Name: atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00
Duration: 14 min 55 s
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Este trabajo es financiado por la ANR (13-PDOC-0017-01 B.H. y ANR-14-CE09-0020-01 para A.L.), "Inversiones para el futuro" programa IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 a B.H.) referencia ANR-10-IDEX-03-02 a B.H., la Fondation pour la Recherche Médicale ( FRM-AJE20140630090 a A.L.), el programa FP7 (FP7-PEOPLE-2013-CIG a A.L.) y el Consejo Europeo de investigación (CEI) bajo el programa de investigación e innovación a los horizonte 2020 de la Unión Europea (ERC Starting Grant para A.L., acuerdo No 639020) y proyecto " WEAKINTERACT."

Los autores no tienen nada que revelar.

NMR de estado sólido (SSNMR) es un método de elección para la caracterización de conjuntos de proteínas macromoleculares en un nivel atómico. Uno de los temas centrales en la determinación de la estructura basada en la SSNMR es la calidad espectral del sistema investigado, que permite crear modelos estructurales 3D de precisión diferentes, generalmente que van desde modelos de baja resolución (contiene el secundario estructura elementos y poca información 3D) a pseudo-atómicas estructuras 3D. La cantidad y calidad de información estructural extraída de experimentos SSNMR multidimensionales es la clave para calcular una estructura de NMR de alta resolución de la Asamblea.
El protocolo descrito se basa en la detección de 13C -13C y 15N -13C estructural las restricciones que requiere la grabación de varios espectros 2D (y a veces 3D) con alta señal a ruido. A frecuencias MAS moderadas (&#60; 25 kHz), se introduce la muestra en rotores con tamaños de 3.2-4 mm de diámetro permitiendo cantidades de proteína de hasta ~ 50 mg, depende de la hidratación de la muestra. La cantidad de muestra dentro del rotor es directamente proporcional a la relación de señal a ruido en espectros SSNMR, un factor decisivo para la detección de las limitaciones de distancia de largo alcance y la asignación inequívoca.
La resolución espectral es un parámetro crucial durante la asignación secuencial de la resonancia y la colección de restricciones. Para obtener resultados óptimos, los parámetros de preparación de la muestra necesitan ser optimizado, particularmente en la purificación de la subunidad y las condiciones de montaje (pH, buffer, agitación, temperatura, etc.). Para la optimización de la muestra, se recomienda para preparar muestras sin etiqueta para varias condiciones distintas para las que se ha observado la Asamblea y para grabar un 1D 1H -13C CP espectro (descrito en el paso 2.1) en cada muestra preparada. Los espectros sirven para comparar la dispersión entre las diferentes preparaciones, basado en que se pueden determinar las condiciones óptimas y resolución espectral.
La calidad de los datos SSNMR depende fuertemente de la elección de los parámetros de adquisición de NMR, especialmente para los pasos de transferencia de polarización. El uso de altas fuerzas del campo magnético (≥600 MHz 1H de frecuencia) es esencial para la alta sensibilidad y resolución espectral, necesaria frente a objetivos complejos tales como asambleas de proteína macromolecular.
Un factor limitante en muchos casos es la disponibilidad de espectrómetro. Por lo tanto, una elección juiciosa de las muestras a ser preparado debe preceder a la sesión del espectrómetro. En cualquier caso, uniformemente 13C, 15muestra marcada con el N es un requisito previo para realizar la asignación secuencial y la residual de resonancia. Asignado por estado sólidas técnicas de RMN de proteínas ver71. Determinación de la estructura de asambleas macromoleculares en frecuencias MAS moderadas requiere selectivamente las muestras marcada con C 13; para la detección de largo alcance 13C -13C y 13C -15N en contacto con las muestras basadas en 1, 3 -13C - y 2 -13C-gylcerol o 1 -13C - y 2 -13C-glucosa etiquetado son de uso general, como se describe anteriormente. La elección entre los dos sistemas de etiquetado se basa en la relación de señal a ruido espectral y resolución. Para distinguir entre el intra - e intermoleculares contactos a largo plazo, mixtas muestras etiquetadas y diluidas han revelado eficientes.
En Resumen, los pasos críticos para un estudio estructural atómico de SSNMR son: (i) la preparación de las subunidades y la necesidad de la Asamblea a ser optimizada para obtener la muestra excelente cantidad y calidad, (ii) Espectrómetro campo fuerza y adquisición de los parámetros deben ser escogido cuidadosamente; III selectivos Etiquetadoras estrategias se requieren para una determinación de la estructura 3D y la cantidad de datos requeridos depende de la calidad de los datos y la disponibilidad de datos complementarios.
