Name: atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy
Uploaded: 2017-09-17T13:00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

Bu eser ANR (13-PDOC-0017-01 B.H. ve ANR-14-CE09-0020-01 al için) tarafından finanse edilen, "Geleceğe yatırım" programı IDEX Bordeaux/CNRS (B.H. için PEPS 2016) başvuru ANR-10-IDEX-03 / 02 için B.H., Fondation pour la Recherche Médicale) FRM-al için AJE20140630090), FP7 programı (FP7-insanlar-2013-çiğ al için) ve Avrupa Birliği'nin ufuk 2020 araştırma ve yenilik programı (ERC başlayan Grant için al, Sözleşme No 639020) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) ve proje " WEAKINTERACT."

Yazarlar ifşa gerek yok.

Solid-State NMR (SSNMR) makromoleküllerin protein derlemeler bir atomik düzeyde karakterize için bir seçim yöntemidir. Genellikle (ikincil içeren düşük çözünürlüklü modellerinden arasında değişen çeşitli duyarlıkla 3D Yapısal modeller oluşturma sağlayan incelenen sistem, spektral kalitesini SSNMR tabanlı yapı belirlenmesi temel konular biridir yapı elemanları ve küçük 3B bilgileri) sözde atom 3D yapılar. Miktar ve kalitesi çok boyutlu SSNMR deneylerden çıkarılan yapısal bilgi derleme bir yüksek çözünürlüklü NMR yapısını hesaplamak için anahtar.
13C -13C ve çeşitli 2D (ve bazen 3D) spectra yüksek sinyal gürültü ile kayıt gerektiren 15N -13C yapısal bağlar tespiti açıklanan protokol kullanır. Orta MAS frekanslarda (&#60; 25 kHz), örnek bırakmak ilâ ~ 50 mg, örnek hidrasyon üzerinde bağımlı protein miktarları için 3.2-4 mm çap boyutları ile rotor içine giriliyor. Rotor içinde örnek miktarı SSNMR spectra içinde sinyal-gürültü oranı, uzun menzilli mesafe kısıtlamaları tespiti ve onların kesin atama için bir belirleyici faktör için doğrudan orantılıdır.
Sıralı rezonans atama ve bağlar koleksiyon sırasında spektral çözünürlük çok önemli bir parametredir. En iyi sonuçları elde etmek için örnek hazırlama parametrelerinin, özellikle alt birim ve montaj koşulları (pH, tampon, sallayarak, sıcaklık, vb) arıtma içinde en iyi duruma getirilmiş gerekir. Örnek optimizasyonu için etiketlenmemiş örnekleri kendisi için birkaç farklı koşulları için derleme gözlenmiştir hazırlamak ve (2.1. adımda açıklanan) bir 1 D 1H -13C CP spektrumda her hazırlanmış örnek kaydetmek için önerilir. Spectra spektral çözünürlüklü ve dağılım optimal koşullar belirlenebilir üzerine dayalı farklı ürünleri arasında karşılaştırmak için hizmet vermektedir.
SSNMR verilerin kalitesini kesinlikle NMR satın alma parametrelerini, özellikle polarizasyon aktarma adımları seçimi bağlıdır. Yüksek manyetik alan güçlü (≥600 MHz 1H frekans) kullanımı yüksek hassasiyet ve spektral çözünürlük, makromoleküllerin protein derlemeler gibi karmaşık hedefleri Yüzleşirken gerekir gereklidir.
Spektrometre birçok durumda kısıtlayıcı bir faktör olduğunu. Bu nedenle, hazırlanacak akıllıca bir seçim örneklerin Spektrometre oturum önce gelmesi. Her durumda, aynı şekilde 13C, 15N etiketli sıralı ve intra kalan rezonans atama gerçekleştirmek için bir önkoşul örneğidir. Solid-state NMR tarafından atanan proteinler için bkz: teknikleri,71. Orta MAS frekanslarda makromoleküllerin derlemeleri yapı tayini seçmeli olarak 13C harfiyle örnekleri gerektirir; uzun menzilli 13C -13C ve 13C -15N tespiti 1,3 üzerinde tabanlı örnekleri kişiler için13C - ve 2 -13C-gylcerol ve/veya 1 -13C - ve 2 -13C-glikoz etiketleme vardır yaygın olarak kullanılan, yukarıda açıklandığı gibi. İki etiketleme düzeni arasında seçim spektral sinyal-gürültü oranı ve çözünürlük dayanmaktadır. Intra - ve cins uzun menzilli kişiler arasında ayrım yapmak için karışık örnekleri etiketli ve seyreltilmiş verimli koymuştur.
Kısacası, bir atom SSNMR yapısal çalışma için kritik adımlar şunlardır: mükemmel örnek miktar ve kalite elde etmek için (i) hazırlanması alt birimleri ve derleme optimize edilmiş olması gerek, (ii) Spektrometre alan gücü ve satın alma parametrelerini olmak zorunda özenle seçilmiş; (iii) seçmeli etiketleme stratejileri bir 3D yapı belirlenmesi için gerekli olan ve veri kalitesi ve tamamlayıcı verilerin kullanılabilirliğini gerekli veri miktarına bağlıdır.
