне. Одним из центральных вопросов в определении на основе SSNMR структуры является спектральной качество исследуемой системы, что позволяет установить 3D структурных моделей различных точности, обычно начиная с разрешением модели (содержащий вторичного Структура элементов и мало 3D информации) для псевдо-атомной трехмерных структур. Количество и качество структурных сведений, извлеченных из многомерного SSNMR экспериментов является ключом для вычисления структуру ЯМР высокого разрешения Ассамблеи.
Описывается протокол основывается на обнаружение 13C -13C и 15N -13C структурные ограничения требующие записи спектров несколько 2D (и иногда 3D) с высокой сигнал шум. При умеренной MAS частотах (&#60; 25 кГц), образец вводится в роторы с размерами 3,2-4 мм диаметром, позволяя для количеств белка до ~ 50 мг, зависит от образца гидратации. Количество образцов внутри ротора прямо пропорциональна соотношение сигнал шум в SSNMR спектры, решающим фактором для обнаружения дальнего расстояния ограничений и их однозначной назначения.
Cпектральное разрешение является параметром решающее значение во время присваивания последовательный резонанс и коллекции ограничений. Для получения оптимальных результатов, параметры подготовки образца должны быть оптимизированы, особенно в очищение субъединицы и Ассамблея условий (pH, буфера, тряска, температуры и т.д.). Пример оптимизации рекомендуется подготовить немеченого образцы для нескольких отдельных условий для которого наблюдается Ассамблеи и для записи 1D 1H -13C CP спектра (описано в шаге 2.1) на каждого подготовленного образца. Спектры служат для сравнения спектральное разрешение и дисперсия между различных препаратов, на основе которой можно определить оптимальные условия.
Качество данных SSNMR сильно зависит от выбора параметров приобретение ЯМР, особенно для передачи шаги поляризации. Использование высоких магнитных прочностями поля ( 1H частота ≥600 МГц) имеет важное значение для высокой чувствительности и спектральным разрешением, требуется когда сталкиваются сложных целей таких сборок высокомолекулярных белков.
Ограничивающим фактором во многих случаях является наличие спектрометр. Поэтому разумный выбор образцов должен быть подготовлен должно предшествовать спектрометр сессии. В любом случае, равномерно 13C, 15N-меченых образца является необходимым условием для выполнения назначения последовательных и внутри остаточного резонанс. Белки, присвоенный твердотельного ЯМР методами71см. Определение структуры макромолекулярных сборок при умеренной MAS частотах требует выборочно 13C-меченых образцов; для обнаружения на большие расстояния 13C -13C и 13C -15N контакты пробы, основанные на 1,3 -13C - и 2 -13C-gylcerol или 1 -13C - и 2 -13C-глюкозы маркировки являются обычно используется, как описано выше. Выбор между двумя схемами маркировки основана на спектральные отношение сигнал шум и резолюции. Чтобы различать внутри - и межмолекулярных контактов на большие расстояния, смешанные маркировку и разбавленных образцы показали эффективным.
Короче говоря, критические шаги для атомной SSNMR структурные исследования являются: (i подготовка подразделений и Ассамблее необходимо оптимизировать получить отличный образец количество и качество, прочность и приобретения параметры (ii) спектрометр поля должны быть выбраны тщательно; (iii) селективного маркировки стратегии необходимы для определения 3D структуры и количество требуемых данных зависит от качества данных и наличия дополнительных данных.
Несмотря на его применимость к широкому спектру супрамолекулярных систем, начиная от мембранных белков homomultimeric нано объекты SSNMR часто ограничивается потребность мг количество гетерогенны помечены материала. Последние технологические разработки в ультра-быстрой SSNMR MAS (≥100 кГц) открывают проспект 1H-обнаружены ЯМР и push предел количества минимальный пример суб мг 72,,7374. Тем не менее для детального изучения структурных 13C-меченых образцы являются незаменимыми, что ограничивает применение SSNMR образцы собраны в пробирке или систем, выраженные в организмах, которые выживают на минимальный средний, где в клеток SSNMR является новым методом (для отзывов см 75,76,77,78).