A pesar de su aplicabilidad a una amplia gama de sistemas supramoleculares, que van desde proteínas de la membrana homomultimeric nano-objetos, SSNMR es a menudo limitada por la necesidad de cantidades de mg de material isotópicamente etiquetado. Los recientes desarrollos tecnológicos en ultra rápido SSNMR MAS (≥100 kHz) abrir la Avenida 1detectado H NMR y empujar el límite de la cantidad de muestra mínima para sub-mg 72,73,74. Sin embargo, para estudios estructurales detallados 13C-etiquetado muestras son indispensables, que limita la aplicación de SSNMR para las muestras montadas en vitro o sistemas expresados en los organismos que sobreviven en un medio mínimo, donde en las células SSNMR es un método emergente (para comentarios ver 75,76,77,78).
Un factor importante en el uso de SSNMR para obtener estructuras 3D de alta resolución es la resolución espectral: intrínseca heterogeneidad conformacional en una Asamblea puede limitar el análisis de espectros y resolución espectral. Residuo específico 13C etiquetado puede en algunos casos ofrecer una alternativa para obtener información de la distancia específica sobre residuos estratégicos con el fin de obtener modelos estructurales (para una reciente ejemplos véase 79,80).
SSNMR para la determinación de la estructura 3D todavía requiere la colección de varios conjuntos de datos con tiempos de recogida de datos a menudo mucho en instrumentos sofisticados, dependiendo el enfoque y el sistema varios días a semanas en un 600-1000 MHz (frecuencia de1H) Espectrómetro de. Por lo tanto, el acceso a tiempo de espectrómetro puede ser un factor limitante en un profundo estudio de la SSNMR.
En el caso de conjuntos de proteínas homomultimeric, llevando a datos SSNMR de calidad suficiente para identificar un gran número de limitaciones estructurales como en 3,57,64,70, SSNMR no da todavía tienen acceso a las dimensiones microscópicas. Por lo tanto, en una determinación de novo de SSNMR estructura de un conjunto de homomultimeric, EM o datos de masa por longitud (MPL) idealmente complementan datos SSNMR para derivar los parámetros de la simetría. SSNMR datos solo proporcionan la atómica intra - e intermoleculares interfaces
SSNMR es altamente complementario con técnicas estructurales como la EM o MPL medidas pero los datos también perfectamente se pueden combinar con las estructuras atómicas obtenidas por cristalografía de rayos x o solución NMR en subunidades truncados o mutados. Un número creciente de estudios puede encontrarse en la literatura donde la conjunción de diferentes datos estructurales ha permitido determinar modelos atómicos 3D de asambleas macromoleculares (ver figura 6 para ejemplos representativos).
En el campo de la biología estructural, SSNMR surge como una técnica prometedora para el estudio deinsolubles y no-cristalino asambleas en el atómico nivel, es decir, proporcionar datos estructurales a escala atómica. En este sentido, SSNMR es el colgante a solución NMR y Cristalografía de rayos x para conjuntos moleculares, incluyendo proteínas de membrana en sus asambleas de medio ambiente y de la proteína nativas como sobres virales, bacterianas filamentos o amiloides, así como RNA y Complejos RNA-proteína (véase por ejemplo81). Su gran versatilidad de aplicaciones en vitro y en el contexto celular, como el seguimiento de los cambios estructurales secundarios, terciarios y cuaternarios, identificar superficies de interacción con las moléculas del socio en la escala atómica (por ejemplo 82) y asignación dinámica molecular en el contexto de complejos montados, indican el importante potencial de SSNMR en futuros estudios estructurales sobre conjuntos de complejos biomoleculares.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Componente</td>
			<td>Medio M9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0,5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6,7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivencias2</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FECLAS3</td>
			<td>1 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamina mezcla 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C glucosa</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Composición del medio de la mínima expresión de proteínas recombinantes de producción de E. coli células BL21.