Membran proteinlerinin homomultimeric nano-nesnelere kadar supramolecular sistemleri geniş bir yelpazesi için onun uygulanabilirliği rağmen SSNMR kez mg-miktarları isotopically etiketli malzeme ihtiyacını ile sınırlıdır. Ultra-Hızlı MAS (≥100 kHz) SSNMR 1H tespit NMR avenue aç son teknolojik gelişmeler ve itme en az örnek miktar sınırı için alt-mg 72,73,74. Yine de, detaylı yapısal çalışmaları için 13C harfiyle SSNMR uygulama örnekleri monte vitro veya üzerinde en az orta yerde hücre içi hayatta organizmalarda ifade sistemlerine sınırlar vazgeçilmez olduğu ( 75,76,77,78değerlendirmeleri görmek için) SSNMR ortaya çıkan bir yöntemdir.
Spektral çözünürlüğü yüksek çözünürlüklü 3D yapılar elde etmek için SSNMR uygulama önemli bir faktör olduğunu: derleme içinde içsel konformasyon heterojenite spektral analiz çözünürlük ve spectra sınırlandırmak. Kalıntı belirli 13C etiketleme bazı durumlarda Yapısal modeller (için bir son örnekler bkz: 79,80) elde etmek için stratejik artıkları üzerinde belirli mesafe bilgilerini elde etmek için bir alternatif sağlar.
SSNMR 3D yapı tayini için hala sofistike aletleri, yaklaşım ve sistem birkaç gün ile hafta 600-1000 MHz (1H frekans) üzerinde bağlı olarak sık sık uzun veri toplama günleri ile çeşitli veri toplama gerektirir Spektrometre. Bu nedenle, Spektrometre zamanına erişimi derinlemesine bir SSNMR çalışma içinde kısıtlayıcı bir faktör olabilir.
Homomultimeric protein derlemeler için yeterli kalitede SSNMR veri 3,57,64,70, SSNMR gibi yapısal bağlı çok sayıda tanımlamak için önde gelen söz konusu olduğunda, hala mikroskobik boyutlara erişimi verir. Bu nedenle, bir de novo SSNMR yapı tayini homomultimeric derleme içinde EM veya kütle başına uzunluğu (MPL) veri ideal simetri parametreleri türetmek için SSNMR veri tamamlıyor. SSNMR veri yalnız atomik Intra - ve cins arabirimleri sağlar
SSNMR son derece EM veya MPL ölçümleri gibi yapısal teknikleri ile tamamlayıcı ama verileri de mükemmel x-ışını kristalografisi veya çözüm NMR mutasyona uğramış veya kesilmiş alt birimleri üzerinde elde edilen atomik yapıları ile kombine edilebilir. Çalışmalar giderek artan sayıda nerede farklı yapısal veri birlikte makromoleküllerin derlemeler (temsilcisi örnek için bkz: şekil 6 ) atom 3D modelleri belirlemek için izin verdi edebiyat bulunabilir.
Yapısal Biyoloji alanında, SSNMR eğitim için umut verici tekniği ortaya çıkıyoratomik düzeyde, Yani sağlayan yapısal veri atomik ölçekli, çözünmez ve kristal olmayan derlemeler. Bu bağlamda, SSNMR çözüm NMR ve x-ışını kristalografisi membran proteinlerinin viral zarf, bakteriyel filamentler veya amyloids gibi RNA gibi kendi yerel çevre ve protein meclisleri dahil olmak üzere moleküler derlemeler için kolyesi ve RNA-protein kompleksleri (örneğin bkz:81). Onun çok yönlü uygulamalar vitro ve ikincil, üçüncül ve Kuvaterner yapısal değişiklikleri izleme gibi hücresel bağlamında ortak molekülleri atom ölçeğinde (örneğin 82) ile etkileşim yüzeyler belirlenmesi ve Moleküler dinamiği bağlamında monte kompleksleri, eşleme, SSNMR önemli potansiyel karmaşık biyomoleküler derlemeler gelecekteki yapısal çalışmalarında gösterir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bileşen</td>
			<td>M9 orta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>0.5 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>3 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>6,7 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>10 MİKRON</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>1 MİKRON</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>100 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin karışımı 100 X</td>
			<td>10 mL/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13 C-glikoz</td>
			<td>2 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 NH4Cl</td>
			<td>1 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Çok az ifade orta rekombinant protein bileşimi üretim E. coli BL21 hücreleri.

