Name: automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

MRC-LMB krystallisering facilitet er venligt støttet af medicinsk forskning Rådet (UK). Vi vil gerne takke medlemmerne af LMB for deres støtte: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent og Pat Edwards (strukturelle undersøgelser), Steve Scotcher og de øvrige medlemmer af den mekaniske værksted, Neil Grant og Jo Westmoreland (visuelle hjælpemidler), Paul Hart og Tom Pratt (IT). Vi vil også gerne takke Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart og Heather Ringrose (Hamilton robotteknologi, UK), Paul Thaw, Robert Lewis og Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Schweiz), George Stephens og Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem Imaje, UK) og Graham Harris (The Cleveland Agency) for teknisk hjælp.

1. to automatiserede fuldt systemer (indledende screening)
<ol><li>
System 1: forberedelse af 72 96-brønd krystallisering plader fyldt med screening kits (LMB plader)
	<ol>
<li>Inden du udfører proceduren, sikre, at systemets robotter er initialiseret og deres kontrollerende software er åben. Tænde chiller tube-køling luftfartsselskabets ca 30 minutter før main-programmet startes.</li>
		<li>Placer en test plade på motoriseret SBS bærer af plade sealer. Køre plade sealer og kontrollere, at filmen bliver anvendt ordentligt. Gentag denne test to gange mere for at kontrollere, at den plade sealer er klar.</li>
		<li>Tilføj derefter 20 L ionbyttet vand til den største beholder med flydende handleren. Afbryde kobling skær fra den lille beholder (20% ethanol skylning løsning) og forbinde indsætter til den primære beholder.</li>
		<li>Angiv den relevante skærmnavn (tabel 1) på inkjet printer touchscreen. Derefter åbne og lukke karrusel døren for at udløse karrusel rotation. Åbn døren, når den første stak præsenterer sig selv.</li>
		<li>Fuldt indlæse den første stak med 22 krystallisering plader, hver med kolonne 1 vender ud. Fuldt indlæse de næste to stakke på samme måde.</li>
		<li>Indlæse de resterende 6 plader i de højeste stillinger i den fjerde stak. Luk karrusel døren.</li>
		<li>Kontroller, at visningen chiller angiver 14 ° C. Forsigtigt og gentagne gange invertere de valgte screening kits i 1 minut. Åbn derefter den flydende handleren frontpanel.</li>
		<li>Åbne rør og placere dem i afkøling luftfartsselskabet ifølge systemets standardopsætning 96-brønd (A1, A2, osv.). Efter markedsføring hvert rør i flyselskabet, placere dens låg på en bakke i den samme 96-godt layout.</li>
		<li>Cross-check røret positioner og sikre, at alle rør er niveau og bosatte sig i luftfartsselskabet. Luk frontpanelet.</li>
		<li>I vinduet 'Start' af flydende handleren software Vælg 'Run vedligeholdelse' og Åbn programmet rødmen. Kør programmet til at skylle 20% ethanol fra systemet og at vaske ydersiderne af de flydende-dispensering tips.</li>
		<li>Når rødmen er fuldført, skal du klikke på 'Annuller' for at vende tilbage til 'Start'. Vælg 'Kør en eksisterende proces' og klik 'Start dit valg'. Åbn programmet 'MRC kit udlevering'. Udfyld '18' for 'Tilfælde' i konfigurationen raster og køre programmet.</li>
		<li>Overvåge systemet, som de første fire plader er mærket, fyldt og plomberet.</li>
		<li>Når alle 72 plader har udarbejdet og lagt tilbage i karrusellen, skifte kobling skær fra den primære beholder til den lille beholder. Kør programmet 'Start up flush' (Se trin 1.1.10).</li>
		<li>Slukke chiller og kassér tomt screening kit rør. Fjern forsigtigt de 72 villige plader fra karrusellen. Kassér forkert udfyldt eller dårligt-forseglet plader. Gemme klar-til-brug plader på 10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
System 2: Opsætning af krystallisering dråber (100 nL protein + 100 nL betingelse) fra en enkelt prøve i 20 LMB plader
	<ol>