Avances en magic-angle spinning espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética nuclear (SSNMR) ofrecen una herramienta eficaz para la caracterización estructural de asambleas macromoleculares de proteínas con una resolución atómica. Estas asambleas de proteína son sistemas ubicuos que desempeñan un papel esencial en muchos procesos biológicos. Sus estructuras moleculares, las interacciones y la dinámica es accesible por los estudios SSNMR, como se ha demostrado para viral (cápsida1) y mecanismos de infección bacteriana (secreción sistemas2,3, pili4), membrana proteína complejos5,6,7,8 y amiloides funcionales 9,10,11. Este tipo de montaje molecular también puede provocar patologías como enfermedades neurodegenerativas donde proteínas montan en Estados mal plegados, amiloides y comportamiento celular aberrante o célula muerte 12,13. Asambleas de proteína son construidos a menudo por la Oligomerización simétrico de copias múltiples de subunidades de la proteína en grandes objetos supramoleculares de varias formas incluyendo fibrillas, filamentos, poros, tubos o nanopartículas. La arquitectura cuaternaria está definida por las interacciones débiles entre las subunidades de la proteína para organizar el montaje espacial y temporal y para permitir funciones biológicas sofisticadas. Investigaciones estructurales a escala atómica en estas asambleas son un desafío para las técnicas de alta resolución desde su indisolubilidad intrínseca y muy a menudo su no-cristalinidad restringe el uso de solución NMR o Cristalografía de rayos x convencional se acerca. Magic-angle spinning SSNMR (MAS) es una técnica emergente para obtener datos de resolución atómica de asambleas macromoleculares insolubles y ha demostrado su eficacia para resolver modelos atómicos 3D para un creciente número de sistemas biomoleculares complejos, incluyendo filamentos bacterianos, las asambleas y partículas virales 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Avances técnicos en campos magnéticos altos, desarrollos metodológicos y preparación de la muestra ha establecido MAS SSNMR en un método robusto para investigar proteínas insolubles en varios ambientes, en particular en su biológicamente relevantes macromoleculares armados estatales o en las membranas celulares, haciendo la técnica altamente complementarias a microscopia del cryo-electrón. En muchos casos, un alto grado de simetría caracteriza tales asambleas de proteína. MAS SSNMR explota esta característica, como todas subunidades de la proteína en una Asamblea de homomolecular tendría la misma estructura local y por lo tanto, prácticamente la misma SSNMR firma, reduciendo drásticamente la complejidad del análisis.
Un protocolo eficiente para estudios estructurales de los conjuntos de proteínas macromoleculares por MAS moderadas (&#60; 25 kHz) SSNMR se presenta en este video y se puede subdividir en diferentes pasos (figura 1). Le mostraremos las etapas críticas del flujo de trabajo de un estudio estructural de SSNMR ejemplificado en un conjunto de proteínas filamentosas (pasos ver resaltado en la figura 1), con la excepción de purificación de la subunidad de la proteína, diferentes para cada proteína Asamblea pero de vital importancia para los estudios estructurales y sin entrar en detalles técnicos/metodológicos del cálculo de la espectroscopia y estructura de la SSNMR para qué tutoriales especializados están disponible en línea. Mientras que el presente Protocolo se concentrará principalmente en estado sólidos experimentos NMR realizados en condiciones de MAS, el uso de alineado entornos biológicos 23,24,25,26 , 27, como bicelles alineadas, permiten la investigación de la conformación de la proteína y la interacción dinámica de proteínas en membrana-como medios sin tecnología MAS. Vamos a mostrar la expresión de la proteína y los pasos de ensamblaje así como la grabación de los espectros SSNMR cruciales y su análisis e interpretación. Nuestro objetivo es proporcionar penetraciones en la tubería de análisis estructural que permite al lector a realizar un estudio estructural de resolución atómica de una Asamblea macromolecular mediante técnicas SSNMR.
El protocolo comprende 3 secciones:
1. estado sólido producción NMR de la muestra
Como un requisito previo a un análisis de NMR de estado sólido, los componentes proteicos de la necesidad de ensamblaje macromolecular a expresarse, marcado con el isótopo, purificada y montado en vitro en el estado complejo nativo (para un ejemplo véase figura 2) . Para asegurar la alta sensibilidad de NMR, enriquecimiento del isótopo en 13C y 15N etiquetado es necesario mediante el uso de los medios de expresión bacteriana mínima complementados con 13C y 15N fuentes, tales como uniforme 13 Etiquetado C glucosa/glicerol y 15NH4Cl respectivamente. En la etapa posterior del Protocolo, selectivamente muestras marcada con C 13producción con selectivamente 13fuentes C-etiquetados como (1, 3 -13C)- y (2 -13C)-glicerol (o (1 -13C)- y (2 -13C)- glucosa) se utilizan para facilitar el análisis de NMR. Muestra etiquetada mixta correspondiente a una mezcla equimolar de 50% 13C-etiquetado o 50% y 50% 15N - (1, 3 -13C)- y el 50% (2 -13C)-glucosa se introducen para describir la detección de intermolecular interacciones. Un alto grado de pureza de proteína así como condiciones rigurosas durante el paso de montaje son factores clave para asegurar un orden estructural homogénea de la muestra final.
