Name: automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

مرفق تبلور لجنة نهر الميكونج-LMB يرجى دعم من مجلس البحوث الطبية (المملكة المتحدة). ونشكر أعضاء LMB لدعمهم: أولغا بيريسيتش (PNAC) وتوني وارن، والأنف والحنجرة فإن دن فوسينيتا وبات إدواردز (دراسات الهيكلية)، ستيف سكوتشير والأعضاء الآخرين في "ورشة ميكانيكية"، نيل المنح وجو وستمورلاند (بصرية)، بول هارت وتوم برات (IT). نود أيضا أن نشكر ستيف إليوت (تيكان، المملكة المتحدة) وستيوارت ميتشل وهيذر رينغروس (الروبوتات هاملتون، المملكة المتحدة)، وبول ذوبان الجليد، وروبرت لويس وجوبي جنكينز (TTP لابتيتش، المملكة المتحدة)، بول ريردون (AG سويسسي، سويسرا)، دونالد Ogg (الفابيوتيتش، وجورج ستيفنس المملكة المتحدة)، نيل وليامز (ماركيم إيماجي، المملكة المتحدة) وغراهام هاريس (الوكالة كليفلاند) للحصول على مساعدة تقنية.

1-اثنين مؤتمتة بالكامل نظم (الفحص الأولى)
<ol><li>
النظام 1: إعداد 72 تبلور 96-جيدا لوحات مليئة بفرز مجموعات (لوحات LMB)
	<ol>
<li>قبل تنفيذ هذا الإجراء، ضمان أن يتم تهيئة الروبوتات الخاصة بالنظام والبرامج الخاصة بهم المسيطر مفتوح. تشغيل المبردات لتبريد الأنبوب الناقل حوالي 30 دقيقة قبل أن يتم تشغيل البرنامج الرئيسي.</li>
		<li>ضع لوحة اختبار الناقل SBS يجهز من السدادة لوحة. تشغيل السدادة لوحة والتحقق من أن الفيلم يتم تطبيقها بشكل صحيح. كرر هذا الاختبار مرتين أكثر للتحقق من أن السدادة لوحة جاهزة.</li>
		<li>ثم إضافة 20 لتر مياه إلى الحاوية الرئيسية معالج السائل. قطع إدراجات اقتران الحاوية الصغيرة (20% إيثانول الشطف الحل) وتتصل إدراج الحاوية الرئيسية.</li>
		<li>أدخل اسم الشاشة المناسبة (الجدول 1) على لمس الطابعة النافثة للحبر. ثم فتح وإغلاق باب دائري لتحريك دوران دائري. فتح الباب عند المكدس الأولى يطرح نفسه.</li>
		<li>تحميل الكامل المكدس الأولى مع 22 تبلور لوحات، بعضها مع العمود 1 التي تواجه بها. تحميل الكامل مكدسات اثنين التالية بنفس الطريقة.</li>
		<li>تحميل لوحات 6 المتبقية في مناصب أعلى المكدس الرابعة. ثم، قم بإغلاق باب دائري.</li>
		<li>تحقق من أن عرض المبردات يشير إلى 14 درجة مئوية. بلطف وبشكل متكرر عكس مجموعات الفرز المحدد لمدة 1 دقيقة. ثم افتح اللوحة الأمامية لمعالج السائل.</li>
		<li>فتح الأنابيب ووضعها في الناقل التبريد وفقا لتخطيط 96-جيدا القياسية (A1، A2، إلخ.). عند وضع كل أنبوبة في الناقل، وضع لها غطاء على صينية في نفس التخطيط 96-جيدا.</li>
		<li>تدقيق الأنبوب المواقف والتأكد من أن جميع الأنابيب الصعيد واستقروا في الناقل. ثم أغلق اللوحة الأمامية.</li>
		<li>في إطار 'بدء التشغيل' من البرنامج معالج السائل، حدد 'تشغيل صيانة' وفتح برنامج التنظيف. قم بتشغيل برنامج لمسح الإيثانول 20% من النظام ويغسل السطح الخارجي لنصائح الاستغناء عن سائل.</li>
		<li>عند اكتمال المسح، انقر فوق 'إلغاء الأمر' للعودة إلى 'بدء التشغيل'. حدد 'تشغيل عملية القائمة' وانقر فوق 'ابدأ التحديد الخاص بك'. افتح برنامج 'لجنة نهر الميكونج الاستغناء عن مجموعة'. في '18' ملء الشاشة 'الحالات' في التكوين وتشغيل البرنامج.</li>
		<li>مراقب النظام كما وصفت اللوحات الأربع الأولى، شغل، ومختومة.</li>
		<li>مرة واحدة وقد أعدت جميع لوحات 72 ووضع مرة أخرى في دائري، التبديل إدراج اقتران من الحاوية الرئيسية إلى حاوية صغيرة. قم بتشغيل برنامج 'بدء تدفق' (راجع الخطوة 1.1.10).</li>
		<li>إيقاف تشغيل في المبردات وتجاهل إفراغ فرز أنابيب كيت. بعناية إزالة لوحات استعداد 72 من دائري. تجاهل لوحات مملوءة بشكل غير صحيح أو مختومة. تخزين لوحات جاهزة للاستخدام عند 10 درجة مئوية.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
نظام 2: إعداد قطرات تبلور (100 nL البروتين + 100 nL شرط) من عينة واحدة في لوحات LMB 20
	<ol>
<li>أولاً، ضمان الروبوتات للنظام في، يتم تهيئة موزع نانولتر البرمجيات المفتوحة، وأسلوب إدارة معالج السائل في مفتوح. تشغيل الناقل microtube والتبريد حوالي 15 دقيقة قبل أن يتم تشغيل البرنامج الرئيسي.</li>
		<li>ضع لوحة اختبار الناقل SBS يجهز من السدادة لوحة. تشغيل السدادة اللوحة، وتأكد من أن اللوحة مختومة بشكل صحيح. اختبار السدادة لوحة ثلاث مرات.</li>
