Name: analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry
Uploaded: 2017-06-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer og Bpifrance. Vårt laboratorium støttes også av Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie og programmet &quot;Investissements d&#39;avenir&quot; ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Vi vil gjerne takke assistansen fra CELIS-kjerne-kjernefasiliteten.

Alle metodene som er beskrevet her, er godkjent av Institutt for dyrepleie og bruk i ICM-instituttet og av Darwin franske etiske dyrekomite, og dekkes under protokollen 01407.02. 1. Fremstilling <ol><li> Klargjør fordøyelsesscocktailen i et 1,5 ml rør ved å kombinere følgende for hver mus: 1 ml fosfatbuffert saltvann (PBS); 123 μL fordøyelsesenzym (se tabell over materialer) ved 13 wunsch / ml (stamløsning), sluttkonsentrasjon 1,6 wunsch / ml; Og 5 μl DNase I (se tabell over mater...

<ol>
	<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+differentiation+of+microglia.">Origin and differentiation of microglia.</a> Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).</li><li>Ginhoux, F., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+and+macrophages:+developmental+pathways+and+tissue+homeostasis.">Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis.</a> Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>London, A., Cohen, M., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+monocyte-derived+macrophages:+functionally+distinct+populations+that+act+in+concert+in+CNS+plasticity+and+repair.">Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair.</a> Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).</li><li>Miron, V. E., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CNS+remyelination.">Macrophages and CNS remyelination.</a> J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+non-redundant+roles+of+microglia+and+myeloid+subsets+in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).</li><li>Boillee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+and+progression+in+inherited+ALS+determined+by+motor+neurons+and+microglia.">Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia.</a> Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wu, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+microglial+activation+is+neuroprotective+in+the+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine+mouse+model+of+Parkinson+disease.">Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).</li><li>Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microglia+in+human+disease:+therapeutic+tool+or+target?.">The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target?.</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).</li><li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infiltrating+monocytes+trigger+EAE+progression,+but+do+not+contribute+to+the+resident+microglia+pool.">Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool.</a> Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).</li><li>Funk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+peripheral+hematopoietic+stem+cells+and+monocytes+in+Parkinson's+disease.">Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease.</a> Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).</li><li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+inflammatory+monocytes+with+a+unique+microRNA+gene+signature+ameliorates+murine+ALS.">Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).</li><li>Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+cells+in+the+central+nervous+system+of+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+are+associated+with+blood+vessels+and+express+CX(3)CR1.">Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1.</a> Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).</li><li>Sedgwick, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system.">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).</li><li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4++T+cells+compared.">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).</li><li>Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+inflammatory+phenotypes+of+microglia+and+monocyte-derived+macrophages+in+Alzheimer's+disease+models:+effects+of+aging+and+amyloid+pathology.">Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology.</a> Aging Cell. , (2016).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Jin, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+glutamine+transporter+SNAT1+in+Rett+syndrome+microglia:+a+mechanism+for+mitochondrial+dysfunction+and+neurotoxicity.">Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity.</a> J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).</li><li>Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomagnetic+enrichment+and+flow+cytometric+characterization+of+mouse+microglia.">Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia.</a> J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).</li><li>Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytofluorometric+method+for+the+simultaneous+detection+of+both+intracellular+and+surface+antigens+of+apoptotic+peripheral+lymphocytes.">A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).</li><li>Richter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-associated+microglia+and+macrophages/monocytes+display+distinct+electrophysiological+properties+and+do+not+communicate+via+gap+junctions.">Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions.</a> Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).</li><li>Mahad, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+CCR2+and+CCL2+at+the+blood-brain+barrier:+relevance+for+multiple+sclerosis+pathogenesis.">Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis.</a> Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).</li></ol>

Det har blitt påvist at microglia og MDM har forskjellige funksjoner og fenotyper i CNS, og identifikasjon og analyse av disse makrofag subpopulasjonene er derfor avgjørende for å bedre forstå nevrologiske sykdommer 9 , 18 , 25 . Flowcytometrianalyse ved bruk av to markører (CD11b og CD45) gjør det mulig å skille mellom hver subpopulasjon ( figur 3C ). Denne strategien ble tidligere validert...