Büyü-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (SSNMR) iplik gelişmeler makromoleküllerin protein derlemeler bir atomik çözünürlükte yapısal karakterizasyonu için verimli bir araç sunar. Bu protein derlemeler birçok biyolojik süreçlerinde önemli rol oynarlar her yerde sistemlerdir. Moleküler yapıları, etkileşimleri ve dinamikleri için gösterildiği gibi SSNMR çalışmaları tarafından erişilebilir viral (capsids1) ve bakteriyel enfeksiyon mekanizmaları (salgı sistemleri2,3, pili4), membran protein kompleksleri5,6,7,8 ve fonksiyonel amyloids 9,10,11. Bu moleküler derleme türünü de nerede proteinler misfolded, amiloid Devletleri'nde birleştirin ve anormal hücre davranış veya hücre ölüm 12,13neden nörodejeneratif hastalıklarda gibi patolojiler sebep olabilir. Protein derlemeler kez büyük supramolecular nesneler liflerinde, filamentler, gözenekleri, tüpler veya nano tanecikleri gibi çeşitli şekiller içine protein alt katları kopyasını simetrik Oligomerizasyonda tarafından inşa edilir. Kuvaterner mimari protein alt uzamsal ve geçici derleme düzenlemek ve sofistike biyolojik fonksiyonlar için izin için arasındaki zayıf etkileşimler tarafından tanımlanır. Bu derlemeler atomik bir ölçekte, yapısal araştırmalar yüksek çözünürlüklü teknikleri için bir meydan okuma kendi içsel insolubility beri vardır ve çok sık olmayan kendi crystallinity geleneksel x-ışını kristalografisi veya çözüm NMR kullanımını sınırlar yaklaşıyor. Büyü-açı (MAS) SSNMR iplik çözünmez makromoleküllerin derlemeler üzerinde atomik çözünürlük verileri elde etmek için ortaya çıkan bir tekniği ve giderek artan sayıda dahil olmak üzere karmaşık biyomoleküler sistemleri için 3D atom modelleri gidermek için verimlilik kanıtlamıştır Bakteriyel filamentler, amiloid derlemeler ve viral parçacıkların 14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Yüksek manyetik alanlar, metodolojik gelişmeler ve numune hazırlama teknik gelişmeler onların biyolojik ilgili başta olmak üzere çeşitli ortamlarda çözünmez proteinler makromoleküllerin araştırmak için sağlam bir yönteme MAS SSNMR kurmuştur devlet veya hücresel membranlarda, bu teknik son derece cryo-elektron mikroskobu tamamlayıcı yapım toplandı. Çoğu durumda, bu tür protein derlemeler çok yüksek bir simetri belirtir. MAS SSNMR yararlanan bu özellik, tüm protein alt homomolecular derlemesi içinde aynı yerel yapıya olurdu gibi ve bu nedenle büyük ölçüde analizi karmaşıklığını azaltarak hemen hemen aynı SSNMR imza,.
Makromoleküllerin protein meclisleri tarafından orta MAS yapısal çalışmaları için verimli bir iletişim kuralı (&#60; 25 kHz) SSNMR Bu videoda sunulur ve içine farklı adımlar (şekil 1) bölünmüştür. Biz iş akışı örneği için her protein farklı bir ipliksi protein derleme ( şekil 1' deki vurgulanır bkz: adım), protein alt birimi arıtma dışında bir SSNMR yapısal çalışmanın kritik aşamalarında gösterecektir derleme ama kritik öneme sahip yapısal Etütler ve SSNMR spektroskopisi ve yapısı hesaplama ne özel öğreticiler için teknik/metodolojik ayrıntılarını girmeden olmadan online olarak mevcuttur. Mevcut iletişim kuralı öncelikle MAS koşullar altında gerçekleştirilen solid-state NMR deneyler ele alınacak iken, biyolojik ortamlar 23,24,25,26 kullanımını hizalı , 27, hizalanmış bicelles gibi protein uyum ve dinamik protein-protein etkileşim MAS teknoloji olmadan membran benzeri ortamda incelenmesi için izin verir. Biz çok önemli SSNMR spectra ve onların analizi ve yorumu kayıt yanı sıra protein ifade ve derleme adımları gösterir. Amacımız SSNMR tekniklerle makromoleküllerin derleme bir atomik çözünürlüklü yapısal çalışma gerçekleştirmek için okuyucu etkinleştirme yapısal analiz boru hattı anlayışlar sağlamaktır.
İletişim kuralı 3 bölümleri kapsar:
1. solid-state NMR örnek üretim
Bir solid-state NMR analizi için bir ön koşul, protein bileşenleri ifade edilecek makromoleküllerin derleme gereksiniminin, izotop etiketli, saflaştırılmış ve monte vitro yerli gibi karmaşık duruma (için bir örnek bkz: Şekil 2) . Yüksek NMR hassasiyet sağlamak için izotop zenginleştirme 13C ve 15N etiketleme 13C ve düzgün 13 gibi 15N kaynakları ile takıma en az bakteriyel ifade medya aracılığıyla gereklidir C harfiyle glikoz/gliserol ve 15NH4Cl anılan sıraya göre. İletişim kuralı daha sonraki aşamada, 13C harfiyle örnekleri seçerek C harfiyle kaynakları gibi seçmeli olarak 13ile üretilen (1,3 -13C)- ve (2 -13C)-gliserol (veya (1 -13C)- ve (2 -13C)- glikoz) NMR analizi kolaylaştırmak için kullanılır. Karışık etiketli örnek ekimolar karışımı %50 15N - ve C harfiyle veya %50 %50 13için karşılık gelen (1,3 -13C)- ve % 50 (2 -13C)-glikoz cins tespiti açıklamak için sunulmaktadır etkileşimler. Protein saflık yanı sıra derleme adımı sırasında sıkı koşullar büyük ölçüde son örnek homojen bir yapı sırasını sigortalamak için anahtar faktörler vardır.
2. ön yapısal karakterizasyon tek boyutlu (1 D) solid-state NMR üzerinde dayalı
Biz SSNMR göre yapısal analiz için gerekli deneyleri mevcut. Tek boyutlu (1D) çapraz-polarizasyon (CP) ve INEPT / RINEPT28 deneyler, 13C çekirdeği üzerinde tespit katı ve esnek protein parçaları derlemede, sırasıyla algılamak ve yapısal derecesini tahmin etmek için kullanılır homojenliği ve yerel polimorfizmi (için bir örnek bkz. şekil 3).
<st></st>Rong > 3. Konformasyon analizi ve 3D belirlenmesi yapısı
Alt bölüm 1 ve 2 olarak kimyasal vardiya yerel çevre için çok hassas probları ve phi/psişik tahmin etmek için kullanılan tüm katı artıkları protein derleme SSNMR rezonans göreve dayalı konformasyon analizi, endişe dihedral açılar ve böylece ikincil yapı belirlemek. Şekil 4 katı çekirdek bir sıralı rezonans atama bir protein derleme. örneği gösterilmiştir Kodlama mesafe kısıtlamaları proximities kapatmak gibi 3D yapı belirlenmesi yapısal veri toplama dayanarak (&#60; 7-9 Å), içi - hem cins bilgi içeren. Alt bölüm 3 ve 4 uzun menzilli uzak tutma toplama ve yorumlama açıklar. Uzun menzilli kişiler doğan kalıntı ben j için ile intramolecular 13C -13C proximities olarak tanımlanır | i-j | ≥4, böylece Tersiyer protein kat bir monomeric alt birimi veya cins 13C -13C proximities olarak tanımlama, protein alt montaj arasında cins arabirimler tanımlama. Intra - ve cins arabirimleri şekil 5' te gösterilmiştir. SSNMR bağlar tespit 13-C -13C ve 15N -13C recoupling deneyler genellikle kodlamak için internuclear mesafeler &#60; 1 nm. Alt bölüm 4 cins mesafe kısıtlamaları tespiti açıklar. Simetrik protein meclisleri, homojen etiketli örnekleri (Yani düzgün veya seçmeli olarak etiketli % 100) kullanımı cins alt birim-alt birim etkileşimleri tanımlayan sınırlı olduğu için her iki Intra - ve arası - molecular olarak kişiler neden algılanabilir sinyalleri. Cins proximities kesin tespiti toplama önce kombine iki farklı etiketli örnek ekimolar bir karışımı içeren karma etiketli örnekleri kullanılarak elde edilir. Alt 5 yapı modelleme kısaca tanıtır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig1.jpg"> 