		<li>ثم قم بتشغيل موزع نانولتر لتعيين 100-nL قطرات من اختبار حل في لوحة اختبار. الاختيار تحت مجهر أن القطرات تم تعيينها بشكل صحيح. قم بإغلاق البرنامج موزع نانولتر وإزالة الحظر قطاع-حامل من على سطح السفينة.</li>
		<li>المقبل، أدخل في حامل لوحة مصممة خصيصا (انظر نتائج الممثل: "تبلور الأجهزة المتقدمة" في LMB) لوحة LMB مع الكمية النسبية أعلى من الكواشف متقلبة في شروطه (الجدول 1). إزالة الفيلم لاصقة من اللوحة.</li>
		<li>افتح معالج السائل اللوحة الأمامية ووضع لوحة تفض على سطح السفينة، في الجزء الخلفي من أول ناقل انزلاق (انزلاق الناقلين قد سحب لسهولة الوصول إليها).</li>
		<li>وتغطي اللوحة مع غطاء ألومنيوم SBS. تسوية الغطاء نحو الركن الأيسر الخلفي من الناقل بتطبيق ضغط لطيف على الركن المقابل من الغطاء.</li>
		<li>فتح وتحميل الناقلين انزلاق، وتغطي لوحات 19 المتبقية بنفس الطريقة، يعمل من أكثر الأوضاع المتقلبة على الأقل. مجرد الناقل microtube والتبريد عند 4 درجة مئوية، كما يتبين من ضوء الأخضر، إزالة غلافه.</li>
		<li>قطع غطاء microtube التي تحتوي على ميليلتر (على الأقل) 440 من البروتين العينة (الجدول 2). ضمان أن العينة قد لا رغوة أعلاه غضروف، وهذا سوف تتداخل مع نظام كشف السائل. ضع الأنبوبة في 1 موقف الناقل microtube والتبريد.</li>
		<li>ضع لوحة بكر على سطح سائل معالج أمام نقل لوحة محول الناقل. ثم أغلق اللوحة الأمامية.</li>
		<li>بعد تحميل سطح السفينة، ضمان أن السفينة موزع نانولتر واضح كتلة قطاع-حامل وأن الناقلين في الجزء الخلفي من الكدسات نصيحة 50 ميليلتر واضحة من الأغطية SBS الألومنيوم.</li>
		<li>في سائل معالج واجهة '"أسلوب إدارة"'، وحدد 'إعداد لوحات'. رصد التهيئة لكلا النظامين، وملء في معلمات التشغيل. اتبع المبادئ التوجيهية "إدارة أسلوب" الواجهة (المطالبات والأرقام ونظام إدارة تلميح تعليمات بإعداد).</li>
		<li>التحقق من أن كافة المطلوبة مكونات مستعدون، ثم قم بتشغيل العملية.</li>
		<li>مراقبة النظام كما يعين الصيدلي نانولتر القطرات في اللوحة الأولى والأختام السدادة لوحة بعد اللوحة.</li>
		<li>متى أعدت مع قطرات تبلور جميع لوحات 20 وعاد تلقائياً إلى الناقلين انزلاق، فتح اللوحة الأمامية وإزالة اللوحات بلطف. تحقق من أن اللوحات مختومة بشكل صحيح قبل تخزينها للتبلور.</li>
		<li>تنظيف الأغطية SBS مع حل إيثانول 20% قبل التراص لهم على الجانب الأيسر من معالج السائل للتخزين. تجاهل لوحة بكر و microtube.</li>
		<li>إيقاف الناقل microtube والتبريد ومسح بعيداً من التكثيف. اترك منشفة ورقية فوق السطح برودة لاستيعاب مزيد من التكثيف. استبدال الغطاء الناقل ثم أغلق اللوحة الأمامية.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2-الاستغلال الأمثل للظروف
<ol><li>
معالج السائل على أساس حقنه: إنتاج التدرجات الخطية اثنين من تركيزات في الخزانات من صفيحة تبلور (الأسلوب 4-ركن).
	<ol>
<li>أولاً، ضمان على معالج السائل وتهيئة البرمجيات المفتوحة.</li>
		<li>في 'التدرج' التبويب: فتح البرنامج المطلوب، حدد نوع لوحة تبلور ووحدة التخزين النهائي في الخزانات المائية (الجدول 3). ينبغي خفض الإعداد المتقدمة من أجل 'ماكس المجلد النار' من 6000 إلى 3000 عند استخدام الحلول التي تحتوي على [كحولالايسوبروبيل] > 10% v/v و [MPD] > 20% v/ف.
</li>
		<li>التحضير الحقن. ضع مكبس في كل حقنه (ينتهي أشار إلى أسفل) وإدراج الجزء الخلفي المحاقن الأخاديد المعين تحت رأس الروبوت. تطور حقنه عقارب الساعة تأمينه في موقف (سيتم تشغيل البرنامج فقط مع جميع المحاقن المطلوبة مرفقة بشكل صحيح).</li>
		<li>إعداد في أحواض. إزالة الإطار الفولاذ المقاوم للصدأ، وإدراج في أحواض. وتتوافق مع مواقف 4 على اليسار زوايا 4 أ، ب، ج، "د التبديل" إلى التبويب '"إعداد"' الذي يعرض وحدات التخزين للحلول المطلوبة في كل حقنه (في الجدول 3، 0.5 مل حجم القتلى تمت إضافة إلى وحدات التخزين عرض). صب الحلول الزاوية في أحواض بها كل منهما ووضع الإطار مرة أخرى على سطح السفينة (الإطار يحمل في الموقف مع 2 مغناطيس صغيرة تقع في الجزء الأمامي السفينة). طريقة بديلة للمضي قدما في هذه الخطوة صب الحلول أحواض عند سبق وضعها على سطح السفينة-