<li>Først, sikre, at systemets robotter er på, nanoliter dispenser er initialiseret med sin software åben, og den flydende handleren metode manager er åben. Slå microtube-køling Flyselskabet ca 15 minutter før main-programmet startes.</li>
		<li>Placer en test plade på motoriseret SBS bærer af plade sealer. Køre plade sealer og kontrollere, at pladen er forseglet korrekt. Test af plade sealer tre gange.</li>
		<li>Kør derefter nanoliter dispenser til at sætte 100-nL dråber af test-opløsningen i en test plade. Kontroller under et mikroskop, dråberne er indstillet korrekt. Luk nanoliter dispenser software og fjern strip-indehaveren blok fra dæk.</li>
		<li>Indsæt dernæst i den specialdesignede plade holder (Se Repræsentant resultater: krystallisering enheder udviklet på LMB) LMB pladen med den højeste relative mængde flygtige reagenser i dens betingelser (tabel 1). Fjern den selvklæbende film fra pladen.</li>
		<li>Åbn frontpanelet for flydende handleren og tætnet pladen anbringes på dæk, på bagsiden af den første glidende carrier (glidende luftfartsselskaber kan trækkes ud for lethed af adgang).</li>
		<li>Dække pladen med en SBS aluminium låg. Bilægge låget mod den bageste venstre hjørne af luftfartsselskabet ved at anvende blid pres på det modsatte hjørne af låget.</li>
		<li>Fjerne forseglingen, indlæse i de glidende luftfartsselskaber og dække de resterende 19 plader på samme måde arbejder fra mest at mindst flygtige betingelser. Når microtube-køling carrier er ved 4 ° C, som er angivet med et grønt lys, skal du fjerne omslaget.</li>
		<li>Afbrød låget af en microtube, der indeholder (mindst) 440 µL af protein prøve (tabel 2). Sikre, at prøven har ingen skum ovenfor menisk, da det vil forstyrre den flydende detektionssystem. Glasset anbringes i Position 1 af microtube-køling Flyselskabet.</li>
		<li>Placer en PCR-plade på flydende handler dæk foran plade bevæger adapter luftfartsselskab. Luk frontpanelet.</li>
		<li>Efter indlæsning af dæk, sikre at nanoliter dispenser dæk fremgår af strip-indehaveren blok og at luftfartsselskaber på bagsiden 50 µL tip stakke er klart af aluminium SBS låg.</li>
		<li>Den flydende handler 'Metode Management' grænseflade, Vælg 'Setup plader'. Overvåge initialisering af begge systemer og udfylde de køre parametre. Følg retningslinjerne for den metode Management interface (prompter, tal og et tip-management system hjælpe med forberedelse).</li>
		<li>Dobbelttjek, at alle nødvendige komponenter er klar, og derefter starte processen.</li>
		<li>Overvåge systemet nanoliter dispenser indstiller dråberne i den første plade og plade sealer efterfølgende sæler pladen.</li>
		<li>Når alle 20 plader har været forberedt med krystallisering dråber og automatisk tilbage til de glidende luftfartsselskaber, Åbn frontpanelet og forsigtigt fjerne pladerne. Kontrollere, at pladerne korrekt forseglet før gemme dem for krystallisering.</li>
		<li>Rengøre SBS låg med en 20% ethanol løsning inden stabling dem på den venstre side af flydende handleren til opbevaring. Kassér PCR-plade og microtube.</li>
		<li>Slå microtube-køling transportøren og tørre væk kondensation. Forlade et papir håndklæde på toppen af den køligere overflade til at absorbere yderligere kondens. Derefter, sæt bagcoveret på carrier og luk frontpanelet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. optimering af betingelser
<ol><li>
Sprøjte-baseret flydende handleren: producerer to lineære gradueringer af koncentrationer i reservoirer for en krystallisering plade (4-hjørne metoden).
	<ol>
<li>Først, sikre at flydende handleren er på og initialiseres med sine open software.</li>
		<li>På 'GRADUERINGEN' fanen: Åbn programmet kræves, Vælg krystallisering plade type og det endelige rumfang i reservoirer (tabel 3). Den avancerede indstilling til «max shot vol» bør sænkes fra 6.000 til 3.000, når du bruger opløsninger indeholdende [isopropanol] > 10% v/v og [MPD] > 20% v / v.