Важным фактором в SSNMR приложении, чтобы получить с высоким разрешением 3D структур является спектральное разрешение: встроенные конформационные гетерогенность в сборке может ограничить спектрального анализа спектров и резолюции. Остатков конкретных 13C маркировки может в некоторых случаях обеспечивают альтернативу получить определенное расстояние информацию о стратегических остатков с целью получения структурных моделей (для последних примеров см. 79,80).
SSNMR для определения 3D структуры по-прежнему требует коллекции нескольких наборов данных с временем сбора данных часто long на сложных инструментов, в зависимости от подхода и системы нескольких дней до недель на 600-1000 МГц (частота1H) спектрометр. Таким образом доступ к спектрометра время может быть ограничивающим фактором в углубленное исследование SSNMR.
В случае homomultimeric белка сборки, приводит к SSNMR данных достаточного качества, чтобы выявить большое количество структурных ограничений, таких как в 3,,5764,70, SSNMR по-прежнему дает без доступ к микроскопические размеры. Таким образом в определении структуры SSNMR de novo homomultimeric Ассамблеи, EM или массы в длину (MPL) данных идеально дополняют SSNMR данных для получения параметров симметрии. SSNMR данных только обеспечивают атомной внутри - и межмолекулярных интерфейсов
SSNMR отлично дополняют друг друга с структурные методы, такие как EM или MPL измерения, но данные могут также прекрасно сочетается с атомных структур, полученные кристаллографии рентгеновского снимка или решения ЯМР на мутировавших или усеченных субъединиц. Все большее количество исследований можно найти в литературе, где совместно различных структурных данных позволило для определения атомного 3D моделей высокомолекулярных сборок (см. Рисунок 6 представитель примеры).
В области структурной биологии SSNMR появляется как перспективный способ изучениянерастворимый и некристаллических сборки в атомной, т.е. предоставление структурных данных уровня атомного масштаба. В этой связи, SSNMR является Кулон решение ЯМР и рентгеноструктурного анализа для молекулярной сборки, включая мембранных белков в их родной среде и белка сборок, таких как вирусный конверты, бактериальных нитей или Амилоиды, а также РНК и РНК белковых комплексов (см., например,81). Его чрезвычайно универсальным приложениям в пробирке и в контексте сотовой, например отслеживание вторичные, третичные и четвертичные структурных изменений, выявление поверхности взаимодействия с молекулами партнера на атомной шкале (например, 82) и картирование молекулярной динамики в контексте собрал комплексов, указывают важный потенциал SSNMR в будущих структурных исследований сложных биомолекулярных сборок.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Компонент</td>
			<td>M9 среднего</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0,5 г/Л</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 г/Л</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6,7 г/Л</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 мм</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 МКМ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 МКМ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 МКМ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM витамин смесь 100 X</td>
			<td>10 мл/Л</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C-глюкоза</td>
			<td>2 г/Л</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 г/Л</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Таблица 1: Состав минимальной выражение среды для рекомбинантных белков производство в E. coli клетки BL21.