</li>
		<li>ضع لوحة تبلور على الناقل SBS يجهز.</li>
		<li>انقر فوق 'نضح' والانتظار لهذه الخطوة أن يكتمل (عند توقف بيستونز في طريقهم حتى).</li>
		<li>قم بالتبديل إلى علامة التبويب 'تشغيل'، وتشغيل البرنامج.</li>
		<li>عند انتهاء البرنامج، العودة إلى علامة التبويب إعداد ثم انقر فوق 'إزالة': النظام التطهير الحقن من بقايا الحلول، وثم كل وسيلة يرفع بيستونز. يمكن طلب 'تطهير' بدلاً من 'إزالة'؛ وهذا سوف يغادر بيستونز في الموضع السفلي، استعداد لنضح حلول أكثر مع المحاقن نفسه.
</li>
		<li>إزالة المحاقن بالتواء لهم الفيلتر.</li>
		<li>تجاهل المحاقن وأحواض في بن المناسبة (أو شطف لهم مع المياه ومن ثم 20% v/v الإيثانول الحل لإعادة الاستخدام).</li>
		<li>ختم اللوحة ووضعه على خلاط ميكروسكوبية دقيقة 3 1,000 لفة في الدقيقة أو 10 دقيقة عند اختلاط الحلول عالية اللزوجة. اللوحة على استعداد لتشكيل قطرات تبلور على موزع نانولتر.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
مضافة فحص بروتوكول 1 (إعداد قطرات تبلور في صفيحة تبلور 96-جيدا قبل مليئة بالشاشة المضافة)
	<ol>
<li>أولاً، إعداد الشرط مع التركيزات المبدئية من الكواشف التي زادت بنسبة 10% (المجلد الحد الأدنى 15 مل عند نقل الشرط من حاوية على الشاشة المضافة مع معالج السائلة).</li>
		<li>التأكد من أن المعالج السائل على استعداد للعمل. افتح برنامج 'شاشة إضافة إلى المواد المضافة' لوحة واحدة (إدخال وحدة التخزين في المستودعات المائية: '72 ميليلتر'). يطالبك، الأرقام ومساعدة (12 × 1,000 ميليلتر نصائح اللازمة) نظام إدارة تلميح مع التأكد من الروبوت على استعداد للعمل وفقا للتحديدات.
</li>
		<li>استرداد الشاشة المضافة من الحاضنة-20 درجة مئوية وإزالة الختم الألومنيوم به فورا (استخدام حامل لوحة)، ثم ضع اللوحة على سطح السائل المعالج. البرنامج يعمل وفقا لتخطيط عمودي (يتم وضع اللوحة مع A1-الزاوية الموجود في الجزء الأيمن الأمامي من الناقل). كما وضع أيضا حاوية مليئة بالشرط. قم بتشغيل البرنامج.</li>
		<li>مرة واحدة قد ملئت خزانات اللوحة، وضعه على شاكر الميكروسكوبية وتشغيل البرنامج. شطف الحاوية للشرط مع الإيثانول منزوع الماء ونسبة 20% لإعادة استخدامها.</li>
		<li>
إعداد القطرات على موزع نانولتر. أولاً، فتح لوحة تبلور (استخدام حامل اللوحة). ثم، مكان اللوحة والبروتين 8-جيدا قطاع في المرتبة الأولى من كتلة قطاع-حامل. تعرض علامة التبويب 'الإعداد' على البرمجيات مراقبة المواقف الفعلية لكل مكون على سطح السفينة. تحميل كل جيدا للقطاع بعينه البروتين وفقا لحجم قطره المطلوبة (الجدول 4). قم بتشغيل برنامج إعداد قطرات.
</li>
		<li>عند انتهاء البرنامج، إزالة اللوحة من على سطح السفينة وختم ذلك فورا (استخدام لوحة السدادة، شريط لاصق عريضة 3 بوصة). تجاهل في القطاع في حاوية المناسبة.</li>
		<li>تقدير الحجم والشكل، وتوسيط من قطرات تحت المجهر قبل التخزين.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
مضافة فحص بروتوكول 2 (إعداد قطرات تبلور في صفيحة تبلور 96-جيدا مع شاشة مضافة القابلة لإعادة الاستخدام)
	<ol>
<li>أولاً، إعداد الشاشة المضافة: ترك لوحة الثقافة المجمدة 96-جيدا الخلية المقابلة لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. ثم الطرد المركزي الشاشة المضافة في 1,000 غ س ل 2 دقيقة.</li>
		<li>إعداد الشرط (المجلد الحد الأدنى 15 مل عند نقل الشرط من حاوية على الشاشة المضافة مع معالج السائلة).</li>
		<li>ملء الخزانات من صفيحة تبلور 96-جيدا مع الشرط. في معالج السائل، المضي قدما بنفس الطريقة كبروتوكول 1، الخطوة 2.2.2، ولكن إدخال '80 ميليلتر' لوحدة التخزين في المستودعات.</li>
		<li>إعداد القطرات على موزع نانولتر مع 3 عناصر على سطح السفينة (لوحة تحتوي على الشاشة المضافة، جنبا إلى جنب مع لوحة تبلور وقطاع البروتين 8-جيدا في المركز الأول من كتلة قطاع-حامل، الجدول 4).</li>
		<li>إغلاق لوحة الثقافة الخلية التي تحتوي على الشاشة مع ورقة ألومنيوم ووضعه مرة أخرى في الحاضنة-20 درجة مئوية.</li>
		<li>تقدير الحجم والشكل، وتوسيط من قطرات تحت المجهر قبل التخزين.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