</li>
		<li>Forberede sprøjter. Placere et stempel i hver sprøjte (spidse ender ned) og Indsæt på bagsiden af sprøjter ind i udpegede rillerne nedenunder robot hoved. Twist en sprøjte med uret for at låse den i position (programmet vil begynde kun med alle de krævede sprøjter knyttet korrekt).</li>
		<li>Forberede trug. Fjerne rustfrit stål ramme og indsætte trug. De 4 positioner på venstre svarer til de 4 hjørner A, B, C, D. kontakten til 'SET UP' fane, der viser mængderne af løsninger kræves i hver sprøjte (på tabel 3, 0,5 mL dødvolumen blev tilføjet til diskenhederne vises). Hæld hjørne løsninger i deres respektive trug og placere rammen tilbage på dækket (rammen holder i position med 2 små magneter placeret foran på dækket). En alternativ måde at gå videre med dette trin er at hælde løsningerne i trug, når de allerede er placeret på dæk.
</li>
		<li>Krystallisering pladen anbringes på den motoriserede SBS luftfartsselskab.</li>
		<li>Klik på 'ASPIRÉR' og vente på dette trin udfyldes (når stemplerne standsede på deres vej op).</li>
		<li>Skift til fanen 'Kør' og køre programmet.</li>
		<li>Efter afslutningen af programmet, gå tilbage til fanen Konfigurer, og klik på 'Fjern': systemet renser sprøjter fra sidesten løsninger, og derefter løfter stemplerne hele vejen op. 'Rense' kan anmodes om i stedet for 'Fjern'; Dette vil efterlade stemplerne på den nederste position, klar til Opsug mere løsninger med de samme sprøjter.
</li>
		<li>Fjerne sprøjter ved at dreje dem mod uret.</li>
		<li>Kassér sprøjter og lavpunkter i den passende placering (eller skylle dem med deioniseret vand og derefter 20% v/v ethanol løsning for genbrug).</li>
		<li>Forsegle pladen og læg den på mikrotiterplade mixer til 3 min ved 1000 rpm, eller 10 min, når meget tyktflydende løsninger blandes. Pladen er klar til opsætning af krystallisering dråber på nanoliter dispenser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tilsætningsstof screening protokol 1 (oprettelse af krystallisering dråber i en 96-brønd krystallisering tallerken fyldt med tilsætningsstoffet skærm)
	<ol>
<li>Først, forberede tilstand med indledende koncentrationer af reagenser steg med 10% (min. vol. 15 mL når du overfører betingelsen fra en beholder på den additive skærm med flydende handleren).</li>
		<li>Sikre, at de flydende handler er klar til at betjene. Åbn programmet 'Tilføj skærm til tilsætningsstoffer' for en enkelt plade (Angiv volumen i reservoirer: '72 µL'). Beder, tal og et tip-management system (12 x 1.000 µL tips kræves) hjælpe med at sikre robotten er klar til at fungere efter valgene.
</li>
		<li>Hente tilsætningsstof skærmen fra-20 ° C inkubator og fjerne dens aluminium seal straks (brug plade-indehaveren), så pladen anbringes på dækket af den flydende handleren. Programmet fungerer efter et portræt layout (pladen placeres med A1-hjørne placeret foran til venstre i luftfartsselskabet). Også placere også container fyldt med betingelsen. Kør programmet.</li>
		<li>Når reservoirer for pladen har været fyldt, placere den på mikrotiterplade shaker og køre programmet. Skyl beholderen for tilstand med deioniseret vand og 20% ethanol til genbrug.</li>
		<li>
Oprette droplets på nanoliter dispenser. For det første markante krystallisering plade (brug plade-indehaveren). Derefter sted pladen og 8-godt protein strip i den første position af strip-indehaveren blok. Fanen 'Setup' på den kontrollerende software viser de faktiske holdninger af hver komponent på dækket. Belastning hver godt af strip med protein prøve drop størrelse kræves (tabel 4). Køre programmet at forberede droplets.