Достижения в магии угол спиннинг твердотельного ЯМР спектроскопии (SSNMR) предлагают эффективный инструмент для структурной характеристики сборок высокомолекулярных белков в атомной резолюции. Эти сборки белков являются вездесущими систем, которые играют важную роль во многих биологических процессах. Их молекулярные структуры, взаимодействий и динамика доступны для SSNMR исследований, как уже было показано для вирусных (1capsids) и механизмы бактериальной инфекции (секреции систем2,3, пили4), мембраны белковых комплексов5,6,,78 и функциональных Амилоиды 9,10,11. Этот тип молекулярной сборки может также провоцировать патологий, таких как в нейродегенеративных заболеваний, где белки собрать в Протеолиз, амилоида государствах и вызвать поведение аномальные клетки или клетки смерти 12,13. Белка сборки часто строятся путем симметричного олигомеризации кратные копий субблоков белок в больших супрамолекулярные объектов различной формы, включая фибрилл, нитей, поры, трубы или наночастиц. Четвертичные архитектура определяется слабого взаимодействия между белковых субъединиц организовать пространственной и временной Ассамблеи и для проведения сложных биологических функций. Структурные исследования на атомной шкале на эти сборки являются вызовом для высокого разрешения методов с их внутренней нерастворимость и очень часто их не кристалличности ограничивает использование обычных рентгеноструктурного анализа или решения ЯМР подходы. Магия угол спиннинг (MAS) SSNMR является новой техникой для получения данных атомной резолюции нерастворимые высокомолекулярные сборок и доказал свою эффективность для решения 3D атомной модели для все большего числа сложных биомолекулярных систем, включая Бактериальные нитей, амилоида сборки и вирусных частиц 14,,1516,,1718,19,20, 21,22. Технические авансы на высоких магнитных полей, методологических разработок и подготовки проб создала MAS SSNMR в надежный метод расследовать нерастворимые белки в различных средах, особенно в их биологически соответствующих высокомолекулярных соединений собрал государством или в клеточных мембран, что делает технику очень дополнение к крио электронной микроскопии. Во многих случаях очень высокая степень симметрии характеризует такие сборки белков. MAS SSNMR использует эту функцию, как всех субблоков протеина в сборке homomolecular будет иметь ту же структуру местных и поэтому практически одинаковую подпись SSNMR, резко уменьшая сложность анализа.
Эффективный протокол для структурных исследований высокомолекулярных белков сборок по умеренной MAS (&#60; 25 кГц) SSNMR представлены в этом видео и могут быть разделены на различные этапы (рис. 1). Мы продемонстрируем критических этапов рабочего SSNMR структурные исследования свидетельствуют о волокнистых белков Ассамблеи (см. выделены шаги на рис. 1), за исключением очистки субъединицы белка, различные для каждого белка Ассамблея но решающее значение для структурных исследований и не вдаваясь в технические/методологические детали SSNMR спектроскопии и структуры расчета какие специализированные учебники доступны онлайн. Хотя настоящий Протокол будет главным образом сосредоточена на твердотельного ЯМР эксперименты, проведенные в условиях MAS, использование выровнены биологических сред 23,24,25,26 , 27, таких как соответствие bicelles, позволяют для расследования конформации белка и динамических протеин взаимодействия в средствах массовой информации мембраны как без MAS технологии. Мы будем показывать выражения протеина и Ассамблее шаги, а также запись решающую спектры SSNMR и их анализа и интерпретации. Наша цель – обеспечить понимание структурного анализа трубопровода, позволяя читателю выполнить атомно резолюции структурные исследования высокомолекулярных Ассамблеи SSNMR методами.
Протокол включает в себя 3 секции:
1. твердотельного ЯМР образца производство
Предпосылкой для твердотельного ЯМР анализ, белковых компонентов макромолекулярных Ассамблеи необходимо быть выражены, меченных изотопом, очищенная и собран в пробирке в родной как комплекс состояние (для примера см. Рисунок 2) . Чтобы обеспечить высокую чувствительность ЯМР, обогащения изотопов в 13C и 15N маркировки требуется минимальный бактериальный выражение массовой информации дополнена 13C и 15N источников, таких как равномерно 13 C-меченых глюкозы/глицерина и 15NH4Cl соответственно. В поздней стадии протокола, выборочно 13C-меченых образцов производится с выборочно 13C-меченых источников, таких как (1,3 -13C)- и (2 -13C)-глицерин (или (1 -13C)- и (2 -13C)- глюкоза) используются для облегчения анализа ЯМР. Смешанные помечены образец, соответствующий эквимолярных смесь из 50% 15N - и 50% 13C-меченых или 50% (1,3 -13C)- и 50% (2 -13C)-глюкозы вводятся для описания обнаружения межмолекулярных взаимодействий. Высокая степень чистоты белка, а также жесткие условия на этапе сборки являются ключевыми факторами для обеспечения однородной структурного порядка окончательного образца.
2. Предварительный структурных характеристик на основе одномерный твердотельного ЯМР (1D)
Мы представляем основные эксперименты для структурного анализа, SSNMR. Одномерный (1D) кросс поляризация (CP) и INEPT / RINEPT28 экспериментов, обнаруженные на 13C ядер используется для обнаружения жестких и гибких белка сегментов в Ассамблее, соответственно и оценить степень структурной однородность и местные полиморфизм (для примера см. рис. 3).
<st></st>Жун > 3. Конформационный анализ и 3D определения структуры