نعلن بموجب هذا مصلحة تجارية متضاربة منذ ليفيارك تتاجر العناصر التالية: 96-و 48-البئر MRC اللوحات، ختم قطره معلقة MRC، شاشات تبلور MORPHEUS, Pi، انغستروم و LMB.

1-إعداد واستخدام شاشات الأولى المخزنة في لوحات
ينبغي أن تكون مختلطة فرز مجموعات قبل يجري الاستغناء عن إلى لوحات لفصل هطول الأمطار أو المرحلة الخفيفة يحدث في بعض الأنابيب أثناء التخزين. عند شاشة يتكون من اثنين من مجموعات (أنابيب 2 × 48)، يوضع في الأنبوب الأول من المجموعة الثانية في موقع E1 الناقل التبريد. عند شاشة تتألف من 4 مجموعات (أنابيب 4 × 24)، ويوضع في الأنبوب الأول من المجموعة الثانية في موقع C1 وتوضع الأنبوبة الأولى من المجموعة الثالثة في موقع E1 وتوضع الأنبوبة الأولى من المجموعة الرابعة في موقع G1. أثناء إدخال الأنابيب في الناقل التبريد، وأغطية توضع على صينية بعد تخطيط قياسي 96-جيدا المشهد. حيث ترد أعدادا جيدا على رأس الأغطية حسب الشركات المصنعة، وهذا يتيح التدقيق إذا وضعت جميع الأنابيب في الترتيب الصحيح. وهذا يساعد أيضا على استبدال الأغطية الصحيحة في الأنابيب عند ملء عدد مخفض من لوحات.
نقوم بتخزين لوحات معبأ مسبقاً في 10 درجة مئوية، إلى حل وسط لتجنب تجميد وتخزين عند 4 درجة مئوية التي قد تتسبب في تدهور الأوضاع والقضايا مع الختم. يتم تخزين لوحات لتصل إلى عدة أشهر مع عادة لا التكثيف ملحوظ على الوجه الداخلي للختم. وهذا صحيح أقل للوحات LMB05، LMB06، LMB09، و LMB10 كما تتضمن هذه الشروط مع تركيزات عالية نسبيا من الكواشف المتقلبة (الجدول 1). كمية صغيرة من التكثيف على الجانب الداخلي من الختم يقلل من كفاءة الختم، ويمكن أن يسبب التلوث المتبادل بين الآبار أثناء إعلان اللوحات. للمساعدة في منع التكثيف أثناء التبريد الأولية، يمكن نقل لوحات أولاً من دائري إلى نزهة معزول برودة التي يتم تخزينها في غرفة باردة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تبريد بطيئة جداً يقلل من وضع تدرجات حرارة داخل الآبار مختومة ومن ثم يقلل التكثيف الإجمالية15. وباﻹضافة إلى ذلك، حالما يتم تخزين اللوحات في الحاضنة 10 درجة مئوية، يوضع غطاء البوليستيرين SBS مخصصة داخلية على اللوحة في الجزء العلوي من كل مكدس (غير معروضة).
يمكن استخدام مجموعة كاملة من ألواح معبأ مسبقاً كشاشة أولية كبيرة ضد عينة بروتين رواية، للذوبان في الماء،. وبدلاً من ذلك، يمكن تحديد لوحات أقل بحيث تتطابق مع المتطلبات المحددة. على سبيل المثال، LMB15 و LMB19 هي الشاشات التي وضعت خصيصا لغشاء بروتين العينات26،27، أو LMB20 شاشة وضعت مع الذرات الثقيلة لتسهيل تجريبي على مراحل حيود البيانات28 (انظر أيضا : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">وضع الشاشات تبلور البروتينات MORPHEUS</a>).
2-إعداد قطرات تبلور
عند استخدام نظام 2، فحص مجموعات مع كميات كبيرة من الكواشف متقلبة ينبغي معالجتها أولاً. تجنب هذا التكثيف تشكيل على مطاط الأغطية SBS، التي يمكن أن تؤثر على التعامل مع غطاء وختم اللوحة. غطاء SBS قد قليلاً من إزالة الألغام عند أعلى لوحة، الذي السبب في أنها تحتاج إلى أن يكون الانحياز في البداية (انظر البروتوكول، خطوة 1.2.6). وحدات التخزين الميت البروتين في الآبار التي بليت PCR هي سخية نسبيا (ميليلتر 0.8، أسطورة انظر الجدول 2). لاحظ أن يعمل وحدات التخزين الميت سخية على قدم المساواة عند استخدام موزع نانولتر فردياً مع البروتين في شرائط 8-جيدا (الجدول 4). قد تعمل وحدات التخزين الميت أصغر، لكن بعض العينات التقيد بالنصائح، معايرة الروبوت قد يصبح غير دقيق بعض الشيء، قد تكون الغرفة أكثر دفئا من المعتاد، إلخ. كل ما يؤدي إلى خسائر العينة المشمولة بوحدات التخزين الميت السخية من أجل ترسيخ النهج.
التطورات الأخيرة مكنت زيادة تصغير تجارب و وبالتالي يمكن تخفيض حجم العينة المطلوبة لفحص ظروف تبلور إلى حد كبير بإدماج المقابلة التكنولوجيا29،30 . ومع ذلك، بعض الجوانب لمزيد من التصغير تحتاج إلى دراسة متأنية، مثل تبخر قطرات31 والتلاعب في ميكروكريستالس32.
وأخيراً، يمكن إدماج الطرد المركزي اللوحة (2,000 لفة في الدقيقة، 1 دقيقة) كخطوة أخيرة روتينية عند إعداد قطرات تبلور (في الآبار العلوي كروية). قد يقلل حجم وشكل قطرات الناتجة عن الطرد المركزي أكثر اتساقا إمكانية تكرار نتائج القضايا33،34. ومن المؤكد أن سيخفف قطرات متوسط تقييم لاحق لتجارب باستخدام مجهر البؤري المطلوب سوف تكون مماثلة عبر لوحة كاملة.
3-مزايا الأسلوب 4-الزاوية
