Name: analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry
Uploaded: 2017-06-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado por bolsas da Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer e Bpifrance. O nosso laboratório também é apoiado pela Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie e o programa &quot;Investissements d&#39;avenir&quot; ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Gostaríamos de agradecer a assistência das instalações centrais da cultura CELIS.

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal no Instituto ICM e pelo Comitê de Ética Francesa Darwin, e estão cobertos pelo protocolo 01407.02. 1. Preparação <ol><li> Prepare o cocktail de digestão em um tubo de 1,5 mL, combinando o seguinte para cada mouse: 1 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS); 123 μL de enzima de digestão (ver tabela de materiais) a 13 wunsch / mL (solução de reserva), concentração final ...

<ol>
	<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+differentiation+of+microglia.">Origin and differentiation of microglia.</a> Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).</li><li>Ginhoux, F., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+and+macrophages:+developmental+pathways+and+tissue+homeostasis.">Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis.</a> Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>London, A., Cohen, M., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+monocyte-derived+macrophages:+functionally+distinct+populations+that+act+in+concert+in+CNS+plasticity+and+repair.">Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair.</a> Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).</li><li>Miron, V. E., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CNS+remyelination.">Macrophages and CNS remyelination.</a> J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+non-redundant+roles+of+microglia+and+myeloid+subsets+in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).</li><li>Boillee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+and+progression+in+inherited+ALS+determined+by+motor+neurons+and+microglia.">Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia.</a> Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wu, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+microglial+activation+is+neuroprotective+in+the+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine+mouse+model+of+Parkinson+disease.">Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).</li><li>Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microglia+in+human+disease:+therapeutic+tool+or+target?.">The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target?.</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).</li><li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infiltrating+monocytes+trigger+EAE+progression,+but+do+not+contribute+to+the+resident+microglia+pool.">Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool.</a> Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).</li><li>Funk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+peripheral+hematopoietic+stem+cells+and+monocytes+in+Parkinson's+disease.">Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease.</a> Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).</li><li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+inflammatory+monocytes+with+a+unique+microRNA+gene+signature+ameliorates+murine+ALS.">Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).</li><li>Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+cells+in+the+central+nervous+system+of+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+are+associated+with+blood+vessels+and+express+CX(3)CR1.">Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1.</a> Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).</li><li>Sedgwick, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system.">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).</li><li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4++T+cells+compared.">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).</li><li>Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+inflammatory+phenotypes+of+microglia+and+monocyte-derived+macrophages+in+Alzheimer's+disease+models:+effects+of+aging+and+amyloid+pathology.">Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology.</a> Aging Cell. , (2016).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Jin, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+glutamine+transporter+SNAT1+in+Rett+syndrome+microglia:+a+mechanism+for+mitochondrial+dysfunction+and+neurotoxicity.">Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity.</a> J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).</li><li>Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomagnetic+enrichment+and+flow+cytometric+characterization+of+mouse+microglia.">Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia.</a> J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).</li><li>Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytofluorometric+method+for+the+simultaneous+detection+of+both+intracellular+and+surface+antigens+of+apoptotic+peripheral+lymphocytes.">A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).</li><li>Richter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-associated+microglia+and+macrophages/monocytes+display+distinct+electrophysiological+properties+and+do+not+communicate+via+gap+junctions.">Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions.</a> Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).</li><li>Mahad, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+CCR2+and+CCL2+at+the+blood-brain+barrier:+relevance+for+multiple+sclerosis+pathogenesis.">Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis.</a> Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).</li></ol>

Demonstrou-se que a microglia eo MDM têm diferentes funções e fenótipos no SNC e, portanto, a identificação e análise dessas subpopulações de macrófagos são essenciais para melhor compreender as doenças neurológicas 9 , 18 , 25 . A análise de citometria de fluxo usando dois marcadores (CD11b e CD45) permite a distinção entre cada subpopulação ( Figura 3C ). Esta estratégia foi an...