Подразделы 1 и 2 касаются конформационный анализ, который основывается на SSNMR резонанс назначение всех жестких остатки белка Ассамблеи, как химические сдвиги являются очень чувствительных зондов для местной окружающей среды и может использоваться для прогнозирования Пхи/psi двугранных углов и тем самым определить вторичную структуру. Рисунок 4 иллюстрирует пример последовательного резонанса уступки в ядре жесткой белка Ассамблеи. Определение 3D структура основано на коллекции структурных данных, такие, как ограничения расстояния кодирования закрыть proximities (&#60; Å 7-9), содержащие внутри - и межмолекулярных информации. Подпункты 3 и 4 описывают дальнего действия далеких сдержанность сбора и интерпретации. Загрязнении контактов определяются как внутримолекулярной 13C -13C proximities вытекающих из остатков i j, с | i-j | ≥4, определяя тем самым складке третичного белка мономерных Субблок, или как межмолекулярных 13C -13C proximities, определение межмолекулярных взаимодействий между субблоков протеина в Ассамблее. Внутри - и межмолекулярных интерфейсы показано на рисунке 5. SSNMR ограничений обнаруживаются через 13C -13C и 15N -13C сцепленный эксперименты обычно кодировать для internuclear расстояния &#60; 1 Нм. Подраздел 4 объясняет обнаружения межмолекулярных расстояние ограничений. В симметричных белка сборках, использование однородно помечены выборок (т.е. 100% равномерно или выборочно помечены) для выявления межмолекулярных Субблок Субблок взаимодействия является ограниченным, как оба интра - и Межамери - молекулярных контактов приведет к обнаружить сигналы. Недвусмысленный обнаружения межмолекулярных proximities достигается с помощью смешанных помечены образцы, содержащие эквимолярных смесь двух по-разному помечены образцов, комбинированные до агрегирования. Подраздел 5 кратко знакомит структуры моделирования.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
Рисунок 1 : Рабочий процесс атомно резолюции структурные исследования твердотельного ЯМР. 13 C, 15N изотоп помечены производства белка, субъединицы очистки, субъединицы Ассамблеи, контроль формирования Ассамблеи, SSNMR эксперименты, SSNMR эксперимент анализа и извлечения расстояние ограничений и показаны структура моделирования. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Instruments</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR Spectrometer (&#62; 11.7 Tesla)</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">triple resonance MAS SSNMR probehead&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SSNMR rotors 4mm</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">K1910</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Centrifuge 5804 R&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5805000629</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">GeneQuant 1300 spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">28-9182-13</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">228001</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MaxQ 4450 bench top orbital shaker</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">78376</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tube Revolver Agitator</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">79547</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sonopuls HD 3100</td>
			<td style="width:117px;">Bandelin</td>
			<td style="width:119px;">3680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MicroPulser electroporator</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">mini-PROTEAN tetra cell system</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AKTA pure system</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-24</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillary microman M25 pipet</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148502</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Materials</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">amiconR ultra-15</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z740199-8EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillaries and pistons</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148112</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">spatula</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13263799</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">D-glucose 13C6</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">389374</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Ammonium-15N-chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">299251</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">1,3 13C2 glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">492639</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">2 13C glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">489484</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K1876</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3416</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7907</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71380</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208094</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Iron Chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">157740</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Zinc chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">793523</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MEM Vitamin Solution (100&#215;)</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M68954</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">IPTG</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tricine</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SDS</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">436143</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sodium azide</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">71289</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">178837</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Softwares</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Unicorn 6.3</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Akta systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">ccpNMR</td>
			<td style="width:117px;">CCPN&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">spectrometer systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy

Супрамолекулярная белка сборки фундаментальные роли в биологических процессах, начиная от хост возбудитель взаимодействия, вирусные инфекции для распространения нейродегенеративных расстройств. Такие сборки состоят в несколько субблоков белка, организованных non ковалентные образом сформировать большой макромолекулярных объектов, которые можно выполнять различные клеточные функции или вызвать негативные последствия. Атомной понимание механизмов Ассамблеи и функционирования этих макромолекулярных сборок часто остаются скудными с их неотъемлемым нерастворимость и не кристалличности часто резко снижает качество данных, полученных из большинства методов используется в структурной биологии, например рентгеноструктурного анализа и решения ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Здесь мы представляем магии угол спиннинг твердотельного ЯМР спектроскопии (SSNMR) как мощный метод для изучения структуры макромолекулярных сборок на атомной резолюции. SSNMR можно выявить атомной детали на собранный комплекс без ограничения размера и растворимость. Протокол, представленные здесь описываются основные шаги от производства 13C /15N меченных изотопом высокомолекулярных белков сборки на приобретение стандартных SSNMR спектры и их анализа и интерпретации. В качестве примера мы покажем трубопровода Ассамблеи нитчатые протеина структурного анализа SSNMR.

Типичный рабочий процесс SSNMR включает в себя несколько этапов, показанного на рисунке 1. Обычно субблоков протеина производятся в vitro гетерологичных выражением в E. coli, очищенная и собрал под тряску, но иногда также в статических условиях. Выражение и очистки субъединицы белка следуют SDS гель-хроматографии (рис. 2A). Формирования высокомолекулярных сборок затем может быть подтверждена электронной микроскопии (EM) анализа (см. Рисунок 2B пример нитчатые Ассамблеи).
После введения Ассамблеи белка в SSNMR ротора ротор вставляется в спектрометре, регулируются MAS частоты и температуры и спектры записываются. Первые идеи можно получить 1D SSNMR методами. На рисунке 3 показана типичная SSNMR FID, обнаруженных на канале 13C на образец структурно однородных белка, 1H -13C CP спектра, раскрывая13C резонансов в жесткой ядро субъединицы белка в Ассамблея и 2D 1H -13C НЕУМЕЛОЕ спектра, представляющие мобильные остатков. Для атомной взглянуть на жесткую основу структуры Ассамблея многомерные SSNMR эксперименты должны быть записаны на равномерно и выборочно помечены образцы сначала назначить SSNMR резонансы и затем обнаружить на большие расстояния (см. Рисунок 4 proximities ).
Все спектры обрабатываются и анализируются с адекватного программного обеспечения для присвоения SSNMR резонансы и извлечь внутри - и межмолекулярных расстояние ограничения (рис. 5). SSNMR расстояние ограничения используются самостоятельно либо совместно с данными из дополнительных методов, которые могут быть интегрированы в программу моделирования.
Для представителя атомных структур макромолекулярных сборок, решается SSNMR методы Рисунок 6 иллюстрирует несколько нитчатые сборки из бактериальных придатков и амилоидных фибрилл.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
Рисунок 6:нитчатые макромолекулярных структур, определяется твердотельного ЯМР подход: бактериальные филаментов и белка амилоида фибриллами. A) типа 1 pilus uropathogenic E. coli, PDB код 2N7H 4; B) ASC накаливания, PDB код 2N1F 63; C) тип III секреторной системы иглы, PDB коды 2MME, 2LPZ и 2MEX 2,3,-правовая64; D) AB42 бета-амилоидных фибрилл, PDB код 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,,6667 и Осака мутант PDB код 2MVX 57, Айова мутант PDB код 2MPZ 58; E) альфа synuclein фибрилл, PDB код 2N0A 68; F) домен прионных HET-s, 2RNM код PDB, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Структуры супрамолекулярные белка сборок на атомной резолюции имеют большое значение из-за их решающую роль в различных биологических явлений. Здесь мы представляем протокол для выполнения высокого разрешения структурных исследований на нерастворимы и некристаллических высокомолекулярных белков сборок магии-угол спиннинг твердотельного ЯМР спектроскопии (MAS SSNMR).

Структурные исследования атомной шкале макромолекулярных сборок, твердотельного ЯМР спектроскопии

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Interpreting Nuclear Magnetic Resonance Spectra

SCIENTISTS IN ACTION

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Спектроскопии ядерного магнитного резонанса для идентификации нескольких фосфорилирований искробезопасных неупорядоченных белков

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Спектроскопия силы одного белковых молекул с помощью атомно-силового микроскопа

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Измерения взаимодействий шаровых и волокнистых белков спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и микромасштабной Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Структурные исследования макромолекул в решения с помощью небольшой угол рентгеновского рассеяния

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Подготовка грибковых и растительных материалов для структурной разяснения, используя динамический ядерной поляризации твердотельного ЯМР

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Изображение внеклеточных пузырьков с помощью атомной микроскопии силы

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Атомная спектроскопия поглощения для измерения внутриклеточного цинка бассейны в клетках млекопитающих

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Характеристика индивидуальных белковых агрегатов с помощью инфракрасной наноспектроскопии и микроскопии атомной силы

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Без этикетки Иммунопрецитис Масса Спектромтертрия Рабочий процесс для крупномасштабного ядерного взаимодействия Профилирование

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Удаление и замена эндогенных лигандов из липид-связанных белков и аллергенов

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...