2. preliminar caracterización estructural basado en unidimensional NMR de estado sólido (1D)
Presentamos los experimentos esenciales para un análisis estructural de SSNMR. Unidimensional (1D) polarización transversal (CP) y INEPT / experimentos de28 RINEPT, detectados en núcleos de 13C se utilizan para detectar segmentos de proteína rígida y flexible en la Asamblea, respectivamente y para estimar el grado de estructural homogeneidad y polimorfismo local (para una ejemplo véase figura 3).
<st></st>Rong &gt; 3. Determinación de la estructura del análisis conformacional y 3D
Incisos 1 y 2 refieren al análisis conformacional, que se basan en la asignación de la resonancia SSNMR de todos los residuos rígidos de la Asamblea de la proteína, como los cambios químicos son sondas muy sensibles con el medio ambiente local y pueden utilizarse para predecir la phi/psi diedro de los ángulos y así determinar la estructura secundaria. Figura 4 ilustra un ejemplo de una asignación de resonancia secuencial en la base rígida de un conjunto de proteína. La determinación de la estructura 3D se basa en la recopilación de datos estructurales tales como las restricciones de distancia codificación cerca de cercanías (&#60; 7-9 Å), que contiene tanto intra - e intermolecular información. Incisos 3 y 4 describen interpretación y colección de moderación distante a largo plazo. Contactos de largo alcance se definen como intramolecular 13C -13C cercanías derivados residuos de i a j, con | i-j | ≥4, definiendo así el pliegue de terciaria de la proteína de la subunidad monomérica o como intermoleculares 13C -13C cercanías, definiendo las interfaces intermoleculares entre las subunidades de proteína en la Asamblea. Intra - e intermoleculares interfaces se ilustran en la figura 5. Restricciones SSNMR detectaron a través de 13C -13C y 15N -13C Asociación experimentos generalmente codifican para distancias internuclear &#60; 1 nm. Subsección 4 explica la detección de las limitaciones de la distancia intermolecular. En las Asambleas de proteína simétrica, el uso de muestras etiquetados homogéneo (es decir, 100% etiquetada uniformemente o selectivamente) para identificar las interacciones intermoleculares subunidad-subunidad es limitada, como tanto intra - y inter - molecular contactos conducen a señales detectables. La detección inequívoca de cercanías intermoleculares se logra utilizando muestras etiquetadas mixtas, que contiene una mezcla equimolar de dos muestras etiquetadas diferentemente, combinado antes de la agregación. Inciso 5 presenta brevemente modelado de la estructura.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
Figura 1 : Flujo de trabajo de un estudio estructural de resolución atómica por NMR de estado sólido. 13 C, isótopo 15N marcada producción de proteínas, purificación de la subunidad, montaje de la subunidad, control de formación de la Asamblea, SSNMR experimentos, análisis de experimento SSNMR y extracción de las restricciones de distancia, y se muestran modelos de estructura. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Instruments</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR Spectrometer (&#62; 11.7 Tesla)</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">triple resonance MAS SSNMR probehead&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SSNMR rotors 4mm</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">K1910</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Centrifuge 5804 R&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5805000629</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">GeneQuant 1300 spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">28-9182-13</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">228001</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MaxQ 4450 bench top orbital shaker</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">78376</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tube Revolver Agitator</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">79547</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sonopuls HD 3100</td>
			<td style="width:117px;">Bandelin</td>
			<td style="width:119px;">3680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MicroPulser electroporator</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">mini-PROTEAN tetra cell system</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AKTA pure system</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-24</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillary microman M25 pipet</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148502</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Materials</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">amiconR ultra-15</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z740199-8EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillaries and pistons</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148112</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">spatula</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13263799</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">D-glucose 13C6</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">389374</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Ammonium-15N-chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">299251</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">1,3 13C2 glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">492639</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">2 13C glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">489484</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K1876</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3416</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7907</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71380</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208094</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Iron Chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">157740</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Zinc chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">793523</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MEM Vitamin Solution (100&#215;)</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M68954</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">IPTG</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tricine</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SDS</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">436143</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sodium azide</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">71289</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">178837</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Softwares</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Unicorn 6.3</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Akta systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">ccpNMR</td>
			<td style="width:117px;">CCPN&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">spectrometer systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy

Asambleas supramolecular proteínas desempeñan un papel fundamental en procesos biológicos que van desde la interacción huésped-patógeno, infección viral a la propagación de enfermedades neurodegenerativas. Estos conjuntos consisten en múltiples subunidades de la proteína organizados de forma no covalente para formar objetos macromoleculares grandes que puedan ejecutar una variedad de funciones celulares o producir consecuencias perjudiciales. Penetraciones atómicas en los mecanismos de montaje y el funcionamiento de las Asambleas macromoleculares siguen siendo a menudo escasas desde su inherente insolubilidad y cristalinidad no reduce a menudo drásticamente la calidad de los datos obtenidos de la mayoría de las técnicas utilizada en biología estructural, tales como Cristalografía de rayos x y resonancia magnética Nuclear (RMN) de solución. Aquí presentamos RMN Espectroscopia de estado sólida magic-angle spinning (SSNMR) como un potente método para investigar las estructuras de asambleas macromoleculares a resolución atómica. SSNMR puede revelar detalles atómicos del complejo montado sin limitaciones de tamaño y solubilidad. El protocolo que presentamos describe los pasos esenciales de la producción de 13C / asambleas de proteína macromolecular marcado con el isótopo15N a la adquisición de espectros SSNMR estándar y su análisis e interpretación. Como ejemplo, mostramos la tubería de un análisis estructural de SSNMR de un conjunto de proteínas filamentosas.

