Name: atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

Detta arbete finansieras av ANR (13-PDOC-0017-01 att B.H. och ANR-14-CE09-0020-01 att A.L.), ”investeringar för framtiden” programmet IdEx Bordeaux/CNRS (PEPS 2016 att B.H.) referera ANR-10-IDEX-03-02 till B.H., Fondation pour la Recherche Médicale) FRM-AJE20140630090 att A.L.), FP7 programmet (FP7-personer-2013-CIG att A.L.) och den Europeiska forskningsrådet (ERC) under EU: s Horizon 2020 forskning och innovation-programmet (ERC Starting Grant att A.L., avtal nr 639020) och projektet ” WEAKINTERACT ”.

Författarna har något att avslöja.

Solid-State NMR (SSNMR) är en metod för val av kännetecknar makromolekylära protein aggregat på atomär nivå. En av de centrala frågorna i SSNMR-baserade strukturbestämning är den spektrala kvaliteten på det undersökta systemet, som tillåter att fastställa 3D strukturella modeller av olika precision, vanligtvis alltifrån lågupplösta modeller (som innehåller sekundärt strukturera element och lite 3D-information) till pseudo Atom 3D-strukturer. Kvantitet och kvalitet av strukturella uppgifter ur flerdimensionella SSNMR experiment är nyckeln till att beräkna en högupplösande NMR struktur av församlingen.
Protokollet beskrivs bygger på detektion av 13C -13C och 15N -13C strukturella begränsningar som kräver inspelning av flera 2D (och ibland 3D) spectra med hög signal-brus. Vid måttlig MAS frekvenser (&#60; 25 kHz), provet införs i rotorer med storlekar 3,2-4 mm diameter möjliggör protein mängder upp till ~ 50 mg, beroende på provet hydratisering. Mängden prov släpper rotorn är direkt proportionell mot signal-brus-förhållande i SSNMR spectra, en avgörande faktor för detektion av långväga avstånd begränsningar och deras entydig tilldelning.
Den spektrala upplösningen är en avgörande parameter under sekventiell resonans uppdraget och samlingen begränsningar. För optimala resultat, måste provet beredning parametrarna optimeras, särskilt vid rening av subuniten och församlingen villkoren (pH, buffert, skakningar, temperatur, etc.). För prov optimering rekommenderas det att förbereda omärkt prover för flera skilda villkor som församlingen har observerats, och att spela in en 1D 1H -13C CP spektrum (som beskrivs i steg 2.1) på varje beredda provet. Spektra tjäna till att jämföra spektral upplösning och spridning mellan de olika förberedelserna, utifrån vilket de optimala förutsättningarna kan bestämmas.
Kvaliteten på uppgifter som SSNMR är starkt beroende av valet av NMR förvärv parametrar, särskilt för polarisering överföring stegen. Användningen av hög magnetisk fältstyrka (≥600 MHz 1H frekvens) är viktigt för hög känslighet och spektral upplösning, krävs när man står inför komplexa mål såsom makromolekylära protein församlingar.
En begränsande faktor i många fall är spektrometer tillgången. Ett klokt val av proverna förberedas bör därför föregå spektrometer sessionen. I alla fall, ett enhetligt 13C, 15N-märkt prov är en förutsättning för att utföra sekventiella och intra kvarstående resonans uppdraget. Proteiner som tilldelats av solid-state NMR tekniker finns71. Strukturbestämning av makromolekylära församlingar vid måttlig MAS frekvenser kräver selektivt 13C-märkta prover; för detektion av långväga 13C -13C och 13C -15N kontakter prover baserat på 1,3 -13C- och 2 -13C-gylcerol eller 1 -13C- och 2 -13C-glukos märkning är vanligen används, som beskrivs ovan. Valet mellan de två systemen för märkning är baserad på den spektrala signal-brus-förhållande och upplösning. För att skilja mellan intra- och intermolekylära långväga kontakter, har blandade märkta och utspädda prover visat effektiv.
Kort sagt, de kritiska steg för en atom SSNMR strukturella studie är: (i) beredning av subunitsna och församlingen behöver optimeras att få utmärkta prov kvantitet och kvalitet, (ii) spektrometer fältet parametrar för styrka och förvärvet måste vara valt noggrant; (iii) selektiv märkning strategier krävs för en 3D strukturbestämning och mängden data som krävs beror på uppgifternas kvalitet och tillgänglighet för kompletterande data.
Trots dess tillämplighet på ett brett utbud av Supramolekylära system alltifrån membranproteiner till homomultimeric nano-objekt, begränsas SSNMR ofta av behovet av mg-mängder av isotopically märkt material. Den senaste tekniska utvecklingen i ultrasnabb MAS (≥100 kHz) SSNMR öppnar upp för avenyn 1H-upptäckt NMR, och push gränsen för minimal prov kvantitet till sub-mg 72,73,74. Dock för detaljerade strukturella studier är 13C-märkta prover oumbärlig, som begränsar tillämpningen av SSNMR till prover som samlats in vitro- eller system uttrycks i organismer som överlever på minimalmedium där i cell SSNMR är en framväxande metod (för recensioner se 75,76,77,78).
En viktig faktor i SSNMR för att få högupplösta 3D-strukturer är den spektrala upplösningen: inneboende konfirmerande heterogenitet i en församling kan begränsa upplösning och spectra spektralanalys. Rester specifika 13C märkning kan i vissa fall utgöra ett alternativ att erhålla visst avståndsinformation om strategiska rester för att erhålla strukturella modeller (för en senaste exempel se 79,80).
SSNMR för bestämning av 3D-strukturen fortfarande kräver insamling av flera datamängder med ofta lång data collection gånger på sofistikerade instrument, beroende på metoden och systemet flera dagar till veckor på en 600-1000 MHz (1H frekvens) spektrometer. Därför kan tillgång till spektrometer tid vara en begränsande faktor i en fördjupningsstudie SSNMR.
När det gäller homomultimeric protein församlingar, leder till SSNMR data av tillräcklig kvalitet för att identifiera ett stort antal strukturella begränsningar såsom i 3,57,64,70, SSNMR ger fortfarande ingen tillgång till mikroskopiska mått. Därför i de novo SSNMR struktur fastställande av en homomultimeric församling komplement EM eller mass-per-längd (MPL) data idealiskt SSNMR data för att härleda parametrarna symmetri. SSNMR data enbart ge Atom intra- och intermolekylära gränssnitt
SSNMR är mycket kompletterande med strukturella tekniker såsom EM eller MPL mätningar men data kan också perfekt kombineras med atomära strukturer erhålls genom röntgenkristallografi eller lösning NMR på muterade eller trunkerade subenheter. Ett ökande antal studier kan hittas i litteraturen där konjunktionen av olika strukturella data har tillåtit för att bestämma Atom 3D-modeller av makromolekylära sammansättningar (se figur 6 för representativa exempel).
I fältet för strukturbiologi, SSNMR dyker upp som lovande teknik för att studeraolösliga och icke-kristallin församlingar på atomär nivå, dvs ge strukturella data på den atomära skalan. SSNMR är i detta avseende, hängande lösning NMR och röntgenkristallografi för molekylär sammansättningar, inklusive membranproteiner i deras infödda miljö och protein församlingar såsom viral kuvert, bakteriell filament eller amyloid, samt RNA och RNA-proteinkomplex (se till exempel81). Dess mångsidiga applikationer i vitro och i det cellulära sammanhanget, såsom spårning sekundär, tertiär och Kvartär strukturella förändringar, identifiera interaktion ytor med partner molekyler på den atomära skalan (till exempel 82) och kartläggning molekylär dynamik i samband med monterade komplex, ange SSNMR viktig potential i framtida strukturella studier av komplexa Biomolekylär församlingar.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>M9 medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0,5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6,7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 ΜM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin mix 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C-glukos</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabell 1: Sammansättningen av minimal uttryck medium för rekombinant protein produktion i E. coli BL21 celler.

