Name: analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry
Uploaded: 2017-06-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Agencia Nacional para la Investigación (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer y Bpifrance. Nuestro laboratorio cuenta también con el apoyo del Inserm, el CNRS, la Universidad Pierre et Marie-Curie y el programa &quot;Investissements d&#39;avenir&quot; ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Quisiéramos agradecer la ayuda del centro de cultivo celular CELIS.

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Instituto ICM y por el Comité de Ética Animal de Darwin y están cubiertos por el protocolo 01407.02. 1. Preparación <ol><li> Preparar el cóctel de digestión en un tubo de 1,5 ml combinando lo siguiente para cada ratón: 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS); 123 mu l de enzima de digestión (ver tabla de materiales) a 13 wunsch / mL (solución madre), ...

<ol>
	<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages.">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li><li>Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+differentiation+of+microglia.">Origin and differentiation of microglia.</a> Front Cell Neurosci. 7, 45 (2013).</li><li>Ginhoux, F., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+and+macrophages:+developmental+pathways+and+tissue+homeostasis.">Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis.</a> Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).</li><li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells.">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li><li>London, A., Cohen, M., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+monocyte-derived+macrophages:+functionally+distinct+populations+that+act+in+concert+in+CNS+plasticity+and+repair.">Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair.</a> Front Cell Neurosci. 7, 34 (2013).</li><li>Miron, V. E., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+CNS+remyelination.">Macrophages and CNS remyelination.</a> J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).</li><li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+non-redundant+roles+of+microglia+and+myeloid+subsets+in+mouse+models+of+Alzheimer's+disease.">Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).</li><li>Boillee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+and+progression+in+inherited+ALS+determined+by+motor+neurons+and+microglia.">Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia.</a> Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).</li><li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system.">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li><li>Wu, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blockade+of+microglial+activation+is+neuroprotective+in+the+1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine+mouse+model+of+Parkinson+disease.">Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).</li><li>Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+microglia+in+human+disease:+therapeutic+tool+or+target?.">The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target?.</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).</li><li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infiltrating+monocytes+trigger+EAE+progression,+but+do+not+contribute+to+the+resident+microglia+pool.">Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool.</a> Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).</li><li>Funk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+peripheral+hematopoietic+stem+cells+and+monocytes+in+Parkinson's+disease.">Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease.</a> Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).</li><li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+inflammatory+monocytes+with+a+unique+microRNA+gene+signature+ameliorates+murine+ALS.">Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).</li><li>Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow-derived+cells+in+the+central+nervous+system+of+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+are+associated+with+blood+vessels+and+express+CX(3)CR1.">Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1.</a> Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).</li><li>Sedgwick, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system.">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).</li><li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4++T+cells+compared.">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).</li><li>Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+inflammatory+phenotypes+of+microglia+and+monocyte-derived+macrophages+in+Alzheimer's+disease+models:+effects+of+aging+and+amyloid+pathology.">Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology.</a> Aging Cell. , (2016).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li><li>Jin, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+glutamine+transporter+SNAT1+in+Rett+syndrome+microglia:+a+mechanism+for+mitochondrial+dysfunction+and+neurotoxicity.">Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity.</a> J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).</li><li>Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomagnetic+enrichment+and+flow+cytometric+characterization+of+mouse+microglia.">Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia.</a> J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> J Neuroinflammation. 9, 147 (2012).</li><li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractalkine+receptor+but+not+CCR2+is+present+on+microglia+from+embryonic+development+throughout+adulthood.">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).</li><li>Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cytofluorometric+method+for+the+simultaneous+detection+of+both+intracellular+and+surface+antigens+of+apoptotic+peripheral+lymphocytes.">A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).</li><li>Richter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioma-associated+microglia+and+macrophages/monocytes+display+distinct+electrophysiological+properties+and+do+not+communicate+via+gap+junctions.">Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions.</a> Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).</li><li>Mahad, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+CCR2+and+CCL2+at+the+blood-brain+barrier:+relevance+for+multiple+sclerosis+pathogenesis.">Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis.</a> Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).</li></ol>