Resim 1 : İş akışı solid-state NMR tarafından bir atomik çözünürlüklü yapısal çalışmanın. 13 C, 15N izotop etiketli protein üretim, alt birim arıtma, alt birim derleme, derleme oluşumu, SSNMR deneyleri, SSNMR deney analizi ve mesafe kısıtlamaları çıkarımı kontrol ve yapı modelleme gösterilir. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="741">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Instruments</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">NMR Spectrometer (&#62; 11.7 Tesla)</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">triple resonance MAS SSNMR probehead&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SSNMR rotors 4mm</td>
			<td style="width:117px;">Bruker</td>
			<td style="width:119px;">K1910</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Centrifuge 5804 R&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5805000629</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">GeneQuant 1300 spectrometer</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">28-9182-13</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">IGS60 INCUBATEUR HERATHERM 75 L</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">228001</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MaxQ 4450 bench top orbital shaker</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">78376</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tube Revolver Agitator</td>
			<td style="width:117px;">Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">79547</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sonopuls HD 3100</td>
			<td style="width:117px;">Bandelin</td>
			<td style="width:119px;">3680</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MicroPulser electroporator</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100&#160;</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">mini-PROTEAN tetra cell system</td>
			<td style="width:117px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-8000</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">AKTA pure system</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">29-0182-24</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillary microman M25 pipet</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148502</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Materials</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">amiconR ultra-15</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">Z740199-8EA</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">capillaries and pistons</td>
			<td style="width:117px;">Gilson&#160;</td>
			<td style="width:119px;">F148112</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">spatula</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13263799</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Reagents</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">D-glucose 13C6</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">389374</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Ammonium-15N-chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">299251</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:251px;">1,3 13C2 glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">492639</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:251px;">2 13C glycerol</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">489484</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Kanamycin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">K1876</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Carbenicillin</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3416</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7907</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P5655</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">71380</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">calcium chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C1016</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Magnesium sulfate</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">208094</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Iron Chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">157740</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Zinc chloride</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">793523</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">MEM Vitamin Solution (100&#215;)</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M68954</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">IPTG</td>
			<td style="width:117px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Trizma base&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Tricine</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">T0377</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">SDS</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">436143</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">sodium azide</td>
			<td style="width:117px;">sigma</td>
			<td style="width:119px;">71289</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:251px;">4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid&#160;</td>
			<td style="width:117px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">178837</td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Name</td>
			<td style="width:117px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Softwares</td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">Unicorn 6.3</td>
			<td style="width:117px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">Akta systems</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:251px;">ccpNMR</td>
			<td style="width:117px;">CCPN&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:255px;">spectrometer systems</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic scale structural studies of macromolecular assemblies by solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy

Supramolecular protein derlemeler biyolojik süreçlerin ana bilgisayar-patojen etkileşim, nörodejeneratif hastalıkların yayılması için viral enfeksiyon arasında değişen temel rol oynar. Bu tür derlemeleri çeşitli hücresel işlevler yürütmek veya zararlı sonuçlara neden büyük makromoleküllerin nesneleri oluşturmak için kovalent olmayan şekilde organize birden fazla protein alt oluşur. Atomik yorumlara derleme mekanizmaları ve makromoleküllerin bu derlemelerinin çalıştığını kez onların doğasında insolubility beri kıt kalır ve sigara crystallinity kez büyük ölçüde çoğu teknikleri elde edilen verilerin kalitesini azaltır x-ışını kristalografisi ve çözüm Nükleer manyetik rezonans (NMR) gibi Yapısal Biyoloji kullanılır. Burada atomik çözünürlükte makromoleküllerin derlemeler yapılarının araştırmak için güçlü bir yöntem olarak magic-açı iplik solid-state NMR spektroskopisi (SSNMR) mevcut. SSNMR boyut ve çözünürlük sınırlamalar olmadan montajı karmaşık atomik detayları ortaya çıkarabilir. Burada sunulan protokolü 13C üretiminden önemli adımları açıklar /15N makromoleküllerin protein izotop etiketli derlemeler standart SSNMR spectra ve onların analizi ve yorumu edinimi için. Örnek olarak, boru hattının SSNMR yapısal çözümleme ipliksi protein derleme gösteriyoruz.