</li>
		<li>Efter afslutningen af programmet, fjerne pladen fra dæk og forsegle det straks (bruge plade sealer, 3-tommer bredt selvklæbende tape). Kassér strip i den passende placering.</li>
		<li>Vurdere størrelsen, form, og centrering af dråber under mikroskop før opbevaring.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tilsætningsstof screening protokol 2 (oprettelse af krystallisering dråber i en 96-brønd krystallisering plade med en genbrugelige tilsætningsstof skærm)
	<ol>
<li>Først, forberede det additive skærm: forlade den tilsvarende frosne 96-brønd celle kultur plade til at tø op ved stuetemperatur i 40 min. Derefter centrifugeres tilsætningsstof skærmen ved 1.000 x g i 2 min.</li>
		<li>Forberede tilstand (min. vol. 15 mL når du overfører betingelsen fra en beholder på den additive skærm med flydende handleren).</li>
		<li>Fyld reservoirer for en 96-brønd krystallisering plade med betingelsen. På væske-handleren, fortsætte på samme måde som protokol 1, trin 2.2.2, men Angiv "80 µL" for mængden i reservoirer.</li>
		<li>Oprette droplets på nanoliter dispenser med 3 komponenter på dækket (den plade der indeholder tilsætningsstoffet skærmen, sammen med krystallisering pladen og 8-godt protein-striben i den første position af strip-indehaveren blok, tabel 4).</li>
		<li>Forsegle celle kultur pladen som indeholder skærm med en aluminium ark og læg den tilbage i inkubatoren-20 ° C.</li>
		<li>Vurdere størrelsen, form, og centrering af dråber under mikroskop før opbevaring.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Vi hermed tilstand en modstridende kommercielle interesser, da LifeArc commercializes følgende: 96 - og 48-brønden MRC plader, MRC hængende drop sæl, MORPHEUS, Pi, ÅNGSTRØM og LMB krystallisering skærme.

1 - udarbejdelse og anvendelse af indledende skærme gemt i plader
Screening kits skal blandes før der hældes plader, fordi lys nedbør eller fase adskillelse opstår i nogle rør under opbevaring. Når en skærm er sammensat af to kits (2 x 48 rør), er den første rør af andet kit placeret i beliggenhed E1 afkøling luftfartsselskabets. Når en skærm består af 4 kits (4 x 24 rør), den første rør af andet kit er placeret i beliggenhed C1, den første rør af den tredje kit er placeret i placering E1 og den første rør af den fjerde kit er placeret i placering G1. Samtidigt med at indlagde rør i deres afkøling carrier, er låg placeret på en bakke efter standard 96-brønd landskab layoutet. Da godt tal er angivet oven på lågene af fabrikanter, muliggør dette krydscheck hvis alle rør er blevet placeret i den rigtige rækkefølge. Dette hjælper også til at erstatte de korrekte låg på rørene, når du udfylder en reduceret antallet af plader.
Vi gemmer fyldt pladerne ved 10 ° C, et kompromis for at undgå frysning og oplagring ved 4 ° C, der kan medføre forringelse af betingelser og problemer med forsegling. Pladerne er gemt i op til flere måneder med normalt ingen mærkbar kondens på indersiden af sæl. Dette er mindre sandt for LMB05, LMB06, LMB09 og LMB10 plader som disse indeholde betingelser med relativt høje koncentrationer af flygtige reagenser (tabel 1). Lille mængde af kondens på den indvendige side af seglet reducerer forsegling effektivitet og kan medføre krydskontaminering mellem wells mens unsealing pladerne. For at hjælpe med at forhindre kondens under indledende afkøling, kan plader først overført fra karrusel i en isoleret picnic køligere, der er lagret i et koldt rum, 4 ° C natten over. Den meget langsom afkøling minimerer udviklingen af temperatur forløb inden for de lukket wells og dermed reducerer kondens samlede15. Desuden, når pladerne er gemt i 10 ° C inkubator, er en in-house custom SBS polystyren låget placeret på plade øverst i hver stak (ikke vist).
Hele sættet af vores fyldt plader kan bruges som en stor første skærm mod en roman, vandopløselige, protein prøve. Alternativt, færre plader kan vælges til at matche specifikke krav. For eksempel, LMB15 og LMB19 er skærme formuleret specielt til membranen protein prøver26,27, eller LMB20 er en skærm, formuleret med heavy-atomer til at lette den eksperimentelle udfasning af diffraktion data28 (Se også : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formulering af MORPHEUS protein krystallisering skærme</a>).
2. opsætning af krystallisering dråber
Når du bruger systemet 2, skal screening kits med betydelige mængder af flygtige reagenser behandles først. Dette undgår man kondens dannes på gummi af SBS låg, der indvirker på låget håndtering og plade forsegling. En SBS låget har lidt af clearance når øverst på en plade, som derfor skal de justeres i første omgang (Se protokollen, trin 1.2.6). Protein døde diskenheder i wells af PCR-plade er relativt generøse (0,8 µL, Se forklaringen i tabel 2). Bemærk, at lige så generøs døde diskenheder er ansat ved brug af nanoliter dispenser individuelt med protein i 8-brønds strips (tabel 4). Mindre døde diskenheder kan arbejde, men nogle prøver overholder tips, kalibrering af en robot kan blive lidt unøjagtig, rummet kan være varmere end sædvanligt, osv. Alle føre til prøven tab dækket af de generøse døde diskenheder for at konsolidere tilgangen.