أهم ميزة الأسلوب 4-ركن هو بساطته، الأمر الذي يقلل من الأخطاء ويسهل البروتوكولات الآلي مباشرة. على سبيل المثال، سيتم وضع الحلول الركن 4 دائماً على سطح سائل معالج بعد نفس التخطيط. أيضا، كافة البرامج على أساس نسب ثابتة بين الحلول (الشكل 3). إعداد دليل للحلول الركن 4 المفضل لمعالجة الآلي للحلول في التركيزات العالية التي يمكن أن تكون عالية اللزوجة. ثم سريعة ودقيقة نسبيا تطلع/الاستغناء عن الممكن في معظم أنواع معالجات سائلة مع الحد الأدنى من المتطلبات لتحسين الطبقات السائلة. ومع ذلك، قد تكون بعض الحلول ركن لزج جداً لروبوت العاملة مع نظام سائل تعمل بكفاءة. وهذا السبب اخترنا معالج سائلة العاملة مع الإزاحة الموجبة (الشكل 3B).
بالإضافة إلى التدرجات الخطية 2 تركيزات، يمكن اختبار مكون ثالث (أي، مجموعة من المخازن المؤقتة/المواد المضافة) بتركيز مستمر بطريقة مريحة. ولهذا الغرض، أعد كمية كبيرة نسبيا من مجموعة أساسية من زاوية الحلول بتركيز أعلى تأهيلاً مناسباً، باستثناء المكون لتكون متنوعة، أولاً. ثم، يتم إضافة الأسهم الحلول بما في ذلك هذا المكون لضبط تركيزات النهائي. على سبيل المثال، يتم إعداد 50 مل مجموعة من 4 ركن الحلول في تركيزات أعلى 10% من البداية. ثم يتم تقسيم هذه المجموعة الأساسية إلى 5 مجموعات فرعية أصغر من 4. أخيرا، يتم إضافة 10% في حجم الحموضة العازلة مختلف الحلول لكل مجموعة فرعية.
4-أشكال وأنواع من الشاشات المضافة
يتم عادة تخزين في-20 درجة مئوية (الشكل 4) نظراً لأنها لا تستخدم بانتظام على شاشات وتحتوي على المركبات المتطايرة/غير المستقرة. يجب أن يخطط له استخدام شاشة المضافة المجمدة مخزنة في كتلة عميق جيدا (1 مل في الآبار) مبكرا لأنه سوف يستغرق 12-24 ساعة لجميع الحلول المضافة ذوبان الجليد تماما في درجة حرارة الغرفة. أيضا، العديد من المستخدمين مشاركة نفس الشاشة المضافة، يحتمل أن يسبب مشاكل التلوث عبر. وأخيراً، ارتفاع كتل عميقة جيدا يجعلها غير مناسبة لمعظم نانولتر موزعات. كحل مناسب للالتفاف حول هذه القضايا، ينبغي نقل الشاشة من كتلة عميق جيدا إلى لوحات منخفضة المستوى (الشكل 4).
تاريخيا، كانت شاشات المضافة التي تشمل مجموعة متنوعة واسعة من الكواشف واحدة (مع تركيزات واحد) شعبية جداً35،36. ومع ذلك، تم وضع أنواع أخرى من شاشات المضافة التي تدمج يمزج المضافات37 أو تخفيض عدد المواد المضافة واحدة وجدت في تركيزات مختلفة38. وأخيراً، نهج تكميلي للتحقيق في تأثير المواد المضافة على العينات قبل تبلور39،40.
5-أكثر من الاعتبارات
الممارسة الجيدة: معظم الشاشات تحتوي على المواد الضارة أو السامة حتى و ومن ثم يجب أن تستخدم الحماية الشخصية المناسبة خلال البروتوكولات. على قدم المساواة، نقل أجزاء من الروبوتات قد يؤدي إلى وقوع إصابات، لا سيما عند محاولة التدخل يدوياً أثناء تشغيل برنامج (على الرغم من أن معظم الروبوتات بزر الإيقاف الطوارئ/نظام). بسبب التعقيدات التقنية المعنية، العادية التحقق من الروبوتات والشاشات والبرامج مع سابقا تتميز عينات اختبار هام لمستويات عالية مستديمة في إمكانية تكرار نتائج.
الإنتاجية: كمؤشر، بين 4,000 إلى 8,000 LMB لوحات يتم إنتاجها سنوياً مع نظام 1 (وتستخدمهم في وقت لاحق المستخدمين للفحص الأولى). هو لم تتكيف الأسهم كمية كبيرة من لوحات شغلها قبل الساعة 10 درجات مئوية عند الدوران المتوقع أقل بكثير، كبعد 4-5 أشهر، بعض الظروف سوف تبدأ في التدهور وتتبخر. تم تنفيذ نهوج مختلفة لبروتوكولات الأتمتة للمختبرات الصغيرة إلى المتوسطة الحجم41.
تخزين وتقييم تجارب: وبعد إعداد القطرات، يتم تخزين لوحات على الرفوف المنخفضة-الاهتزاز في غرفة في 4 أو 18 درجة مئوية مع درجة الحرارة التي تسيطر عليها أحكام (+/-0.5 درجة مئوية الحد الأقصى للانحراف). يتم تقييم تجارب باستخدام المجاهر مصدر الضوء الباردة. مختلف نظم التصوير الآلي متوفرة تجارياً، ولكن ينبغي النظر بعناية جميع جوانب: ستكون كافية لإنتاجية عالية السرعة المطلوبة لمسح لوحة؟ سوف تتداخل الكائنات عدا بلورات مع ضبط تلقائي للصورة؟ هل ستكون كافية لبقعة بلورات صغيرة جداً (لا سيما حول حافة القطرات) نوعية الصور الناتجة عن ذلك؟ 42 , 43 , 44
مقارنة بين تبلور الشروط: بعد تحقيقات دقيقة حول الطبيعة البلورات التي تم الحصول عليها في البداية، واحد تحليل الاتجاهات وأوجه التشابه عبر شروط استخدام <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB شاشة قاعدة البيانات</a> أو C6 <a href="http://c6.csiro.au/">أداة ويب</a>45.