Se ha demostrado que la microglia y el MDM tienen funciones y fenotipos diferentes en el SNC, por lo que la identificación y el análisis de estas subpoblaciones de macrófagos son esenciales para comprender mejor las enfermedades neurológicas 9 , 18 , 25 . El análisis de citometría de flujo utilizando dos marcadores (CD11b y CD45) permite distinguir entre cada subpoblación ( Figura 3C ). Esta...

Los microglios son los macrófagos residentes en el tejido parenquimatoso del sistema nervioso central (SNC). Ellos juegan dos funciones funcionales clave: la defensa inmune y el mantenimiento de la homeostasis del SNC. En contraste con el MDM, que se renuevan continuamente de las células madre hematopoyéticas en la médula ósea, las células microgliales se diferencian de las células progenitoras hematopoyéticas primitivas originadas en el saco vitelino (YS) que colonizaron el cerebro durante el desarrollo embrionario 1 , 2 , 3 . En los roedores, el factor de transcripción Myb desempeña un papel crucial en el desarrollo de todos los monocitos y macrófagos derivados de la médula ósea, pero para la microglia derivada de YS, este factor es dispensable y la diferenciación sigue dependiendo del factor de transcripción PU.1 4 . En el SNC sano, microglia son células dinámicas que constantemente muestrean su ambiente, scaY detección de patógenos invasores o daño tisular 5 . La detección de tales señales inicia un camino para resolver la lesión. La microglia cambia rápidamente de una morfología ramificada a una ameboidea, seguida de fagocitosis y liberación de diversos mediadores, tales como citoquinas pro- o antiinflamatorias. Así, dependiendo de su microambiente, microglia activado puede adquirir un espectro de diferentes estados de cebado [ 6] . La microglia afecta profundamente el desarrollo y progresión de muchos trastornos neurológicos. En los modelos de roedores de la enfermedad de Alzheimer (EA) 7 , la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) 8 , la esclerosis múltiple (EM) 9 o la enfermedad de Parkinson (PD) 10 , se demuestra que la microglia desempeña un doble papel, induciendo neurotoxicidad perjudicial o actuando De una manera neuroprotectora, que depende deN la enfermedad específica, la etapa de la enfermedad y si la enfermedad estaba influenciada por el compartimento inmunológico sistémico 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . La mayoría de las lesiones del SNC observadas en las enfermedades citadas anteriormente contienen una población heterogénea de células mieloides, incluyendo no sólo microglia parenquimatosa, sino también macrófagos perivasculares y meníngeos, así como MDM infiltrante al SNC. Estos tipos de células pueden contribuir de forma diferencial a los mecanismos fisiopatológicos relacionados con la lesión y la reparación 7 , 12 , 13 , 14 , 15 . El desafío actual para los investigadores que estudian estos modelos de enfermedad es establecer si los monocitos periféricos y los macrófagos se infiltran en el SNC y, en caso afirmativo, distAngustia la microglia residente de estas células. De hecho, las células microgliales son muy plásticas; Cuando se activan, las microglias vuelven a expresar los marcadores que suelen expresarse por monocitos periféricos y macrófagos. La cuestión, por lo tanto, se basa en la identificación de marcadores que pueden distinguir la microglia residente de los monocitos infiltrados y macrófagos. La discriminación de estas poblaciones sobre rodajas de cerebro por aplicaciones inmunohistológicas es limitada debido a la falta de anticuerpos específicos. Sin embargo, el análisis de citometría de flujo es una técnica eficiente para evaluar la expresión de varios marcadores y para distinguir las poblaciones celulares (por ejemplo, linfocitos, macrófagos MDM CD11b + CD45 alto y microglia CD11b + CD45 med ), así como las subpoblaciones celulares 16 , 17 , 18 . Este protocolo describe los procedimientos para aislar elCélulas mononucleares del SNC de ratón en modelos de enfermedad neurológica utilizando una disociación enzimática optimizada de tejido y una centrifugación de gradiente de densidad; Así como un método para diferenciar las poblaciones de microglia y MDM en el SNC mediante citometría de flujo. Otra aproximación es eliminar la mielina y purificar las células usando perlas magnéticas conjugadas con anticuerpos específicos 19 , 20 , 21 . La eliminación de mielina utilizando perlas magnéticas anti-mielina es más caro y afecta a la viabilidad y el rendimiento de las células aisladas [ 22] . Esta etapa y la siguiente separación inmunomagnética de la microglia, limitan los estudios adicionales de las poblaciones específicas de células inmunes 21 , 22 . Estos procedimientos proporcionan una manera fácil de estudiar las subpoblaciones de macrófagos en el desarrollo de la enfermedad, yPara determinar los efectos de los fármacos o modificaciones genéticas en fenotipos de macrófagos y estados de activación.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="908">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">5-month-old Mice</td>
			<td style="width:223px;">Janvier</td>
