Name: isolation of primary murine retinal ganglion cells (rgcs) by flow cytometry
Uploaded: 2017-07-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry at JoVE.com

著者はテクニカルビデオアシスタンスのための免疫学および生化学の微生物学部門のシニアイラストレーター、ティムヒギンズ氏に感謝したい。 Matthew W. Wilson博士とJablonskiとMorales-Tiradoラボのメンバーの皆さんにお話を伺いました。この研究は、アルコン研究所の若手研究者賞（VMM-T）、テネシー大学研究財団（VMM-T）、国立眼科研究所EY021200（MMJ）、ゲーウィンフェローシップ（VMM-T） Gerwin Pre-doctoral Fellowship（ZKG）、国防総省陸軍医学研究院（VMM-T）、および無防備失調症研究のための無制限助成金などが含まれます。

以下のプロトコールに詳述されている全ての手順は、テネシー州保健科学センター（UTHSC）の機関動物管理および使用委員会（IACUC）の審査委員会によって承認され、使用のためのビジョンアンド眼科研究協会（ARVO）実験動物実験のガイドラインに加えて、眼科および視覚研究における動物の研究（実験動物学研究所、人間のケアと実験動物の使用に関する公衆衛生サービス政策）。 <p cla...

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	<li>Flammer, J., Orgul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+blood-flow+abnormalities+in+glaucoma.">Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).</li><li>Bathija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optic+nerve+blood+flow+in+glaucoma.">Optic nerve blood flow in glaucoma.</a> Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).</li><li>Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hypothesis+to+explain+ganglion+cell+death+caused+by+vascular+insults+at+the+optic+nerve+head:+possible+implication+for+the+treatment+of+glaucoma.">A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma.</a> Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).</li><li>Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulation+and+axonal+transport+in+the+optic+nerve.">Circulation and axonal transport in the optic nerve.</a> Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).</li><li>Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+excitatory+and+inhibitory+spontaneous+synaptic+activity+in+mouse+retinal+ganglion+cells.">Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).</li><li>Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurodegenerative+diseases+of+the+retina+and+potential+for+protection+and+recovery.">Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery.</a> Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).</li><li>Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology,+number,+distribution+and+central+projections+of+Class+I+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+hooded+rats.">The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats.</a> Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).</li><li>Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+environmental+control+of+variation+in+retinal+ganglion+cell+number+in+mice.">Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice.</a> J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).</li><li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells:+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas.">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li><li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+protein+with+multiple+splicing:+a+new+marker+for+retinal+ganglion+cells.">RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li><li>Van Bergen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recharacterization+of+the+RGC-5+retinal+ganglion+cell+line.">Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).</li><li>Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+differentiation+protocols+for+RGC-5+cells.">A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).</li><li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological,+morphological,+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning.">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).</li><li>Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+primary+mouse+retinal+ganglion+cells+using+immunopanning-magnetic+separation.">Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation.</a> Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).</li><li>Julius, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensitivity+of+exponentials+and+other+curves+to+their+parameters.">The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters.</a> Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).</li><li>Reif, A. E., Allen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Akr+Thymic+Antigen+and+Its+Distribution+in+Leukemias+and+Nervous+Tissues.">The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues.</a> J Exp Med. 120, 413-433 (1964).</li><li>Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional,+cellular,+and+subcellular+distribution+of+Thy-1+antigen+in+rat+nervous+tissues.">Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues.</a> Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).</li><li>Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1:+more+than+a+mouse+pan-T+cell+marker.">Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker.</a> J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).</li><li>Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+murine+endothelial+cell+cultures+by+flow+cytometry+using+fluorescein-labeled+griffonia+simplicifolia+agglutinin.">Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin.</a> Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).</li><li>Shoge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+retinal+ganglion+cells+culture+enriched+with+the+magnetic+cell+sorter.">Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter.</a> Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).</li><li>Chintalapudi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Molecular+Profiling+of+Primary+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells:+Comparison+of+Phenotypes+from+Healthy+and+Glaucomatous+Retinas.">Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas.</a> Front Aging Neurosci. 8, 93 (2016).</li><li>Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+different+doses+of+ketamine+on+intraocular+pressure+in+anesthetized+children.">The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children.</a> J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).</li><li>Ding, C., Wang, P., Tian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+general+anesthetics+on+IOP+in+elevated+IOP+mouse+model.">Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model.</a> Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).</li><li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C(T)+method.">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li><li>Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+reproducible+and+straightforward+method+to+perform+in+vivo+ocular+enucleation+in+the+mouse+after+eye+opening.">A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening.</a> J Vis Exp. (92), e51936 (2014).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+AP-2delta+reduces+retinal+ganglion+cell+numbers+and+axonal+projections+to+the+superior+colliculus.">Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus.</a> Mol Brain. 9 (1), 62 (2016).</li><li>Moshiri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Near+complete+loss+of+retinal+ganglion+cells+in+the+math5/brn3b+double+knockout+elicits+severe+reductions+of+other+cell+types+during+retinal+development.">Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development.</a> Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).</li><li>Danias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+retinal+ganglion+cell+(RGC)+loss+in+aging+DBA/2NNia+glaucomatous+mice:+comparison+with+RGC+loss+in+aging+C57/BL6+mice.">Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).</li><li>Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD15+immunoreactive+amacrine+cells+in+the+mouse+retina.">CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).</li><li>Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+localization+of+the+HNK-1+carbohydrate+epitope+to+glial+and+neuronal+cells+of+the+human+retina.">Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).</li><li>Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+human+endothelium+to+Ulex+europaeus+I-coated+Dynabeads:+application+to+the+isolation+of+microvascular+endothelium.">Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium.</a> J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).</li><li>Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+retinal+ganglion+cells+from+postnatal+rats+by+magnetic+cell+sorting.">Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting.</a> MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).</li><li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Displaced+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+pigmented+rats.">Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats.</a> Front Neuroanat. 8, 99 (2014).</li><li>Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+methods+to+trace+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold:+from+the+intact+optic+nerve+or+by+stereotactic+injection+into+the+optic+tract.">Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract.</a> Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).</li><li>Barnstable, C. J., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thy-1+antigen:+a+ganglion+cell+specific+marker+in+rodent+retina.">Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina.</a> Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+by+application+of+fluoro-gold+on+the+surface+of+superior+colliculus.">Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li></ol>