يتم تطبيق علم البلورات بالأشعة السينية على نطاق واسع لزيادة تعزيز فهمنا للآليات البيولوجية والأمراض على المستوى الذري ومساعدة بعد ذلك النهج العقلاني ل اكتشاف المخدرات1. ولهذا الغرض، تنقية وعينات الجزيئات مركزة (2-50 مغ/مل) من البروتين والحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، وغيرها يغاندس وهذه المجمعات تجربته لميلها إلى نموذج أمر المشابك ثلاثية الأبعاد من خلال بلورة2،3 ،4. عندما يتم الحصول على بلورات ذات جودة عالية التي ديفراكت الأشعة السينية، يمكن حلها بنية بلورية في القرب من القرار الذري5،6. من الأهمية بمكان لا يمكن التنبؤ بالظروف المؤاتية لبلورة نموذج رواية وعائد بلورات ذات جودة عالية عادة ما تكون منخفضة جداً. هو أحد الأسباب الكامنة وراء أن العديد من عينات من الفائدة الخصائص البيوكيميائية صعبة، مما يجعلها غير مستقرة في مقياس الوقت المطابق لبلورة (عادة بضعة أيام). وأخيراً، تتفاقم العملية الوقت المطلوب لإنتاج عينات ونماذج المتغيرات، والأمثل على تنقية وبلورة7،8.
شرط بلورة حل مع مرسب الذي يقلل من قابلية الذوبان في العينة، وتحتوي على شروط غالباً أيضا المخازن المؤقتة والمواد المضافة. مئات من هذه الكواشف هي ملائمة تماما لتغيير معلمات التجارب تبلور لديهم ميل منخفضة لتتداخل مع سلامة العينة (مثل البروتين أو تتكشف الحمض النووي). في حين اختبار الملايين من مجموعات من الكواشف تبلور ليس ممكناً، اختبار عدة للعديد من مجموعات الفحص-صيغت مع مختلف الاستراتيجيات9،10 -ممكن مع المحاكمات المنمنمة والبروتوكولات الآلي. من هذا المنظور، الأسلوب الأكثر قابلية على الأرجح نشر بخار مع 100-200 nL قطرات يجلس على بئر صغيرة فوق خزان يحتوي على بلورة الشرط (25-250 ميليلتر)، نفذت في بلورة المتخصصة لوحات11 , 12-العينة البروتين والشرط غالباً ما يقترن بنسبة 1:1 لإجمالي حجم 200 nL عند إعداد القطرات في العلوي-الآبار. تبلور البروتينات نانولتر الروبوتية يمكن تنفيذها بتقنيات بديلة ولوحات مثل دفعة النفط وكيل13 و المرحلة مكعب Lipidic14 (آخر واحد يجري تطبيقها على بروتينات الغشاء ترانس التي على وجه التحديد ضعيف جداً للذوبان في الماء).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">مرفق تبلور في لجنة نهر الميكونج-LMB</a> وقد بدأ في وقت مبكر 2000s، وقدم موجز مبكر لدينا بروتوكولات الآلي في 200515. وقدم مقدمة تاريخية لبلورة البروتينات وأيضا نهج مخطط تفصيلي لمزايا نانولتر الروبوتية (ثم نهجاً جديداً للتجريب الروتينية). منذ تبلور الجزيئات هو أساسا عملية عشوائية مع المعلومات السابقة مفيدة جداً قليلاً أو لا، توظيف مجموعة متنوعة واسعة من الظروف الأولية (مناسبة) زيادة العائد من نوعية حيود بلورات16. وإلى جانب ذلك، ميزة كثيرا ما يغفل من شاشة أولية كبيرة التقليل من الحاجة إلى التحسين من عينات والبلورات في كثير من الحالات. وبطبيعة الحال، واحدة قد لا تزال بحاجة إلى المضي قدما في الاستغلال الأمثل لبعض الشروط الأولية في وقت لاحق. عادة، ثم يجري التحقيق تركز الكواشف ودرجة الحموضة بشكل منهجي. يمكن أيضا إدخال الكواشف أكثر إلى الشروط الأمثل لتغيير المعلمات لبلورة المزيد. ومن المؤكد أن واحدة ينبغي محاولة بلورة مع عينة طازج، ومن ثم البروتوكولات المقابلة يجب أن تكون واضحة ومتاحة أي وقت.
وهنا اثنين مؤتمتة بالكامل النظم المصممة في لجنة نهر الميكونج-LMB (نظم 1 و 2) والبروتوكولات المناظرة ويرد وصف كامل. التطبيق الرئيسي لهذين النظامين الأولى الفحص قبل نشر بخار في الجلوس لوحات تبلور قطره. يدمج النظام 1 معالج سائل ودائري الآلي لوحات الأسهم، طابعة النافثة لحبر للوحة العلامات والسدادة لوحة لاصقة. على نظام 1, 72 96-جيدا لوحات مليئة بمستلزمات الفرز المتوفرة تجارياً (80 ميليلتر من شرط نقل إلى الخزان من حجم ابتداء من 10 مل في أنابيب الاختبار)، والمسمى ومختومة. ثم يتم تخزين اللوحات في حاضنة 10 درجة مئوية حيث أنها تكون متوفرة للمستخدمين في أي وقت (كشاشات الأولى دعا 'لوحات LMB').
يتكامل نظام 2 معالج سائل وموزع نانولتر السدادة لوحة لاصقة. على النظام تنتج 2، يجلس قطرات (100-1,000 nL) لبخار نشر التجارب عن طريق الجمع بين الظروف والعينة في العلوي-آبار 20 48-96 جيدا أو لوحات المملوء مسبقاً مع الظروف. وهذا يعني 1,920 الفحص الأولى شروط تجربته عند استخدام لوحات LMB 20 على نظام 2.
الروبوتات تستخدم أيضا على حدة للاستفادة المثلى الشروط المحددة، ويرد أيضا وصف للبروتوكولات شبه الآلي المقابلة. ويستخدم الأسلوب 4-ركن17 بشكل روتيني لإنتاج شاشات الأمثل. ويتطلب البروتوكول الملحق أولاً إعداد دليل لحلول 4 ('أ، ب، ج، ود'). ثم يتم تلقائياً إنشاء التدرجات الخطية اثنين من تركيزات (لاثنين من عملاء تبلور الرئيسي) مباشرة إلى الخزانات من صفيحة التبلور. ولهذا الغرض، يوزع معالج سائل على أساس حقنه الحلول الركن 4 في نسب مختلفة.
لمواصلة تحسين شرط، واحد يمكن أن تستخدم شاشات المضافة التي يحتمل أن تعزز خصائص البلورات الناتجة عن18. النهجين متاحة للفحص المضافة: بروتوكول بدءاً من المواد المضافة إلى الاستغناء عن إلى خزانات لوحات تبلور قبل إعداد القطرات (بروتوكول 1) وبروتوكول آخر حيث يتم الاستغناء عن الشاشة المضافة مباشرة على القطرات (2 من البروتوكول).
وترد أيضا التطورات المفيدة الأخرى التي كانت قد بدأت في لجنة نهر الميكونج-LMB لتيسير بلورة الجزيئات الآلي،. أساسا، تبلور اللوحات والأجهزة المرتبطة بها مثل غطاء تكويم المجتمع من الجزيئية البيولوجية الفحص (SBS) أن يقلل تبخر شروط عند استخدام نظام 2.
للإيجاز، فمن المفترض أن المستخدمين على دراية بالوظائف الأساسية وصيانة موزع نانولتر والطابعة النافثة للحبر والسدادة لوحة لاصقة. ما لم ينص على خلاف ذلك، يتم وضع لوحات على ظهر السفينة الروبوتات أن A1 جيدا ('A1-الزاوية') نحو الركن الأيمن الخلفي حاملة لوحة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Robots</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freedom EVO&#174;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microlab&#174; STAR&#8482;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&#8482; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mosquito&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dragonfly&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive plate sealer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inkjet printer 9232</td>
			<td>Markem-Imaje</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystallization screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-110</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen 2&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-112</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009530</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009531</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Ammonium Sulfate</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-211</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG/LiCl</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-217</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick Screen&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-221</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Sodium Chloride</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-219</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG 6000</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-213</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; MPD</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-215</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemFac&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-114</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PEG/Ion&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-126</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Natrix&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-116</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen Lite&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Lite screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009536</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009537</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS1</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-101L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS2</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-102L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS3</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-103L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS4</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-104L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS5</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-105L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS6</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-106L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS7</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-107L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS8</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-108L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS9</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-109L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS10</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-110L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Index&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-144</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-107</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 2</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-109</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemStar&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-21</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemSys&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-25</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JCSG-plus&#8482; Suite</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >130720</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-46</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi minimal screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-127</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi-PEG screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; II screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-91</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LMB crystallization screen&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-98</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Additive screens</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT additive screen</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-138</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-93-500</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (500 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-93</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped wells (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100-FX</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped well (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HIPPOCRATES additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>n/a</td>
			<td >48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS&#174; III).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Other consumables</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well MRC 2-drop plate</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MRC 96T-UVP</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >48-well MRC 1-drop plate&#160; (&#39;MAXI plate&#39;)</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MMX01-UVP&#160;</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 &#181;L. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MRC hanging drop seal</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive sealing tape</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR4-50</td>
			<td >3-inch wide Duck&#174; HD Clear&#8482; for sealer and manual sealing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive aluminium sheet</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >538619</td>
			<td >Used to reseal additive screens.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ink cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>9651</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Solvent cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>8652</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L tips&#160;</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>235947</td>
			<td >System 2 (STAR&#8482; liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE&#8482; tips in disposable stacks.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent container</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>194052</td>
			<td >Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate</td>
			<td >Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td >AB-2150</td>
			<td >System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito&#174;). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microsyringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03020</td>
			<td >Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito&#174; nanoliter dispenser (9mm spacing).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >strip-holder block</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >3019-05013</td>
			<td >SSB device for the Mosquito&#174; strips, aka &#39;4-way Reagent Holder&#39;.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03110</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03100</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL syringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07100</td>
			<td >Syringe body and piston for the Dragonfly&#174; liquid handler. Pack of 100.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Troughs/Reservoirs</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07103</td>
			<td >Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly&#174;. Pack of 50.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital microplate shaker</td>
			<td>CamLab Limited</td>
			<td>n/a</td>
			<td >Variomag&#174; for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate mixer</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>3121-01015</td>
			<td>MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology

عندما يتم الحصول على بلورات ذات جودة عالية التي ديفراكت الأشعة السينية، يمكن حلها بنية بلورية في القرب من القرار الذري. الشروط اللازمة لبلورة البروتينات والسلطات الوطنية المعينة، والكشف، وهذه المجمعات ولكن لا يمكن توقع. تستخدم مجموعة متنوعة واسعة من الظروف وسيلة لزيادة عائد بلورات حيود الجودة. وقد وضعت اثنين من أنظمة مؤتمتة بالكامل في "لجنة نهر الميكونج مختبر للبيولوجيا الجزيئية" (كامبريدج، إنكلترا، لجنة نهر الميكونج-LMB) التي تسهل فحص تبلور ضد الظروف الأولية 1,920 بنشر بخار في قطرات نانولتر. كما وضعت بروتوكولات شبه الآلي لتحسين الظروف بتغيير تركيزات الكواشف، درجة الحموضة، أو عن طريق إدخال الإضافات التي يحتمل أن تعزز خصائص البلورات الناتجة عن ذلك. سيتم وصف تفصيلي لكافة البروتوكولات المقابلة ومناقشتها بإيجاز. مجتمعة، فإنها تمكن بلورة الجزيئات ملائمة وذات كفاءة عالية في مرفق متعدد المستخدمين، بينما يعطي المستخدمين السيطرة على المعالم الرئيسية لهذه التجارب.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

