Name: isolation of primary murine retinal ganglion cells (rgcs) by flow cytometry
Uploaded: 2017-07-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا السيد تيم هيغينز، كبير المصورين من قسم علم الأحياء الدقيقة والمناعة والكيمياء الحيوية، للمساعدة التقنية الفيديوية؛ الدكتور ماثيو و. ويلسون للمناقشات وأعضاء مختبرات جابلونسكي ومورالس-تيرادو على تعليقاتهم المفيدة. وأيد هذا العمل من قبل معهد أبحاث ألكون جائزة المحقق الشاب (فمم-T)، ومؤسسة أبحاث جامعة تينيسي (فمم-T)، والمعهد الوطني للعيون EY021200 (مج)، زمالة جيروين (فمم-T). وزمالة جيروين قبل الدكتوراه (زكغ)، وإدارة البحوث الطبية وقيادة العتاد التابعة لوزارة الدفاع (فمم-T)، والمنحة غير المقيدة من البحوث لمنع العمى.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المفصلة في البروتوكول التالي من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (إاكوك) مجلس مراجعة في جامعة تينيسي مركز العلوم الصحية (وثسك) واتبع جمعية للبحوث في الرؤية وعيون العيون (أرفو) بيانات للاستخدام من الحيوانات في بحوث العيون والرؤية...

<ol>
	<li>Flammer, J., Orgul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+blood-flow+abnormalities+in+glaucoma.">Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).</li><li>Bathija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+blood+flow+in+glaucoma.">Optic nerve blood flow in glaucoma.</a> Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).</li><li>Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypothesis+to+explain+ganglion+cell+death+caused+by+vascular+insults+at+the+optic+nerve+head:+possible+implication+for+the+treatment+of+glaucoma.">A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma.</a> Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).</li><li>Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulation+and+axonal+transport+in+the+optic+nerve.">Circulation and axonal transport in the optic nerve.</a> Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).</li><li>Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+excitatory+and+inhibitory+spontaneous+synaptic+activity+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).</li><li>Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases+of+the+retina+and+potential+for+protection+and+recovery.">Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery.</a> Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).</li><li>Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology,+number,+distribution+and+central+projections+of+Class+I+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+hooded+rats.">The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats.</a> Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).</li><li>Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+environmental+control+of+variation+in+retinal+ganglion+cell+number+in+mice.">Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice.</a> J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).</li><li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina.">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li><li>Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-synuclein+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells.">Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells.</a> Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).</li><li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells:+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas.">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li><li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+protein+with+multiple+splicing:+a+new+marker+for+retinal+ganglion+cells.">RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li><li>Van Bergen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recharacterization+of+the+RGC-5+retinal+ganglion+cell+line.">Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).</li><li>Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+differentiation+protocols+for+RGC-5+cells.">A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).</li><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).</li><li>Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+retinal+ganglion+cells+using+immunopanning-magnetic+separation.">Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation.</a> Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).</li><li>Julius, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensitivity+of+exponentials+and+other+curves+to+their+parameters.">The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters.</a> Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).</li><li>Reif, A. E., Allen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Akr+Thymic+Antigen+and+Its+Distribution+in+Leukemias+and+Nervous+Tissues.">The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues.</a> J Exp Med. 120, 413-433 (1964).</li><li>Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional,+cellular,+and+subcellular+distribution+of+Thy-1+antigen+in+rat+nervous+tissues.">Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues.</a> Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).</li><li>Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1:+more+than+a+mouse+pan-T+cell+marker.">Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker.</a> J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).</li><li>Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+murine+endothelial+cell+cultures+by+flow+cytometry+using+fluorescein-labeled+griffonia+simplicifolia+agglutinin.">Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin.</a> Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).</li><li>Shoge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+retinal+ganglion+cells+culture+enriched+with+the+magnetic+cell+sorter.">Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter.</a> Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).</li><li>Chintalapudi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Molecular+Profiling+of+Primary+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells:+Comparison+of+Phenotypes+from+Healthy+and+Glaucomatous+Retinas.">Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas.</a> Front Aging Neurosci. 8, 93 (2016).</li><li>Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+different+doses+of+ketamine+on+intraocular+pressure+in+anesthetized+children.">The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children.</a> J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).</li><li>Ding, C., Wang, P., Tian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+general+anesthetics+on+IOP+in+elevated+IOP+mouse+model.">Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model.</a> Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+reproducible+and+straightforward+method+to+perform+in+vivo+ocular+enucleation+in+the+mouse+after+eye+opening.">A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening.</a> J Vis Exp. (92), e51936 (2014).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+AP-2delta+reduces+retinal+ganglion+cell+numbers+and+axonal+projections+to+the+superior+colliculus.">Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus.</a> Mol Brain. 9 (1), 62 (2016).</li><li>Moshiri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+complete+loss+of+retinal+ganglion+cells+in+the+math5/brn3b+double+knockout+elicits+severe+reductions+of+other+cell+types+during+retinal+development.">Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development.</a> Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).</li><li>Danias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+retinal+ganglion+cell+(RGC)+loss+in+aging+DBA/2NNia+glaucomatous+mice:+comparison+with+RGC+loss+in+aging+C57/BL6+mice.">Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).</li><li>Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD15+immunoreactive+amacrine+cells+in+the+mouse+retina.">CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).</li><li>Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+localization+of+the+HNK-1+carbohydrate+epitope+to+glial+and+neuronal+cells+of+the+human+retina.">Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).</li><li>Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+endothelium+to+Ulex+europaeus+I-coated+Dynabeads:+application+to+the+isolation+of+microvascular+endothelium.">Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium.</a> J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).</li><li>Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+retinal+ganglion+cells+from+postnatal+rats+by+magnetic+cell+sorting.">Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting.</a> MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).</li><li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Displaced+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+pigmented+rats.">Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats.</a> Front Neuroanat. 8, 99 (2014).</li><li>Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+methods+to+trace+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold:+from+the+intact+optic+nerve+or+by+stereotactic+injection+into+the+optic+tract.">Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract.</a> Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).</li><li>Barnstable, C. J., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1+antigen:+a+ganglion+cell+specific+marker+in+rodent+retina.">Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina.</a> Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+by+application+of+fluoro-gold+on+the+surface+of+superior+colliculus.">Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li></ol>