Framsteg inom magi-vinkel spinning solid-state kärnmagnetisk resonansspektroskopi (SSNMR) erbjuder ett effektivt verktyg för strukturella karakterisering av makromolekylära protein aggregat på en atomär upplösning. Dessa protein församlingar är allestädes närvarande system som spelar viktiga roller i många biologiska processer. Deras molekylära strukturer, interaktioner och dynamik är tillgänglig genom SSNMR studier, som har visats för viral (förhoppningsvis1) och bakterieinfektion mekanismer (utsöndring system2,3, pili4), membran protein komplex5,6,7,8 och funktionella amyloid 9,10,11. Denna typ av molekylär sammansättning kan också framkalla sjukdomar såsom vid neurodegenerativa sjukdomar där proteiner samlas i felveckning, amyloid stater och orsaka avvikande cell beteende eller cell död 12,13. Protein aggregat byggs ofta av den symmetriska oligomerisering multiplar kopior av proteinsubenheter in stora supramolekylär objekt i olika former inklusive fibriller, filament, porer, rör eller nanopartiklar. Den Kvartära arkitekturen definieras av svaga interaktioner mellan proteinsubenheter att organisera den rumsliga och tidsmässiga församlingen och tillåta för sofistikerade biologiska funktioner. Strukturella utredningar på atomär nivå på dessa församlingar är en utmaning för högupplösta tekniker sedan deras inneboende olöslighet och mycket ofta deras icke-kristallinitet begränsar användningen av konventionella röntgenkristallografi eller lösning NMR tillvägagångssätt. Magic-vinkel spinning (MAS) SSNMR är en framväxande teknik att få atomär upplösning uppgifter om olösliga makromolekylära församlingar och har bevisat sin effektivitet att lösa 3D Atom modeller för ett ökande antal komplexa Biomolekylär system inklusive bakteriella filament, amyloid församlingar och viruspartiklar 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Tekniska framsteg på höga magnetfält, metodologiska utvecklingen och provberedning har etablerat MAS SSNMR till en robust metod att undersöka olösliga proteiner i olika miljöer, särskilt i deras biologiskt relevanta makromolekylära samlat statligt eller i cellulära membran, vilket gör tekniken mycket kompletterande till cryo-elektronmikroskopi. I många fall kännetecknar en mycket hög grad av symmetri sådana protein församlingar. MAS SSNMR utnyttjar denna funktion, som alla proteinsubenheter i en homomolecular församling skulle ha samma lokala struktur och därför praktiskt taget samma SSNMR signatur, drastiskt minska komplexiteten vid analysen.
En effektiv protokoll för strukturstudier av makromolekylära protein aggregat av måttlig MAS (&#60; 25 kHz) SSNMR presenteras i denna video och kan delas in i olika steg (figur 1). Vi kommer att demonstrera de kritiska stadierna av arbetsflödet för en SSNMR strukturella studie exemplifieras på en trådformiga protein församling (se markerad steg i figur 1), med undantag av protein subenhet rening, olika för varje protein montering men av avgörande betydelse för strukturstudier och utan att gå in på teknisk/metodologiska Detaljer SSNMR spektroskopi och struktur beräkningen för vilken specialiserad självstudiekurser är tillgängliga online. Medan detta protokoll kommer fokus främst på solid-state NMR-experimenten utförs MAS villkor, anpassade användningen av biologiska miljöer 23,24,25,26 , 27, som arrangera i rak linje bicelles, Tillåt för utredning av protein konformation och dynamiska protein-protein interaktioner i membran-liknande medier utan MAS teknik. Vi kommer att Visa proteinuttryck och församlingen steg samt inspelning av avgörande SSNMR spektra och deras analys och tolkning. Vårt mål är att ge insikter i rörledningen strukturell analys gör det möjligt för läsaren att utföra en atomär upplösning strukturella studie av en makromolekylära sammansättningen av SSNMR tekniker.
Protokollet omfattar 3 sektioner:
1. solid-state NMR prov produktionen
Som en förutsättning för att en solid-state NMR analys proteinkomponenter makromolekylära sammansättningen skulle behöva uttryckas, isotop-märkt, renat och monterade in vitro- in i native-liknande komplexa staten (för ett exempel, se figur 2) . För att säkerställa hög NMR känslighet, krävs isotop anrikning i 13C och 15N märkning med hjälp av minimal bakteriell uttryck media kompletteras med 13C och 15N källor, såsom jämnt 13 C-märkt glukos/glycerol och 15NH4Cl respektive. I senare skede av protokollet, selektivt 13C-märkt prover som framställts med selektivt 13C-märkta källor såsom (1,3 -13C)- och (2 -13C)-glycerol (eller (1 -13C)- och (2 -13C)- glukos) används för att underlätta NMR analysen. Blandade märkt provet motsvarar en equimolar blandning av antingen 50% 15N- och 50% 13C-märkta eller 50% (1,3 -13C)- och 50% (2 -13C)-glukos införs för att beskriva detektion av intermolekylära interaktioner. En hög grad av protein renhet samt rigorösa villkor under montering steg är viktiga faktorer för att försäkra en homogen strukturella ordning av det slutliga provet.
2. preliminära strukturell karaktärisering baserat på endimensionell (1D) solid-state NMR
Vi presenterar de viktiga experiment för en strukturell analys av SSNMR. Endimensionell (1D) kors-polarisering (CP) och INEPT / RINEPT28 experiment, upptäckts på 13C kärnor används för att upptäcka styva och flexibla protein segment i församlingen, respektive, och att uppskatta graden av struktur homogenitet och lokala polymorfism (för ett exempel, se figur 3).
<st></st>Rong > 3. Konfirmerande analys och 3D struktur bestämning