Mikroglia er de parenkymale vevsbesidige makrofager i sentralnervesystemet (CNS). De spiller to viktige funksjonelle roller: immunforsvar og vedlikehold av CNS homeostasis. I motsetning til MDM, som fornyes kontinuerlig fra de hematopoietiske stamceller i beinmargen, skiller mikroglceller seg fra primitive hematopoietiske stamceller fra opprinnelsen i eggeplommesekken (YS) som koloniserte hjernen under embryonisk utvikling 1 , 2 , 3 . I gnagere spiller transkripsjonsfaktoren Myb en avgjørende rolle i utviklingen av alle knoglemarv-avledede monocytter og makrofager, men for YS-avledet mikroglia er denne faktoren dispensabel og differensiering er fortsatt avhengig av transkripsjonsfaktoren PU.14. I den sunne CNS er microglia dynamiske celler som hele tiden prøver deres miljø, scaNning og oppmåling for invaderende patogener eller vevskader 5 . Påvisning av slike signaler initierer en vei for å løse skaden. Mikroglia bytter raskt fra en forgrenet morfologi til en amoeboid, som følges av fagocytose og frigjøring av forskjellige mediatorer, som for eksempel pro- eller antiinflammatoriske cytokiner. Således, avhengig av mikromiljøet, kan aktivert mikroglia oppnå et spektrum av forskjellige primære tilstander 6 . Mikroglia påvirker utviklingen og utviklingen av mange nevrologiske lidelser sterkt. I gnagermodellene av Alzheimers sykdom (AD) 7 , Amyotrofisk lateral sklerose (ALS) 8 , Multiple Sclerosis (MS) 9 eller Parkinsons sykdom (PD) 10 , er microglia vist å spille en dobbel rolle, enten å fremkalle skadelig nevrotoksisitet eller skape På en nevrobeskyttende måte, som er avhengig oN den spesifikke sykdommen, sykdomsstadiet, og om sykdommen var påvirket av det systemiske immunforsvaret 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . De fleste av CNS-lesjonene observert i sykdommene nevnt ovenfor, inneholder en heterogen populasjon av myeloidceller, inkludert ikke bare parenkym mikroglia, men også perivaskulære og meningeal makrofager, samt CNS-infiltrerende MDM. Disse celletyper kan differensielt bidra til patofysiologiske mekanismer relatert til skade og reparasjon 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . Den nåværende utfordringen for etterforskere som studerer disse sykdomsmodellene er å fastslå om de perifere monocytter og makrofager infiltrerer CNS og i så fall for å distanseInnlemme bosatt mikroglia fra disse cellene. Faktisk er mikroglialcellene veldig plastiske; Når de blir aktivert, uttrykker microgliaen markørene som vanligvis uttrykkes av perifere monocytter og makrofager. Problemet er derfor avhengig av å identifisere markører som kan skille den residente mikroglia fra infiltrerende monocytter og makrofager. Diskrimineringen av disse populasjonene på hjerneskiver ved immunohistologiske anvendelser er begrenset på grunn av mangel på spesifikke antistoffer. Imidlertid er strømningscytometrianalyse en effektiv teknikk for å vurdere ekspresjonen av flere markører og å skille cellepopulasjoner (for eksempel lymfocytter, makrofager / MDM CD11b + CD45 høye og microglia CD11b + CD45 med ), så vel som celle subpopulasjoner 16 , 17 , 18 . Denne protokollen beskriver prosedyrene for å isolereMononukleære celler fra mus CNS i nevrologiske sykdomsmodeller ved å bruke en optimalisert, enzymatisk vevsdissociasjon og en tetthetgradient-sentrifugering; Samt en metode for å differensiere mikroglia- og MDM-populasjonene i CNS ved hjelp av flytcytometri. En annen tilnærming er å eliminere myelin og rense cellene ved å bruke magnetiske perler konjugert til spesifikke antistoffer 19 , 20 , 21 . Myelinfjerning ved hjelp av anti-myelinmagnetiske perler er dyrere og påvirker levedyktigheten og utbyttet av isolerte celler 22 . Dette trinnet og den følgende immunomagnetiske separasjonen av microglia begrenser ytterligere studier av spesifikke immuncellepopulasjoner 21 , 22 . Disse prosedyrene gir en enkel måte å studere makrofag subpopulasjoner i sykdomsutvikling, ogFor å bestemme legemiddeleffekter eller genmodifikasjoner på makrofagfenotyper og aktiveringstilstander.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="908">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">5-month-old Mice</td>
			<td style="width:223px;">Janvier</td>
			<td style="width:119px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liberase TL Research Grade</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">5401020001</td>
			<td>Digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Percoll</td>
			<td style="width:223px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01&#160;</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Cell Strainer size 70 &#181;m Nylon</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">731751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Venofix 25G</td>
			<td style="width:223px;">BRAUN</td>
			<td style="width:119px;">4056370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Piston syringe 10 mL</td>
			<td style="width:223px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS+10ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Pasteur pipette 230 mm</td>
			<td style="width:223px;">Dustcher</td>
			<td style="width:119px;">20420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,5 mL&#160; tube</td>
			<td style="width:223px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">15 mL&#160; tube</td>
			<td style="width:223px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">50 mL&#160; tube</td>
			<td style="width:223px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td style="width:223px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">EDTA</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Bovine Serum Albumin solution 30%</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Paraformaldehyde 32% Solution</td>
			<td style="width:223px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15714-S</td>
			<td>Caution -Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Saponin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70)</td>
			<td style="width:223px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">45-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5</td>
			<td style="width:223px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">45-4031&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">563890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">BV421 Rat IgG2b, &#954; Isotype Control RUO</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3)</td>
			<td style="width:223px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Anti-Mouse CD16/CD32 Purified</td>
			<td style="width:223px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">14-0161</td>
			<td>Mouse Fc Block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fixable Dead Cell Stain Kits</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L34969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">FAB5538A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">IC013A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">FAB5825P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Goat IgG PE-conjugated Antibody</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">IC108P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:223px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Cell analyzer</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BD FACSVERSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Data Analysis Software</td>
			<td style="width:223px;">FlowJo LLC</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mayo Scissors</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14010-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry

Tallrike studier har vist rollen som immunceller, særlig makrofager, i sentralnervesystemet (CNS) patologier. Det er to hoved makrofagpopulasjoner i CNS: (i) microgliaen, som er de residente makrofager av CNS, og er avledet fra blommesekkprogenitorer under embryogenese, og (ii) de monocytt-avledede makrofager (MDM) som kan infiltrere CNS i løpet av sykdommen og er avledet fra benmarg progenitorer. Rollene til hver makrofag subpopulasjon varierer avhengig av hvilken patologi som studeres. Videre er det ingen konsensus om de histologiske markørene eller de særegne kriteriene som brukes for disse makrofag subpopulasjoner. Analysen av ekspresjonsprofilene til CD11b og CD45 markørene ved hjelp av flytcytometri tillater oss imidlertid å skille microgliaen (CD11b + CD45 med ) fra MDM (CD11b + CD45 høy ). I denne protokollen viser vi at tetthetgradient sentrifugeringOg strømningscytometrianalysen kan brukes til å karakterisere disse CNS-makrofag-subpopulasjonene, og å studere flere markører av interesse uttrykt av disse cellene som vi nylig publiserte. Denne teknikken kan således videre forstå vår rolle for makrofager i musemodeller av nevrologiske sykdommer, og kan også brukes til å evaluere medisinske effekter på disse cellene.

Etter tetthetgradient sentrifugering og antistofffarging ble cellene kjøpt på et strømningscytometer og analysert ved anvendelse av en morfologisk gatingstrategi som følger. En første gate ble definert i punktpunktet Forward-Spreaded Area (FSC-A) versus Forward-Spreaded-Height (FSC-H) for å diskriminere enkeltceller fra dubletter ( Figur 3A ). Enkeltcellene ble deretter gated på punkt-spredt-område (SSC-A) DOT-plott for FSC-A versus...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry at JoVE.com

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Denne protokollen gir en analyse av makrofag subpopulasjonene i den voksne musens sentrale nervesystem ved hjelp av flytcytometri og er nyttig for studiet av flere markører uttrykt av disse cellene.

Analyse av mikroglia og monocyt-avledede makrofager fra sentralnervesystemet ved hjelp av flytcytometri

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Dyrking Microglia fra Neonatal og voksne sentralnervesystemet

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Kultur av makrofag-kolonistimulerende faktor Differensiert Humant Monocyte makrofager

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Karakterisering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler ved Imaging flowcytometrisystemer: En sammenligning mellom to Monocyte Isolation protokoller

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Fenotypisk Karakterisering av makrofager fra Rat Nyre ved flowcytometri

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Kvalitativ og kvantitativ analyse av immun Synapse i menneskelige systemet ved hjelp av Imaging flowcytometri

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolering og karakterisering rensing av makrofager fra vev av fedme-relaterte betennelse

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolasjon og In Vitro kultur Murine og menneskelig Alveolar makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Karakteristikk av menneskelig Monocyte delsett av hele blod flyte cytometri analyse

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow Cytometric Analyse av lymfocytt infiltrasjon i sentralnervesystemet under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

Isolering av vev i sentralnervesystemet og tilhørende meninger for nedstrømsanalyse av immunceller

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...