Name: quantifying branching density in rat mammary gland whole-mounts using the sholl analysis method
Uploaded: 2017-07-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method at JoVE.com

Författarna skulle vilja bekräfta Dr. Michael Easterling (Social and Scientific Systems, Inc., Durham, NC) för hans hjälp med valideringen av denna metod och Dr. Tiago Ferreira (McGill University, Montreal, Quebec, Kanada) för hans kontinuerliga Hjälp med Sholl-ansökan.

All djuranvändning och förfaranden för denna studie godkändes av NIEHS Laboratory Animal Care and Use Committee och genomfördes i en Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care-ackrediterade anläggningar. 1. Excise Mammary Glands <ol><li> Förmarkera alla diabilder med hjälp av en xylentäker metod (penna fungerar bäst). Täck dem med monteringslösning i slutet för att bevara etiketten. </li><li> Euthanize djuret genom en godkänd metod för institution...

<ol>
	<li>Sholl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+organization+of+the+neurons+in+the+visual+and+motor+cortices+of+the+cat.">Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat.</a> J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).</li><li>Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+receptor+1A+modulates+actin+dynamics+and+restricts+dendritic+growth+in+hippocampal+neurons.">Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons.</a> Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).</li><li>Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+Sholl+analysis+to+quantify+changes+in+growth+and+development+in+rat+mammary+gland+whole+mounts.">Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts.</a> Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).</li><li>Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+Mammary+Gland+Morphology+and+Breast+Cancer+Risk+in+Rats.">Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats.</a> J. Vis. Exp. (44), e2260 (2010).</li><li>Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Mammary+Gland+Development+and+Function+in+Mouse+Models.">Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models.</a> J. Vis. Exp. (53), e2828 (2011).</li><li>ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ Available from: <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html</a> (2012)</li><li>Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+High-quality+Hematoxylin+and+Eosin-stained+Sections+from+Rodent+Mammary+Gland+Whole+Mounts+for+Histopathologic+Review.">Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review.</a> Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).</li><li>Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+abnormalities+in+the+rat+mammary+gland+following+gestational+and+lactational+exposure+to+2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin+(TCDD).">Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD).</a> Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).</li><li>Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+gland+ductal+hyperplasias+and+carcinoma+in+situ+following+fetal+bisphenol+A+exposure.">Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure.</a> Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).</li><li>Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+exposure+to+butyl+benzyl+phthalate+induces+modifications+in+the+morphology+and+the+gene+expression+profile+of+the+mammary+gland:+an+experimental+study+in+rats.">In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats.</a> Environ Health. 10 (1), 5 (2011).</li><li>Johnson, M. D., Mueller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+dimensional+multiphoton+imaging+of+fresh+and+whole+mount+developing+mouse+mammary+glands.">Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands.</a> BMC Cancer. 13, 373 (2013).</li><li>Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+gland+development+as+a+sensitive+end+point+after+acute+prenatal+exposure+to+an+atrazine+metabolite+mixture+in+female+Long-Evans+rats.">Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats.</a> Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).</li><li>Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+mammary+gland+development+in+female+Long+Evans+rats+following+in+utero+exposure+to+atrazine.">Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine.</a> Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).</li><li>Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+ethinyl+oestradiol+alters+mammary+gland+development+in+male+and+female+Wistar+rats.">Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats.</a> Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).</li></ol>

Från födsel till puberteten är bröstkörtel tillväxt allometrisk. Efter puberteten utvecklas bröstkörteln genom omfattande duktalförgrening och förlängning, som fortsätter tills bröstpiteln upptar hela fettkudden. Förgreningsegenskaper är en viktig aspekt av utvecklingen av bröstkörteln, och förmågan att objektivt kvantifiera dessa egenskaper kan vara mycket användbar för att bedöma normal bröstutveckling och för att identifiera onormal utveckling efter tidiga livsutsikter för toxiska toxicanter....