El flujo de trabajo típico de SSNMR incluye varios pasos ilustrados en la figura 1. Generalmente las subunidades de la proteína son producidas por en vitro expresión heteróloga en e. coli, purificadas y montadas bajo agitación, pero a veces también en condiciones estáticas. Expresión y purificación de la subunidad de la proteína se siguieron por cromatografía de gel de la SDS (figura 2A). La formación de asambleas macromoleculares puede entonces confirmarse por análisis de microscopia electrónica (EM) (ver figura 2B para un ejemplo de un conjunto de filamentos).
Después de la introducción de la Asamblea de la proteína en el rotor SSNMR, el rotor se inserta en el espectrómetro, la frecuencia del MAS y la temperatura están reguladas y se registran los espectros. Primeras penetraciones pueden obtenerse mediante técnicas SSNMR D 1. La figura 3 muestra un típico FID SSNMR detectado en el canal 13C en una muestra estructuralmente homogénea de proteínas, un 1H -13C CP espectro, revelar las resonancias de13C presentes en el núcleo rígido de la subunidad de la proteína en la Asamblea y un espectro C inepto 2D 1H -13, que representan los residuos móviles. Para penetraciones atómicas en el núcleo rígido de la estructura de la Asamblea, experimentos SSNMR multidimensionales necesitan grabarse en uniformemente y de forma selectiva con la etiqueta muestras para asignar primero las resonancias SSNMR y luego detectar proximidades a largo plazo (ver figura 4 del ).
Todos los espectros son procesados y analizados con el software adecuado para asignar las resonancias SSNMR y extraer intra - y las restricciones de la distancia intermolecular (figura 5). Las restricciones de distancia SSNMR se utilizan ya sea por separado o en conjunto con los datos de técnicas complementarias, que pueden ser integrados en el programa de modelado.
Para estructuras atómicas representativas de asambleas macromoleculares solucionados mediante técnicas SSNMR la figura 6 ilustra varias asambleas filamentosos de apéndices bacterianos y las fibrillas amiloideas.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
Figura 6:filamentosas estructuras macromoleculares determinadas por un enfoque de NMR de estado sólido: filamentos bacterianos y las fibrillas de la proteína amiloide. A) pilus de tipo 1 de uropatógenos e.coli, PDB código 2N7H 4; Filamento B) ASC, PDB código 2N1F 63; C) agujas de sistema de secreción tipo III, PDB códigos 2MME, 2LPZ y 2MEX 2,3,64; D) fibrillas de amiloide-beta de Aβ42, PDB código 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 y Osaka mutante PDB código 2MVX 57, Iowa mutante PDB código 2MPZ 58; E) fibrillas de alfa-sinucleína, PDB código 2N0A 68; F) dominio de HET-s del prión, PDB código 2RNM, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Estructuras de conjuntos supramoleculares proteína a resolución atómica son de alta relevancia debido a su papel crucial en una variedad de fenómenos biológicos. Adjunto, presentamos un protocolo para llevar a cabo estudios estructurales de alta resolución en asambleas de proteína macromolecular insoluble y no-cristalino magic-angle spinning estado sólido de resonancia magnética nuclear espectroscopia (MAS SSNMR).

Estudios estructurales de escala atómica de asambleas macromoleculares por espectroscopia de estado sólido de resonancia magnética Nuclear

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

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