نظم التشغيل الآلي والبروتوكولات لإعداد عدد كبير من الشاشات الاعتيادية ونانولتر بلورة قطرات البخار نشر التجارب موصوفة ومناقشتها.

الآلي البروتوكولات لبلورة الجزيئات في لجنة نهر الميكونج مختبر البيولوجيا الجزيئية

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

عالية الدقة حنق في مستوى جزيء واحد لجزيء الجزيئي تحديد هيكل

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

تنامي البلورات البروتينية مع أبعاد متميزة باستخدام الآلي تبلور مقرونا في الموقع الحيوي تشتت الضوء

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

تنقية خطوة واحدة من المجمعات الجزيئات باستخدام الحمض النووي الريبي يعلق على البيوتين ورابط صور كليفابل

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

الفحص الاستراتيجي وتوصيف مجمع إشارات البروتين البصرية GPCR-mini-G للتبلور الناجح

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

التحليل الطيفي للارتباط الفلوري للتباين الموضعي لتحليل الانتشار الجزيئي في الغشاء البلازمي للخلايا الحية

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR موتاجينيسيس، الاستنساخ، التعبير، بروتوكولات تنقية البروتين السريع وتبلور النوع البري وأشكال متحولة من التربتوفان سينتاس

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

مجموعة بيانات تسلسلية هدف ثابت في مصدر ضوء الماس

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

سير العمل وأدوات لفحص الأجزاء البلورية في هيلمهولتز-زينتروم برلين

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...