FACSは、細胞集団を精製するために選択される技術である。他の単離方法には、免疫パンニング、磁気ビーズ、および補体固定枯渇が含まれる。これらの他の方法に対するFACSの利点は、様々な程度の強度を有する細胞表面マーカーの同時同定に基づく。分子の蛍光強度はタンパク質発現量に比例する。今まで、RGCの単離は、使用した単離方法にかかわらず、 Thy1（CD90）陽性およびCD48?...

RGCは最終的に分化したニューロンであるため、実験には一次細胞が必要である。原発性ネズミ網膜神経節細胞（RGC）の単離および濃縮のためのプロトコールの開発は、 インビトロでのRGCの健康および変性の機序を明らかにする上で基本的なものである。これは、RGC機能を促進し、その死を最小限に抑えるための潜在的な治療法を生み出そうとする研究にとって特に重要です。 RGCの変性は、緑内障、糖尿病性網膜症および正常な老化などの網膜変性疾患に関連する。 RGC喪失の根底にある特定の細胞機構は不明であるが、一連の危険因子が同定されている。視神経乳頭1、2、3での酸素供給の欠如は、 RGC死を引き起こし、興奮性物質とiの活性化との間のホメオスタシスの障害として作用する個々のRGC内の阻害性受容体5,6 。一連の課題は、詳細な研究のためにこれらの細胞の使用への進展を妨げる。第1に、ネズミ網膜に存在するRGCの数は少ない。 RGCは全網膜細胞の7 ％ 、 8,9 ％未満を占める。第二に、ほとんどのRGC特異的マーカーは細胞内タンパク質10,11,12である。これらのマーカーに基づく選択は、細胞を生存不能にし、下流の機能的分析を排除する。最後に、現在利用可能なプロトコルは長く、標準化が不十分である 13,14 。初期のRGC単離プロトコールはイムノパニング法に基づいていた。 Barres et al。 15 古典的なイムノープを適応させた細胞表面マーカーである抗胸腺細胞抗原（別名Thy1）に対する免疫陽性に基づくポジティブ選択の前に網膜細胞の大部分から単球および内皮細胞を除外した第2段階を加えた。数年後、香港らは、純度の高いRGCを分離するためのセルソーティング戦略と組み合わせた磁気ビーズ分離技術16磁気ビーズの使用は、多くの科学的用途において依然として使用されている。一緒に、磁気ビーズおよびフローサイトメトリープロトコルは、単離された細胞の純度を改善した。しかし、これらの精製システムは、解離した網膜からのネズミRGCの単離のためにまだ標準化されていない。 フローサイトメトリーは、細胞懸濁液の光学特性および蛍光特性を測定する強力な分析方法です。細胞を高レベルの感度で定量的および定性的に分析して、細胞集団の多次元分析を提供するation。細胞の識別は、細胞の大きさまたは表面積、粒状性または内部の複雑さの2つの主要な物理的特性に基づいています。類似の励起波長および異なる放出を有する蛍光色素で標識された抗体を組み合わせることによって、多次元分析を行うことができる。フローサイトメトリーは、迅速で、再現性があり、感度が高い。マルチタイプレーザーは、フローサイトメトリーによる単一細胞のより大きな多次元分析を可能にする。したがって、それは細胞学的標本の研究のための魅力的な方法論である。蛍光活性化細胞選別（FACS）は、フローサイトメトリーによって同定された多次元表現型の差異を用いて、個々の細胞を異なる亜集団に分類する。 過去10年間に、複数の表面タンパク質および細胞内タンパク質が、ニューロンを含む細胞の選択のための潜在的なバイオマーカーとして同定されている。ラットからRGCを単離することを試みた最初の研究は、Th1を神経節細胞として使用したlマーカー。残念ながら、Thy1、 別名 CD90は、他のげっ歯類種18,19,20に複数のアイソフォームを有し、RGCの非特異的マーカーとなる複数の網膜細胞タイプ19,20によって発現される。別の表面マーカー、CD48は、マクロファージおよびミクログリアを含む網膜の単球集団に見出される。これらの2つの表面マーカーを用いて、改変RGCシグネチャー-Thy1 +およびCD48ネガティブ細胞が開発された（15,16,21,22）。残念なことに、これらの2つの選択基準は、高度に濃縮されたRGC集団を選択するのに十分ではない。この満たされていないニーズに対処するために、フローサイトメトリープロトコルが、多層陽性選択基準および陰性選択基準に基づいて開発された一次ネズミRGCを富化および精製するための既知の細胞表面マーカーを提供する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD15 PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>125606</td>
			<td>Clone MC-480</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD48 PE-Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103424</td>
			<td>Clone HM48-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD57</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C6680-100TST</td>
			<td>Clone VC1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD90.2 AF700</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105320</td>
			<td>Clone 30-H12</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>405317</td>
			<td>Clone Poly4053</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Anti-mouse CD16/32</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101302</td>
			<td>FcgRII/III block, Clone 93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423102</td>
			<td>Live cell/ Dead cell discrimination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td>U.S. origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AbC Total Antibody Compensation Bead Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10497</td>
			<td>Multi-species Ig</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103049</td>
			<td>Add serum to media prior to culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>Saline solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZ-PT Model</td>
			<td>Stereo Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ST 16R</td>
			<td>All centrifugation performed&#160; at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Base Plate &#8211; Dissection Pan</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SB15233FIM</td>
			<td>A wax plate can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>5002-7</td>
			<td>4 &#189; inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris Scissors, Straight</td>
			<td>Aesculap</td>
			<td>1360</td>
			<td>5 &#189; inches</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352097</td>
			<td>Polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL conical tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352098</td>
			<td>Polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS Tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>352003</td>
			<td>Polypropylene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 mm dishes</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>TP93040</td>
			<td>Tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>70ICS</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m nylon strainer</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>40ICS</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;BD 10 mL syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>301604</td>
			<td>Disposable Syringe without needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>PEST</td>
			<td>sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton Vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>986734</td>
			<td>No Liner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 30 G needle</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>305128</td>
			<td>1 inch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>0267151B</td>
			<td>Hemocytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Trypan blue 0.4% Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>Viability Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-402-25</td>
			<td>1.5mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS Floid Cell Imaging</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>447113</td>
			<td>Fluorescence Imaging with a 20x objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>04-355-452</td>
			<td>Used to make 70% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014282</td>
			<td>LTS Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014391</td>