Normal SSNMR iş akışı şekil 1' de gösterildiği birkaç adım içerir. Genellikle protein alt E. coli vitro Contegra ifade tarafından üretilen, saf ve sallayarak altında ama bazen de statik koşullarda toplandı. İfade ve arıtma bir protein alt birimi SDS jel Kromatografi (şekil 2A) tarafından takip edilmektedir. Makromoleküllerin derlemeler oluşumu sonra elektron mikroskobu (EM) analiz tarafından teyit edilmesi (ipliksi derleme bir örneği için bkz: şekil 2B ).
Sonra SSNMR rotor protein derlemesini getirilmesi, rotor Spektrometre eklenir, MAS frekans ve sıcaklık düzenlenmektedir ve spectra kaydedilir. İlk anlayışlar 1 D SSNMR teknikleri ile elde edilebilir. Şekil 3 gösterir bir yapısal olarak homojen protein örneği, katı çekirdek bir protein alt birimi mevcut13C rezonanslar açığa bir 1H13C CP spektrumlu, 13C kanalında tespit tipik bir SSNMR FID derleme ve mobil artıkları temsil eden bir 2D 1H -13C BECERİKSİZ spektrum. Derleme yapı katı çekirdek atom anlayışlar için çok boyutlu SSNMR deneyler üzerinde kaydedilmek üzere düzgün ve seçmeli olarak ilk SSNMR rezonanslar atamak ve uzun menzilli proximities (bkz: şekil 4 algılamak için örnekleri etiketli gerekir ).
Tüm spectra işlenir ve SSNMR rezonanslar atamak ve içi ve cins mesafe kısıtlamaları (şekil 5) ayıklamak için yeterli yazılım ile analiz. SSNMR mesafe kısıtlamaları da tek başına kullanılan veya tamamlayıcı teknikleri verileri ile birlikte, hangi modelleme programa entegre edilebilir.
Atomik yapıları SSNMR teknikleri tarafından çözüldü makromoleküllerin derlemeler için şekil 6 bakteriyel ekleri ve amiloid liflerinde birkaç ipliksi derlemelerden göstermektedir.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2.jpg"> 
Şekil 6:ipliksi makromoleküllerin yapılarının bir solid-state NMR yaklaşım tarafından belirlenir: bakteriyel filamentler ve amiloid protein liflerinde. A) tip 1 pilus, uropathogenic E. coli, PDB kod 2N7H 4; B) ASC filament, PDB kod 2N1F 63; C) Tip III salgı sistemi iğneler, PDB kodları 2MME, 2LPZ ve 2MEX 2,3,64; D) Amiloid beta AB42 liflerinde, PDB kodu 2NAO, 5KK3, 2MXU 65,66,67 ve Osaka mutant PDB kod 2MVX 57, Iowa mutant PDB kod 2MPZ 58; E) Alpha-synuclein liflerinde, PDB kod 2N0A 68; F) HET-s deli dana etki alanı, PDB kodu 2RNM, 2KJ3 69,70. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55779/55779fig6v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy at JoVE.com

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Supramolecular protein derlemeler atomik çözünürlükte yüksek alaka nedeniyle çok önemli rolleri biyolojik olayları çeşitli yapılardır. Burada, biz bir protokol tarafından magic-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (MAS SSNMR) iplik çözünmez ve kristal makromoleküllerin protein derlemeler üzerinde yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar gerçekleştirmek için mevcut.

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biochemistry

Unit 1

Interpreting Nuclear Magnetic Resonance Spectra

SCIENTISTS IN ACTION

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR) ve Microscale Thermophoresis (MST) tarafından küresel ve ipliksi protein etkileşimleri ölçme

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Structural Studies of Macromolecules in Solution using Small Angle X-Ray Scattering

Küçük açı x-ışını saçılması kullanarak çözüm yapısal oluştururlar çalışmaları

Protein-protein interactions involving proteins with multiple globular domains present technical challenges for determining how such complexes form and ...

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

Yapısal aydınlatma kullanarak dinamik nükleer polarizasyon Solid-State NMR için bitki malzeme ve mantar hazırlanması

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Hücre Dışı Veziküllerin Görüntülenmesi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Lipid'e Bağlı Proteinler ve Alerjenlerden Endojen Ligandların Çıkarılması ve Değiştirilmesi

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...