فاكس هو الأسلوب المفضل لتنقية السكان الخلية. وتشمل طرق العزل الأخرى إمونوبانينغ، الخرز المغناطيسي، واستكمال تثبيت نضوب. وتستند ميزة فاكس على هذه المنهجيات الأخرى إلى التحديد المتزامن لعلامات سطح الخلية بدرجات متفاوتة من الشدة. كثافة الفلورسنت من جزيء يتناسب مع كمي...

رغس هي متباينة الخلايا العصبية متباينة، وبالتالي، مطلوب الخلايا الأولية للتجريب. تطوير بروتوكول لعزل وإثراء خلايا العقدة الشبكية الفئران الأولية (رغس) أمر أساسي للكشف عن آليات الصحة رجك وانحطاط في المختبر . وهذا مهم بشكل خاص للدراسات التي تسعى إلى توليد العلاجات المحتملة لتعزيز وظيفة رجك وتقليل وفاتها. ويرتبط انحطاط رغس مع الأمراض التنكسية في شبكية العين، مثل الجلوكوما، واعتلال الشبكية السكري، والشيخوخة الطبيعية. على الرغم من أن الآليات الخلوية محددة الكامنة وراء فقدان رجك غير واضحة، تم تحديد سلسلة من عوامل الخطر. عدم وجود الأوكسجين في الرأس العصب البصري 1 ، 2 ، 3 يسبب رغك الموت 4 ويعمل بمثابة اضطراب التوازن بين تفعيل إثارة و iمستقبلات المهبل داخل رغس الفردية 5 ، 6 . وهناك سلسلة من التحديات تعرقل التقدم نحو استخدام هذه الخلايا لإجراء دراسات متعمقة. أولا، عدد رغس الموجودة في شبكية العين الفئران هو صغير. رغس تمثل أقل من 1٪ من مجموع خلايا الشبكية 7 ، 8 ، 9 . ثانيا، معظم علامات رجك محددة هي البروتينات داخل الخلايا 10 ، 11 ، 12 . اختيار على أساس هذه علامات يترك الخلايا غير قابلة للحياة، مما يحول دون التحليلات الوظيفية المصب. وأخيرا، والبروتوكولات المتاحة حاليا هي طويلة ونقص التوحيد 13 ، 14 . واستندت بروتوكولات العزلة رجك في وقت مبكر على أساليب إمونوبانينغ. باريز وآخرون. 15 تكييفها إمونوب الكلاسيكيةأنينينغ تقنية وأضافت الخطوة الثانية، التي تستبعد الخلايا الأحادية والخلايا البطانية من الجزء الأكبر من خلايا الشبكية قبل اختيار إيجابي على أساس إمونوبوسيتيفيتي لمستضد التوتية المضادة للثيمية (ويعرف أيضا باسم Thy1)، علامة سطح الخلية. بعد سنوات، هونغ وآخرون. جنبا إلى جنب تقنيات العزلة حبة المغناطيسي مع استراتيجيات فرز الخلايا لعزل رغس مع أعلى النقاء 16 . لا يزال استخدام الخرز المغناطيسي المستخدمة في العديد من التطبيقات العلمية. معا، وحبات المغناطيسي والبروتوكولات التدفق الخلوي تحسين نقاء الخلايا المعزولة. ومع ذلك، فإن هذه النظم تنقية لم يتم بعد موحدة لعزل رغس الفئران من الشبكية فصلها. التدفق الخلوي هو وسيلة تحليلية قوية يقيس الخصائص البصرية والمضان من تعليق الخلية. يتم تحليل الخلايا على حد سواء كميا ونوعيا مع مستوى عال من الحساسية، وتوفير تحليل متعدد الأبعاد للخلية بوبولأوجه. ويستند التمييز الخلوي على اثنين من الخصائص الفيزيائية الرئيسية: حجم الخلية أو مساحة السطح والتفاصيل أو التعقيد الداخلي 17 . ويمكن إجراء تحليل متعدد الأبعاد من خلال الجمع بين الأجسام المضادة الموسومة مع فلوروكروميس التي لها موجات الإثارة مماثلة وانبعاثات مختلفة. التدفق الخلوي سريع، استنساخه، وحساسة. يسمح ليزر مولتيتب حتى أكبر تحليلات متعددة الأبعاد من خلايا واحدة عن طريق التدفق الخلوي. وبالتالي، فإنه هو منهجية جذابة لدراسة العينات الخلوية. مضان تنشيط الخلايا الفرز (فاكس) يستخدم الاختلافات المظهري متعدد الأبعاد التي حددتها التدفق الخلوي لفرز الخلايا الفردية في مجموعات سكانية متميزة. في العقد الماضي، تم تحديد العديد من البروتينات السطحية وداخل الخلايا على أنها المؤشرات الحيوية المحتملة لاختيار الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية. الدراسات الأولية التي سعت لعزل رغس من الفئران تستخدم Thy1 كما سل العقدةل ماركر. لسوء الحظ، Thy1، ويعرف أيضا باسم CD90، لديها الأشكال الإسوية متعددة في أنواع القوارض الأخرى 18 و 19 و 20 ويعبر عنها أنواع الخلايا الشبكية متعددة 19 ، 20 ، مما يجعلها علامة غير محددة ل رغس. تم العثور على علامة سطح أخرى، CD48، على السكان أحادي في شبكية العين، بما في ذلك الضامة والخلايا الدبقية الصغيرة. باستخدام هذين السطحين علامات، تعديل رجك التوقيع Thy1 + و CD48 خلايا نيغ -وضعت 15 ، 16 ، 21 ، 22 . ولسوء الحظ، فإن هذين المعيارين من معايير الاختيار غير كافيين لاختيار مجموعة سكانية عالية التخصيب. لمعالجة هذه الاحتياجات غير الملباة، تم تطوير بروتوكول التدفق الخلوي 23 على أساس متعدد الطبقات معايير الاختيار الإيجابية والسلبية وسينغ المعروفة علامات سطح الخلية لإثراء وتنقية رغس الفئران الأولية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD15 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>125606</td>
			<td>Clone MC-480</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD48 PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103424</td>
			<td>Clone HM48-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD57</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6680-100TST</td>
			<td>Clone VC1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90.2 AF700</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105320</td>
			<td>Clone 30-H12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405317</td>
			<td>Clone Poly4053</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td>FcgRII/III block, Clone 93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>Live cell/ Dead cell discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>U.S. origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10497</td>
			<td>Multi-species Ig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Add serum to media prior to culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>Saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ-PT Model</td>
			<td>Stereo Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ST 16R</td>
			<td>All centrifugation performed&#160; at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base Plate &#8211; Dissection Pan</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB15233FIM</td>
			<td>A wax plate can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>5002-7</td>
			<td>4 &#189; inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, Straight</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>1360</td>
			<td>5 &#189; inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352097</td>
			<td>Polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>Polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352003</td>
			<td>Polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm dishes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP93040</td>
			<td>Tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>70ICS</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>40ICS</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;BD 10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>301604</td>
			<td>Disposable Syringe without needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PEST</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>986734</td>