			<td>LTS Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17014392</td>
			<td>LTS Pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack LTS 1000 mL &#8211; GPS-L1000S</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005088</td>
			<td>Blue Rack Sterile Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack LTS 250 mL &#8211; GPS-L250S</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005092</td>
			<td>Green Rack Sterile Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack LTS 20 mL &#8211; GPS-L10S</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>17005090</td>
			<td>Red Rack Sterile Tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria II Cell Sorter</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSR II Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abca8a</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00462440_m1</td>
			<td>M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aldh1al</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00657317_m1</td>
			<td>M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aqp4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00802131_m1</td>
			<td>Astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calb2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00801461_m1</td>
			<td>Amacrine, Horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cd68</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm03047340_m1</td>
			<td>Retinal Pigment Epithelial Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gad2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00484623_m1</td>
			<td>Amacrine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hprt</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm01545399_m1</td>
			<td>House keeping gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lhx1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm01297482_m1</td>
			<td>Horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lim2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00624623_m1</td>
			<td>Horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00476550_m1</td>
			<td>Photoreceptors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ntrk1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm01219406_m1</td>
			<td>Horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pcp4</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00500973_m1</td>
			<td>Bipolar, Amacrine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pou4f1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm02343791_m1</td>
			<td>Retinal Ganglion Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prdx6</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00725435_s1</td>
			<td>Astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prkca</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00440858_m1</td>
			<td>Bipolar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prox1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00435969_m1</td>
			<td>Horizontal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pvalb</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00443100_m1</td>
			<td>Amacrine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rbpms</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm02343791_m1</td>
			<td>Retinal Ganglion Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rom1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00436364_g1</td>
			<td>Photoreceptors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rpe65</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00504133_m1</td>
			<td>Retinal Pigment Epithelial cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slc1a3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00600697_m1</td>
			<td>Astrocytes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slc6a9</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00433662_m1</td>
			<td>Amacrine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sncg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00488345_m1</td>
			<td>Retinal Ganglion Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubb3</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm00727586_s1</td>
			<td>Retinal Ganglion Cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vim</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Mm01333430_m1</td>
			<td>M&#252;ller cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Universal Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4440047</td>
			<td>qPCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>RNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11754250</td>
			<td>cDNA synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman PreAmp Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4391128</td>
			<td>Pre-Amplification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Cytofix/ Cytoperm</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td>Fixation/ Permeabilization Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Perm/ Wash</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554723</td>
			<td>Permeabilization Solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBPMS</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-86815</td>
			<td>intracellular antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNCG</td>
			<td>Gene Tex</td>
			<td>GTX110483</td>
			<td>intracellular antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRN3A</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-8429</td>
			<td>intracellular antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TUJ1</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>801202</td>
			<td>intracellular antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of primary murine retinal ganglion cells (rgcs) by flow cytometry