Mammarförgrening är en egenskap som vanligtvis bedöms som en indikator på körtelutveckling, men det är svårt att objektivt kvantifiera. 1953 beskrev Sholl 1 en metod för att mäta neuronal dendritisk arborisering i kattens visuella och motoriska cortices och en plugin för denna teknik utvecklades av Ferriera et al. 2 . Eftersom båda neuronerna och bröstkörtlarna uppvisar en liknande trädliknande struktur användes plugin för att kvantifiera bröst-epithelialförgreningsdensiteter i 2D-bilder av peripubertal-råtta-bröstkörteln. Peripubertalstadiet valdes för analys, eftersom avvänjning är ett livsstadium som ofta utvärderas i akademiska laboratorier och provrincipstudier. Sholl-analysen är ett plugin som distribueras med FIJI, vilket är bildkällan ImageJ med öppen källkod, med ytterligare plugins inkluderade. Pluggen skapar en serie koncentriska ringar som omger en predefInent-centret (typiskt soma av en neuron eller ursprunget till den primära kanalen hos en muggkörtel) och sträcker sig ut till den distala delen av föremålet (den inneslutande radien). Det räknar sedan antalet korsningar (N) som uppstår på var och en av ringarna. Pluggen returnerar också en Sholl-regressionskoefficient ( k ), som är en mätning av graden av förfall av epithelialförgrening. Med hjälp av ImageJ skapas en skelettiserad bild av ett bröstkörtel helmonterat och mageepitelområdet (MEA) mäts. Bilden analyseras med hjälp av Sholl analys plugin, och värden för N och k , bland andra värden som inte används här, returneras. Mammary epithelial branching density bestäms genom att beräkna N / MEA. I vilken utsträckning förgrening fortsätter i de yttre områdena av klyftepitelet är förgreningskomplexiteten och är en indikator på enhetlig distal epithelialväxt. Eftersom k är ett mått på den distala minskningen i epitElial branching, det är ett effektivt mått på förgreningskomplexiteten och en pålitlig indikator på bröstutveckling. Detta protokoll beskriver en datorassisterad metod för att skapa skelettbildade bilder av bröstkorgs helmounts och kvantitativt utvärderande bröstförgreningsegenskaper hos peripubertal han- och honrotter. Denna metod är relativt snabb och kräver inte användning av specialiserad mikroskopiutrustning. Utveckling och validering av denna metod beskrivs i Stanko et al. (2015) 3 . I denna rapport beskrivs också beredning av råttkörtelkirtlet hela = fästen. Liknande förfaranden för fullständig montering av bröst har beskrivits i de Assis et al. (2010) 4 och Plante et al. (2011) 5 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1069">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Dissecting board</td>
			<td style="width:161px;">NA</td>
			<td style="width:224px;">NA</td>
			<td style="width:439px;">A piece of styrofoam roughly 10&#34;x12&#34; is suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Dissecting T-Pins</td>
			<td>Daigger</td>
			<td style="width:224px;">EF7419A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Spray bottle with ethanol</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:224px;">NA</td>
			<td>70% ethanol is suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Curved dissecting scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:224px;">14569-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Straight dissecing scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:224px;">14568-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Curved forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td style="width:224px;">11003-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="160">
			<td height="160" style="height:160px;width:245px;">Superfrost Plus 24x75x1 mm microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4951PLUS-001</td>
			<td style="width:439px;">Thermo Scientific Superfrost Plus &#38; Colorfrost Plus slides hold tissue sections on permanently without the need for expensive coatings in IHC and Anatomical Pathology applications. This treatment reduces tissue loss during staining as well as hours of slide preparation. Slides electro-statically attract frozen tissue sections and cytology preparations and feature a chemistry similar to silane, although optimized to improve application performance. 
			https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Fisherfinest Premium Cover Glass 24x60x1 mm</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td style="width:224px;">12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td style="width:224px;">13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Ethanol absolute, &#8805;99.8% (GC)&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:224px;">24102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Xylene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>214736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Carmine alum&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum potassium sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A6435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Permount mounting media</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:224px;">SP15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Macroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Z16 APO&#160;</td>
			<td rowspan="3" style="width:439px;">This is the image capturing hardware and software used in this laboratory.&#160; As there are many different options, the methods and applications may vary between laboratories.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Digital camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td style="width:224px;">DFC295</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Camera software</td>
			<td>Leica</td>
			<td style="width:224px;">Leica Application Suite v3.1&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">ImageJ software</td>
			<td>Open source</td>
			<td>http://imagej.net/Welcome</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sholl analysis&#160;</td>
			<td>Open source</td>
			<td>http://imagej.net/Sholl_Analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying branching density in rat mammary gland whole-mounts using the sholl analysis method