			<td>No Liner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30 G needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>305128</td>
			<td>1 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267151B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Trypan blue 0.4% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Viability Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-402-25</td>
			<td>1.5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Floid Cell Imaging</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>447113</td>
			<td>Fluorescence Imaging with a 20x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-452</td>
			<td>Used to make 70% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014282</td>
			<td>LTS Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td>LTS Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td>LTS Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack LTS 1000 mL &#8211; GPS-L1000S</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005088</td>
			<td>Blue Rack Sterile Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack LTS 250 mL &#8211; GPS-L250S</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005092</td>
			<td>Green Rack Sterile Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack LTS 20 mL &#8211; GPS-L10S</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005090</td>
			<td>Red Rack Sterile Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR II Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abca8a</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00462440_m1</td>
			<td>M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldh1al</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00657317_m1</td>
			<td>M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqp4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00802131_m1</td>
			<td>Astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calb2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00801461_m1</td>
			<td>Amacrine, Horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cd68</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm03047340_m1</td>
			<td>Retinal Pigment Epithelial Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gad2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00484623_m1</td>
			<td>Amacrine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hprt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm01545399_m1</td>
			<td>House keeping gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lhx1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm01297482_m1</td>
			<td>Horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lim2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00624623_m1</td>
			<td>Horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00476550_m1</td>
			<td>Photoreceptors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ntrk1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm01219406_m1</td>
			<td>Horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pcp4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00500973_m1</td>
			<td>Bipolar, Amacrine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pou4f1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm02343791_m1</td>
			<td>Retinal Ganglion Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prdx6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00725435_s1</td>
			<td>Astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prkca</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00440858_m1</td>
			<td>Bipolar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00435969_m1</td>
			<td>Horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pvalb</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00443100_m1</td>
			<td>Amacrine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rbpms</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm02343791_m1</td>
			<td>Retinal Ganglion Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rom1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00436364_g1</td>
			<td>Photoreceptors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rpe65</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00504133_m1</td>
			<td>Retinal Pigment Epithelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slc1a3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00600697_m1</td>
			<td>Astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slc6a9</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00433662_m1</td>
			<td>Amacrine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sncg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00488345_m1</td>
			<td>Retinal Ganglion Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubb3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00727586_s1</td>
			<td>Retinal Ganglion Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vim</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm01333430_m1</td>
			<td>M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Universal Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4440047</td>
			<td>qPCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11754250</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman PreAmp Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4391128</td>
			<td>Pre-Amplification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/ Cytoperm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/ Permeabilization Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/ Wash</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554723</td>
			<td>Permeabilization Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBPMS</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-86815</td>
			<td>intracellular antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNCG</td>
			<td>Gene Tex</td>
			<td>GTX110483</td>
			<td>intracellular antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRN3A</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8429</td>
			<td>intracellular antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801202</td>
			<td>intracellular antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine retinal ganglion cells (rgcs) by flow cytometry