Underavsnitt 1 och 2 berör den konfirmerande analys, som är baserad på SSNMR resonans tilldelningen av alla styva rester av den protein-församlingen, som de kemiska förskjutningarna är mycket känsliga sonder till den lokala miljön och kan användas för att förutsäga den phi/psi tvåplansvinkel vinklar och avgöra därmed det sekundära strukturerar. Figur 4 illustrerar ett exempel på en sekventiell resonans tilldelning i styv kärna en protein församling. 3D-strukturen bestämningen bygger på insamling av strukturella uppgifter såsom avstånd begränsningar kodning Stäng anslutning (&#60; 7-9 Å), som innehåller både intra- och intermolekylära information. Underavsnitt 3 och 4 beskriva långväga avlägsen återhållsamhet insamling och tolkning. Långväga kontakter definieras som intramolekylära 13C -13C anslutning som härrör från rester jag j, med | i-j | ≥4, definiera därmed högre protein luckan den monomeriska subuniten eller som intermolekylära 13C -13C anslutning, definiera de intermolekylära gränssnitt mellan proteinsubenheter i församlingen. Intra- och intermolekylära gränssnitt illustreras i figur 5. SSNMR begränsningar upptäcks genom 13C -13C och 15N -13C återkoppling experiment oftast koda för internuclear avstånd &#60; 1 nm. Underavsnitt 4 förklarar detektion av intermolekylära avståndet begränsningar. I symmetriska protein församlingar, användning av homogeneously märkt prover (dvs 100% jämnt eller selektivt märkt) för att identifiera intermolekylära subunit-subunit interaktioner är begränsad, som både intra - och inter - molecular kontakter leda till detekterbara signaler. Otvetydig detektering av intermolekylära anslutning uppnås med hjälp av blandade märkt prover, som innehåller en equimolar blandning av två annorlunda märkt prover, kombinerade före sammanläggning. Underavsnitt 5 introducerar kort struktur modellering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
Figur 1 : Arbetsflödet en atomär upplösning strukturella studier av solid-state NMR. 13 C, 15N isotopen märkt proteinproduktion, subenhet rening, subenhet montering, kontroll av församlingens bildande, SSNMR experiment, SSNMR experiment analys och extraktion av avstånd begränsningar och struktur modellering visas. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Instruments</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR Spectrometer (&#62; 11.7 Tesla)</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">triple resonance MAS SSNMR probehead&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SSNMR rotors 4mm</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">K1910</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Centrifuge 5804 R&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5805000629</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">GeneQuant 1300 spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">28-9182-13</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">228001</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MaxQ 4450 bench top orbital shaker</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">78376</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tube Revolver Agitator</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">79547</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sonopuls HD 3100</td>
			<td style="width:117px;">Bandelin</td>
			<td style="width:119px;">3680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MicroPulser electroporator</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">mini-PROTEAN tetra cell system</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AKTA pure system</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-24</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillary microman M25 pipet</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148502</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Materials</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">amiconR ultra-15</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z740199-8EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillaries and pistons</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148112</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">spatula</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13263799</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">D-glucose 13C6</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">389374</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Ammonium-15N-chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">299251</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">1,3 13C2 glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">492639</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">2 13C glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">489484</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K1876</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3416</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7907</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71380</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208094</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Iron Chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">157740</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Zinc chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">793523</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MEM Vitamin Solution (100&#215;)</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M68954</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">IPTG</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tricine</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SDS</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">436143</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sodium azide</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">71289</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">178837</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Softwares</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Unicorn 6.3</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Akta systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">ccpNMR</td>
			<td style="width:117px;">CCPN&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">spectrometer systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy

Supramolekylär protein aggregat spela grundläggande roller i biologiska processer från värd-patogen interaktion, virusinfektion att förökningen av neurodegenerativa sjukdomar. Sådana församlingar bestå i flera proteinsubenheter organiserade i ett icke-kovalenta sätt att bilda stora makromolekylära objekt som kan utföra en mängd olika cellulära funktioner eller orsaka skadliga konsekvenser. Atomic insikter i mekanismerna som montering och funktion de makromolekylära församlingarna förblir ofta knappa sedan deras inneboende olöslighet och icke-kristallinitet ofta drastiskt minskar kvaliteten på de uppgifter som erhållits från de flesta tekniker används inom strukturbiologi, såsom röntgenkristallografi och lösning kärnmagnetisk resonans (NMR). Här presenterar vi magic-vinkel spinning solid-state NMR spektroskopi (SSNMR) som en kraftfull metod att undersöka strukturerna i makromolekylära församlingar på atomär upplösning. SSNMR kan avslöja Atom Detaljer på det monterade komplexet utan begränsningar storlek och löslighet. Protokollet presenteras här beskrivs de grundläggande steg från produktionen av 13C /15N isotop-märkt makromolekylära protein aggregat till förvärvet av standard SSNMR spectra och deras analys och tolkning. Som ett exempel visar vi försäljningsförloppet för en SSNMR strukturell analys av en trådformiga protein församling.