A microglia são os macrófagos residuais do tecido parenquimatoso do sistema nervoso central (SNC). Eles desempenham dois principais papéis funcionais: defesa imune e manutenção da homeostase do SNC. Em contraste com o MDM, que são renovados continuamente a partir das células estaminais hematopoiéticas na medula óssea, as células microgliais se diferenciam das células progenitoras hematopoiéticas primitivas originadas no saco vitelino (YS) que colonizaram o cérebro durante o desenvolvimento embrionário 1 , 2 , 3 . Em roedores, o fator de transcrição Myb desempenha um papel crucial no desenvolvimento de todos os monócitos e macrófagos derivados da medula óssea, mas para a microglia derivada de YS, esse fator é dispensável e a diferenciação continua dependente do fator de transcrição PU.1 4 . No SNC saudável, a microglia é uma célula dinâmica que provoca constantemente o seu ambiente, a scaLevantamento e levantamento de patógenos invasores ou danos nos tecidos 5 . A detecção de tais sinais inicia um caminho para resolver a lesão. A microglia passa rapidamente de uma morfologia ramificada a uma amebaide, que é seguida de fagocitose e liberação de vários mediadores, como citoquinas pró ou anti-inflamatórias. Assim, dependendo do seu microambiente, a microglia ativada pode adquirir um espectro de estados de iniciação distintos 6 . A microglia afeta profundamente o desenvolvimento e a progressão de muitos distúrbios neurológicos. Nos modelos de roedores da doença de Alzheimer (AD) 7 , esclerose lateral amiotrófica (ALS) 8 , esclerose múltipla (MS) 9 ou doença de Parkinson (PD) 10 , a microglia mostra um duplo papel, induzindo neurotoxicidade prejudicial ou agindo De forma neuroprotetiva, dependente deN a doença específica, o estágio da doença e se a doença foi influenciada pelo compartimento imune sistêmico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . A maioria das lesões do SNC observadas nas doenças citadas acima contém uma população heterogênea de células mieloides, incluindo não apenas microglia parenquimatosa, mas também macrófagos perivasculares e meníngeos, bem como MDM infiltrante do SNC. Estes tipos de células podem contribuir diferencialmente para os mecanismos fisiopatológicos relacionados à lesão e reparação 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . O desafio atual para os investigadores que estão estudando esses modelos de doenças é estabelecer se os monócitos periféricos e os macrófagos se infiltram no SNC e, em caso afirmativo, distriamChateie a microglia residente dessas células. Na verdade, as células microgliais são muito plásticas; Quando são ativados, os marcadores de re-expressões de microglia geralmente são expressos por monócitos e macrófagos periféricos. A questão, portanto, se baseia na identificação de marcadores que podem distinguir a microglia residente dos monócitos e macrófagos infiltrantes. A discriminação dessas populações em fatias cerebrais por aplicações imuno-histológicas é limitada devido à falta de anticorpos específicos. No entanto, a análise de citometria de fluxo é uma técnica eficiente para avaliar a expressão de vários marcadores e para distinguir as populações celulares (por exemplo, linfócitos, macrófagos / MDM CD11b + CD45 alto e microglia CD11b + CD45 med ), bem como subpopulações celulares 16 , 17 , 18 . Este protocolo descreve os procedimentos para isolar oCélulas mononucleares do SNC de ratinho em modelos de doenças neurológicas usando uma dissociação de tecido enzimático otimizado e uma centrifugação com gradiente de densidade; Bem como, um método para diferenciar as populações de microglia e MDM no SNC usando citometria de fluxo. Outra abordagem é eliminar a mielina e purificar as células usando esferas magnéticas conjugadas com anticorpos específicos 19 , 20 , 21 . A remoção de mielina usando esferas magnéticas anti-mielina é mais dispendiosa e afeta a viabilidade e o rendimento de células isoladas 22 . Este passo e a seguinte separação imunomagnética da microglia, limitam estudos adicionais de populações específicas de células imunes 21 , 22 . Esses procedimentos fornecem uma maneira fácil de estudar as subpopulações dos macrófagos no desenvolvimento da doença ePara determinar os efeitos de medicamentos ou modificações de genes em fenótipos de macrófagos e estados de ativação.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="908">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">5-month-old Mice</td>
			<td style="width:223px;">Janvier</td>
			<td style="width:119px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liberase TL Research Grade</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">5401020001</td>
			<td>Digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Percoll</td>
			<td style="width:223px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01&#160;</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Cell Strainer size 70 &#181;m Nylon</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">731751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Venofix 25G</td>
			<td style="width:223px;">BRAUN</td>
			<td style="width:119px;">4056370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Piston syringe 10 mL</td>
			<td style="width:223px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS+10ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Pasteur pipette 230 mm</td>
			<td style="width:223px;">Dustcher</td>
			<td style="width:119px;">20420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,5 mL&#160; tube</td>
			<td style="width:223px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">15 mL&#160; tube</td>
			<td style="width:223px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">50 mL&#160; tube</td>
			<td style="width:223px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td style="width:223px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">EDTA</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Bovine Serum Albumin solution 30%</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Paraformaldehyde 32% Solution</td>
			<td style="width:223px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15714-S</td>
			<td>Caution -Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Saponin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70)</td>
			<td style="width:223px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">45-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5</td>
			<td style="width:223px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">45-4031&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">563890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">BV421 Rat IgG2b, &#954; Isotype Control RUO</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3)</td>
			<td style="width:223px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Anti-Mouse CD16/CD32 Purified</td>
			<td style="width:223px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">14-0161</td>
			<td>Mouse Fc Block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fixable Dead Cell Stain Kits</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L34969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">FAB5538A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">IC013A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">FAB5825P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Goat IgG PE-conjugated Antibody</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">IC108P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:223px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Cell analyzer</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BD FACSVERSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Data Analysis Software</td>
			<td style="width:223px;">FlowJo LLC</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mayo Scissors</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14010-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry

Numerosos estudos demonstraram o papel das células imunes, em particular dos macrófagos, nas patologias do sistema nervoso central (SNC). Existem duas populações principais de macrófagos no SNC: (i) a microglia, que são os macrófagos residentes do SNC e são derivadas de progenitores do saco vitelino durante a embriogênese, e (ii) os macrófagos derivados de monócitos (MDM), que podem infiltrar-se O SNC durante a doença e são derivados de progenitores da medula óssea. Os papéis de cada subpopulação de macrófagos diferem dependendo da patologia em estudo. Além disso, não há consenso sobre os marcadores histológicos ou os critérios distintivos utilizados para essas subpopulações de macrófagos. No entanto, a análise dos perfis de expressão dos marcadores CD11b e CD45 por citometria de fluxo nos permite distinguir a microglia (CD11b + CD45 med ) do MDM (CD11b + CD45 alta ). Neste protocolo, mostramos que a centrifugação com gradiente de densidadeE a análise de citometria de fluxo pode ser usada para caracterizar essas subpopulações de macrófagos do SNC e para estudar vários marcadores de interesse expressados ​​por essas células como publicamos recentemente. Assim, esta técnica pode aprofundar a nossa compreensão do papel dos macrófagos em modelos de ratos de doenças neurológicas e também pode ser usada para avaliar os efeitos de drogas nessas células.

Após a centrifugação em gradiente de densidade e coloração de anticorpos, as células foram adquiridas em um citómetro de fluxo e analisadas utilizando uma estratégia de bloqueio morfológico como se segue. Um primeiro portão foi definido no quadro de pontos Forward-Scattered-Area (FSC-A) versus Forward-Scattered-Height (FSC-H) para discriminar células individuais de dupletos ( Figura 3A ). As células únicas foram então fechadas em FSC-A...

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Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Este protocolo fornece uma análise das subpopulações de macrófagos no sistema nervoso central do mouse adulto por citometria de fluxo e é útil para o estudo de marcadores múltiplos expressos por essas células.

Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia cultura do Sistema Nervoso Central Neonatal e Adulto

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Imunologia e Infecção

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

Cultura de macrófagos macrófagos Colony estimulante fator diferenciado Humano monócitos derivados

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Caracterização de derivados de monócitos células dendríticas humanas por imagem Citometria de Fluxo: Uma Comparação entre dois protocolos de isolamento de monócitos

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Caracterização fenotípica dos macrófagos a partir de rim de rato por Citometria de Fluxo

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Análise qualitativa e quantitativa de sinapse imunológica no sistema humano usando a imagem latente de citometria de fluxo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Isolamento, caracterização e purificação dos macrófagos dos tecidos afetados pela inflamação obesidade

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolamento e cultura In Vitro de macrófagos alveolares murino e humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Análise Citométrica de Fluxo de Infiltração linfócito no Sistema Nervoso Central durante Encefalomielite Autoimune Experimental

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

Isolando Tecidos do Sistema Nervoso Central e Meninges Associadas para Análise a Jusante de Células Imunes

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...