神経変性疾患は、しばしば影響を受ける人々に壊滅的な影響を与える。網膜神経節細胞（RGC）の喪失は、正常な老化に加えて、糖尿病性網膜症および緑内障を含む一連の疾患に関係している。彼らの重要性にもかかわらず、RGCは網膜内の多種多様な細胞のわずかな割合しか占めないという事実のために今まで研究することは極めて困難であった。さらに、現在の単離方法は、細胞内マーカーを使用して、非生存細胞を産生するRGCを同定する。これらの手法には長時間の分離プロトコルも含まれるため、RGCを取得して分離するための実用的で標準化された信頼できる方法が欠けています。この研究は、ポジティブおよびネガティブ選択基準に基づくプロトコールを用いて、マウス網膜から一次RGCを単離するための、効率的で包括的で信頼できる方法を記載する。提示された方法は、RGCの将来の研究を可能にし、主要な神経変性疾患における機能性RGCの喪失に起因する視力の低下。

<html> RGCの徹底的な研究は、頻度が低く、分離のための堅牢で標準化された方法論の欠如を含む多くの要因によって妨げられています。 図1は、網膜の隔離のために使用される方法論を示す。除核処置のバリエーションは、除核が生体内実験の一部である場合など、分析のタイプに基づいて存在する（ 27） 。安楽死させた...

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Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells RGCs by Flow Cytometry

何百万人もの人々が不可逆的な失明をもたらす網膜変性疾患に苦しんでいます。これらの疾患の多くの共通要素は、網膜神経節細胞（RGC）の喪失である。この詳細なプロトコールは、フローサイトメトリーによる陽性および陰性選択による原発性ネズミRGCの単離を記載する。

フローサイトメトリーによる一次マウス網膜神経節細胞（RGCs）の単離

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

ナノ粒子トラッキング分析とハイスループットフローサイトメトリーによる高分子遺伝子デリバリーナノ粒子の評価

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Wide-field Fluorescent Microscopy and Fluorescent Imaging Flow Cytometry on a Cell-phone

携帯電話上の広視野蛍光顕微鏡と蛍光イメージングフローサイトメトリー

Fluorescent microscopy and flow cytometry are widely used tools in biomedical research and clinical diagnosis. However these devices are in general ...

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

外科的組織からの初代ヒト結腸腫瘍細胞の単離およびトラクションサイトメトリーのためのソフト弾性基板上にそれらを直接培養

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

FRETフローサイトメトリーでProteopathic播種活動の高感度検出

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...