وغالبا ما يكون للأمراض العصبية تأثير مدمر على المتضررين. تتورط خسارة خلية العقدة الشبكية (رجك) في مجموعة من الأمراض، بما في ذلك اعتلال الشبكية السكري والزرق، بالإضافة إلى الشيخوخة الطبيعية. على الرغم من أهميتها، كانت رغس صعبة للغاية لدراسة حتى الآن ويرجع ذلك جزئيا إلى أنها لا تشكل سوى نسبة صغيرة من مجموعة واسعة من الخلايا في شبكية العين. وبالإضافة إلى ذلك، أساليب العزل الحالية تستخدم علامات داخل الخلايا لتحديد رغس، التي تنتج خلايا غير قابلة للحياة. وتشمل هذه التقنيات أيضا بروتوكولات عزل طويلة، لذلك هناك عدم وجود أساليب عملية، موحدة، ويمكن الاعتماد عليها للحصول على وعزل رغس. يصف هذا العمل طريقة فعالة وشاملة وموثوق بها لعزل رغس الأولية من الشبكية الفئران باستخدام بروتوكول على أساس كل من معايير الاختيار الإيجابية والسلبية. الطرق المعروضة تسمح للدراسة المستقبلية لل رغس، بهدف فهم أفضل الرئيسيانخفاض في حدة البصر التي تنتج عن فقدان رغس وظيفية في الأمراض العصبية.