			<td style="width:119px;">C57BL/6J</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Liberase TL Research Grade</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">5401020001</td>
			<td>Digestion enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Percoll</td>
			<td style="width:223px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">17-0891-01&#160;</td>
			<td>Density gradient medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Cell Strainer size 70 &#181;m Nylon</td>
			<td style="width:223px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">731751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Venofix 25G</td>
			<td style="width:223px;">BRAUN</td>
			<td style="width:119px;">4056370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Piston syringe 10 mL</td>
			<td style="width:223px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">SS+10ES1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Pasteur pipette 230 mm</td>
			<td style="width:223px;">Dustcher</td>
			<td style="width:119px;">20420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">1,5 mL&#160; tube</td>
			<td style="width:223px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">0030 123.328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">15 mL&#160; tube</td>
			<td style="width:223px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">50 mL&#160; tube</td>
			<td style="width:223px;">TPP</td>
			<td style="width:119px;">91050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">5 mL polystyrene round bottom tube</td>
			<td style="width:223px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">D-PBS (1X) without Ca2+/Mg2+</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">D-PBS (10X) without Ca2+/Mg2+</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">EDTA</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Bovine Serum Albumin solution 30%</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Paraformaldehyde 32% Solution</td>
			<td style="width:223px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">15714-S</td>
			<td>Caution -Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Saponin</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:223px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">PerCPCy5.5 Rat anti-mouse CD11b (clone M1/70)</td>
			<td style="width:223px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">45-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rat IgG2b K Isotype Control PerCP-Cyanine5.5</td>
			<td style="width:223px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">45-4031&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">BV421 Rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">563890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">BV421 Rat IgG2b, &#954; Isotype Control RUO</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">562603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rabbit anti-mouse TMEM119 (clone28-3)</td>
			<td style="width:223px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab209064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A31573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Anti-Mouse CD16/CD32 Purified</td>
			<td style="width:223px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">14-0161</td>
			<td>Mouse Fc Block</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fixable Dead Cell Stain Kits</td>
			<td style="width:223px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L34969</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse CCR2 APC-conjugated Antibody</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">FAB5538A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Rat IgG2B APC-conjugated Isotype Control</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">IC013A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mouse CX3CR1 PE-conjugated Antibody</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">FAB5825P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Goat IgG PE-conjugated Antibody</td>
			<td style="width:223px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:119px;">IC108P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:223px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5804R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Cell analyzer</td>
			<td style="width:223px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">BD FACSVERSE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Data Analysis Software</td>
			<td style="width:223px;">FlowJo LLC</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Fine scissors</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14090-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Standard Pattern Forceps</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11000-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Mayo Scissors</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">14010-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:399px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:223px;">F.S.T</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry

Numerosos estudios han demostrado el papel de las células inmunitarias, en particular los macrófagos, en las patologías del sistema nervioso central (SNC). Existen dos poblaciones principales de macrófagos en el SNC: (i) la microglia, que son los macrófagos residentes del SNC y se derivan de progenitores del saco vitelino durante la embriogénesis, y (ii) los macrófagos derivados de monocitos (MDM), que pueden infiltrarse El SNC durante la enfermedad y se derivan de progenitores de médula ósea. Los roles de cada subpoblación de macrófagos difieren dependiendo de la patología que se estudia. Además, no hay consenso sobre los marcadores histológicos o los criterios distintivos utilizados para estas subpoblaciones de macrófagos. Sin embargo, el análisis de los perfiles de expresión de los marcadores CD11b y CD45 mediante citometría de flujo nos permite distinguir la microglia (CD11b + CD45 med ) del MDM (CD11b + CD45 alto ). En este protocolo, mostramos que la centrifugación de gradiente de densidadY el análisis de citometría de flujo se puede utilizar para caracterizar estas subpoblaciones de macrófagos del SNC, y para estudiar varios marcadores de interés expresados ​​por estas células como hemos publicado recientemente. Por lo tanto, esta técnica puede ampliar nuestra comprensión de la función de los macrófagos en ratones modelos de enfermedades neurológicas y también se puede utilizar para evaluar los efectos de los medicamentos sobre estas células.

Después de la centrifugación de gradiente de densidad y tinción de anticuerpos, las células se adquirieron en un citómetro de flujo y se analizaron usando una estrategia de bloqueo morfológico como sigue. Se definió una primera puerta en la zona de dispersión hacia delante (FSC-A) de trama de puntos frente a la altura dispersada hacia delante (FSC-H) para discriminar células individuales de dobletes ( figura 3A ). Las células individuales ...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry at JoVE.com

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Este protocolo proporciona un análisis de las subpoblaciones de macrófagos en el sistema nervioso central del ratón adulto mediante citometría de flujo y es útil para el estudio de múltiples marcadores expresados ​​por estas células.

Análisis de microglia y macrófagos derivados de monocitos del sistema nervioso central por citometría de flujo

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System

Microglia cultivo del Sistema Nervioso Central Neonatal y Adultos

Microglia are the resident macrophage-like cells of the central nervous system (CNS) and, as such, have critically important roles in physiological and ...

Investigación

Inmunología e Infección

Culture of Macrophage Colony-stimulating Factor Differentiated Human Monocyte-derived Macrophages

La cultura de los macrófagos derivados de monocitos-macrófagos factor estimulante de colonia humana diferenciada

A protocol is presented for cell culture of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) differentiated human monocyte-derived macrophages. For initiation ...

Characterization of Human Monocyte-derived Dendritic Cells by Imaging Flow Cytometry: A Comparison between Two Monocyte Isolation Protocols

Caracterización de las células dendríticas derivadas de monocitos humanos mediante imágenes de Citometría de Flujo: una comparación entre dos protocolos de aislamiento de monocitos

Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

Caracterización fenotípica de los macrófagos a partir de riñón de rata por Citometría de Flujo

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

Análisis cualitativo y cuantitativo de la sinapsis inmune en el sistema humano utilizando imágenes de citometría de flujo

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

Aislamiento, caracterización y purificación de los macrófagos de los tejidos afectados por la inflamación relacionados con la obesidad

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Aislamiento y cultivo In Vitro de los macrófagos alveolares murinos y humanos

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Caracterización de subconjuntos de monocitos humanos de sangre análisis de citometría de flujo

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Análisis citométrico de flujo de infiltración de linfocitos en el sistema nervioso central durante la encefalomielitis autoinmune experimental

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

Aislamiento de tejidos del sistema nervioso central y meninges asociadas para el análisis posterior de las células inmunitarias

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...