Ett ökande antal studier använder sig av gnagarkörteln som en slutpunkt för att bedöma utvecklingstoxiciteten hos en kemisk exponering. Effekterna av dessa exponeringar har på utvecklingen av bröstkörteln utvärderas typiskt med antingen grundläggande dimensionella mätningar eller genom att poängtera morfologiska egenskaper. Det breda utbudet av metoder för tolkning av utvecklingsförändringar kan emellertid leda till inkonsekventa översättningar över laboratorier. En gemensam bedömningsmetod är nödvändig så att rätt tolkningar kan bildas av data som jämförs mellan studier. Den föreliggande studien beskriver tillämpningen av Sholl analysmetoden för att kvantifiera bröstkörtelförgreningsegenskaper. Sholl-metoden var ursprungligen utvecklad för användning vid kvantifiering av neuronala dendritiska mönster. Genom att använda ImageJ, ett mjukvarupaket med öppen källkodsanalys och ett plugin utvecklat för denna analys, bröstkörtelns förgreningstäthet och komplexiteten hosAmmary körtel från en peripubertal kvinnlig råtta bestämdes. Metoderna som beskrivs här gör det möjligt att använda Sholl-analysen som ett effektivt verktyg för att kvantifiera en viktig egenskap hos utvecklingen av bröstkörteln.

Värdena för den uppmätta slutna radien, MEA, N, k och beräknad förgreningstäthet för bröstkörteln analyserad i detta protokoll rapporteras i Tabell 1 . Sholl-analysen genererar linjära och semi-loggbilder av antalet korsningar vid varje radie ( Figur 9 ) och, om vald, en värmekarta över korsningarna ( Figur 10 ). Mindre utvecklade körtlar uppvisar färre korsningar inom samma MEA och har d?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method at JoVE.com

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

Utveckling av mamma-körteln i gnagaren har typiskt utvärderats med hjälp av beskrivande bedömningar eller genom mätning av grundläggande fysiska egenskaper. Förgreningstäthet är en indikator på bröstutveckling som är svår att kvantifiera objektivt. Detta protokoll beskriver en tillförlitlig metod för kvantitativ bedömning av förgreningsegenskaper hos bröstkörteln.

Kvantifiering av förgreningsdensitet i råtta Mammary Gland Whole-mounts med hjälp av Sholl analysmetoden

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

En metod för Lineage spårning av hornhinnan celler Använda Multi-färg Fluorescerande Reporter Möss

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Metoder för att undersöka lymfkörtel och hemocyter i<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

Rumsliga och tidsmässiga analys av aktiva ERK i<em&gt; C. elegans</em&gt; arvslinje

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC primärblottanalys som kvantifierar DNA-metyleringsnivån av kondrocyt-skillnad<em&gt; In Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Transfer of Mammary Gland-forming Ability Between Mammary Basal Epithelial Cells and Mammary Luminal Cells via Extracellular Vesicles/Exosomes

Överföring av magsjukdomskapande förmåga mellan mammalbasala epitelceller och mamma-luminala celler via extracellulära vesiklar / exosomer

Cells can communicate via exosomes, ~100-nm extracellular vesicles (EVs) that contain proteins, lipids, and nucleic acids. Non-adherent/mesenchymal ...

Analysis of Protein-protein Interactions and Co-localization Between Components of Gap, Tight, and Adherens Junctions in Murine Mammary Glands

Analys av protein-proteininteraktioner och samlokalisering mellan komponenter av gap-, täta och adherens-föreningar i murina mammalkörtlar

Cell-cell interactions play a pivotal role in preserving tissue integrity and the barrier between the different compartments of the mammary gland. These ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

En ny mammografisk feta padtransplantationsteknik för att visualisera fartygsgenerering av vaskulära endotelceller

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion och Immunofluorescerande färgning av svamp kropp och ljusmätare nervceller i vuxen Drosophila melanogaster hjärnor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...