<html> وتعرقل الدراسة المتعمقة للمجموعات رغس عوامل كثيرة، منها انخفاض تواترها وعدم وجود منهجية قوية وموحدة لعزلها. ويبين الشكل 1 المنهجية المستخدمة لعزل الشبكية. الاختلافات في إجراء استئصال موجودة على أساس نوع التحليل، مثل إذا كان است...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry at JoVE.com

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

يعاني الملايين من الناس من أمراض تنكسية في شبكية العين تؤدي إلى عمى لا رجعة فيه. وهناك عنصر شائع في العديد من هذه الأمراض هو فقدان خلايا العقدة الشبكية (رغس). يصف هذا البروتوكول تفصيلا عزل رغس الفئران الأولية عن طريق اختيار الإيجابية والسلبية مع التدفق الخلوي.

عزل الخلايا العقدة الشبكية الفئران الأولية (رغس) عن طريق التدفق الخلوي

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

موازية لوحة الدائرة التدفق المستمر وحلبة لتقييم تدفق الخلايا الاصلية تحت تدفق رقائقي غشائي إجهاد القص

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

تحليل التطبع الخلوي من الجزيئات الدقيقة والبكتيريا التي متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

تقييم توصيل الجينات البوليمرية الجسيمات النانوية من تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر وعالية الإنتاجية قياس التدفق الخلوي

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

واسعة المجال المجهري نيون نيون قياس التدفق الخلوي والتصوير على الهاتف الخلوي

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

توطين والكمي النسبية من أنابيب الكربون النانوية في الخلايا مع متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

عزل خلايا ورم القولون الإنسان الأساسية من الأنسجة الجراحية وزراعة بشكل مباشر على لينة مرنة ركائز للالجر الخلوي

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

كشف حساسية Proteopathic البذر آخر مع الحنق التدفق الخلوي

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

ميكروفلويديك تدفق الدوائر عن طريق الدم تم اعادة تشكيل لنموذج الإرقاء وصفائح الدم نقل<em&gt; في المختبر</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

للدائرة نموذج ميكروفلويديك تدفق لصفائح الدم نقل والإرقاء يقيس ترسب الصفائح الدموية والليفين تشكيل في الوقت الحقيقي

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...