Typiska SSNMR arbetsflödet innehåller flera steg illustreras i figur 1. Vanligtvis proteinsubenheter produceras av in vitro- heterologa uttryck i E. coli, renat och monterade under skakning men ibland även under statiska förhållanden. Uttryck och rening av den protein-subenheten följs av SDS gel kromatografi (figur 2A). Bildandet av makromolekylära församlingar kan sedan bekräftas genom elektronmikroskopi (EM) analys (se figur 2B ett exempel på en trådformiga församling).
Efter införandet av den protein-församlingen i SSNMR rotorn, rotorn sätts in spektrometern, MAS frekvens och temperatur regleras och spektra registreras. Första insikter kan erhållas genom 1D SSNMR tekniker. Figur 3 visar en typisk SSNMR FID upptäckts på 13C kanal på ett strukturellt homogen protein prov, ett 1H13C CP spektrum, avslöjar13C resonanser i styv kärna ur av den protein-subenheten i den montering och ett 2D 1H -13C olämplig spektrum, som representerar de mobila resterna. För atom insikter sammansättningsstrukturen styv kärna måste flerdimensionella SSNMR experiment registreras på jämnt och selektivt märkt prover för att tilldela först SSNMR resonanser och sedan upptäcka långväga anslutning (se figur 4 ).
Alla spectra bearbetas och analyseras med lämplig programvara för att tilldela SSNMR resonanser och extrahera intra- och intermolekylära avståndet begränsningar (figur 5). SSNMR avstånd begränsningar används antingen ensamt eller tillsammans med data från kompletterande tekniker, som kan integreras i programmet modellering.
För representativa atomära strukturer av makromolekylära församlingar löst genom SSNMR tekniker illustrerar figur 6 flera fintrådiga församlingar från bakteriell bihang och amyloida fibriller.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
Figur 6:fintrådiga makromolekylära strukturer bestäms av en solid-state NMR-strategi: bakteriell filament och amyloid protein fibriller. A) typ1 pilus av uropathogenic E. coli, PDB kod 2N7H 4; B) ASC glödtråden, PDB kod 2N1F 63; C) typ III sekretion system nålar, PDB koder 2MME, 2LPZ och 2MEX 2,3,64; D) Amyloid-beta AB42 fibriller, PDB kod 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 och Osaka mutant PDB kod 2MVX 57, Iowa mutant PDB kod 2MPZ 58; E) alfa-synuklein fibriller, PDB kod 2N0A 68; F) HET-s prion domän, PDB kod 2RNM, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Strukturer för Supramolekylära protein församlingar på atomär upplösning är av hög relevans på grund av deras avgörande roller i en mängd olika biologiska fenomen. Häri, presenterar vi ett protokoll för att utföra högupplösta strukturella studier på olösliga och icke-kristallin makromolekylära protein aggregat av magi-vinkel spinning solid-state kärnmagnetisk resonansspektroskopi (MAS SSNMR).

Atomär skala strukturella studier av makromolekylära sammansättningar av Solid-state kärnmagnetisk resonans-spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Interpreting Nuclear Magnetic Resonance Spectra

SCIENTISTS IN ACTION

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Kärnmagnetisk resonansspektroskopi för identifiering av flera fosforyleringar av egen Oordnade proteiner

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi av enda proteinmolekyler genom en Atomic Force Mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Mäta interaktion av klotformig och fintrådiga proteiner av kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) och hur provtagningsutrustningen skall Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Strukturella studier av makromolekyler i lösningen med små Angle X-Ray Scattering

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Beredning av svamp och växtmaterial för strukturella klarläggande använder dynamisk nukleära polarisering Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Avbildning av extracellulära blåsor med atomkraft mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomabsorptionsspektroskopi för att mäta intracellulära Zinkpooler i däggdjurs celler

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisera enskilda protein aggregat med infraröd Nanospektroskopi och atomkraft mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri immunoprecipitation masspektrometri arbetsflöde för storskalig nukleär Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Avlägsnande och ersättning av endogena ligander från lipidbundna proteiner och allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...