Seneste udvikling aktiveret yderligere miniaturisering af eksperimenter og dermed volumen af prøven kræves for screening krystallisering betingelser kan reduceres væsentligt ved at integrere den tilsvarende teknologi29,30 . Nogle aspekter af yderligere miniaturisering skal dog nøje overvejelse, såsom fordampning af droplets31 og manipulation af microcrystals32.
Endelig, centrifugering af pladen (2.000 omdr. / min., 1 min.) kunne integreres som en rutinemæssig sidste trin, når du konfigurerer krystallisering dråber (i sfæriske øvre-wells). En mere ensartet størrelse og form af dråber som følge af centrifugering kan reducere reproducerbarhed spørgsmål33,34. Sikkert, centreret dråber vil lette den senere vurdering af eksperimenter ved hjælp af et mikroskop, som de krævede brændvidde vil være den samme på tværs af hele pladen.
3. fordelene ved metoden 4-hjørne
Den mest markante fordel ved 4-hjørne metoden er dets enkelhed, hvilket minimerer fejl og letter ligetil automatiseret protokoller. For eksempel, placeret 4 hjørne løsninger altid på dækket af en flydende handler efter det samme layout. Også, alle programmer er baseret på faste nøgletal mellem løsninger (figur 3 c). Manuel forberedelse af de 4 hjørne løsninger foretrækkes til automatiserede håndtering af løsninger i høje koncentrationer, som kan være meget tyktflydende. Relativt hurtige og præcise aspiration/udlevering er derefter muligt på de fleste typer af flydende handlere med mindstekrav til optimering af flydende klasser. Ikke desto mindre kan nogle hjørne løsninger stadig være for tyktflydende for en robot, der opererer med en væske-system til at fungere effektivt. Det er derfor, vi har valgt en flydende handler opererer med positive forskydning (figur 3B).
Ud over de 2 lineære gradueringer af koncentrationer, kan en tredje komponent (dvs., et sæt af buffere/tilsætningsstoffer) testes på en konstant koncentration på en praktisk måde. For dette, er en relativt stor mængde af et grundlæggende sæt af hjørne løsninger på en passende højere koncentration, undtagen komponenten skal varieres, forberedt først. Derefter stamopløsninger herunder denne komponent er tilføjet til at justere de endelige koncentrationer. For eksempel, er 50 mL af et sæt af 4 hjørne løsninger forberedt på 10% højere koncentrationer end i første omgang. Dette sæt er så delt i 5 mindre undersæt af 4. Endelig, 10% i mængden af forskellige buffer pH løsninger er tilføjet til hver delmængde.
4. formater og typer af tilsætningsstoffet skærme
Skærmene er normalt opbevares ved-20 ° C (figur 4), da de ikke bruges regelmæssigt og indeholder flygtige/ustabile forbindelser. Brug af en frossen tilsætningsstof skærm lagret i en dyb brønd blok (1 mL i wells) skal planlægges tidligt, fordi det vil tage 12-24 hr for alle de tilsætningsstoffer løsninger at tø helt ved stuetemperatur. Også et væld af brugere dele samme tilsætningsstof skærmen, potentielt forårsager problemer med krydskontaminering. Endelig, højden af dyb brønd blokke gør dem uegnede til de fleste nanoliter dispensere. Som en praktisk løsning til at omgå disse problemer, skal skærmen overføres fra dyb brønd blokken til lav-profil plader (figur 4).
Tilsætningsstof skærme, som omfatter en bred vifte af enkelt reagenser (med enkelt koncentrationer) har historisk set været meget populære35,36. Men andre typer af tilsætningsstoffet skærme er blevet udviklet, integrerer blandinger af tilsætningsstoffer37 eller en reduceret antallet af enkelt tilsætningsstoffer fundet ved forskellige koncentrationer38. Endelig, en supplerende tilgang er at undersøge effekten af tilsætningsstoffer på prøver før krystallisering39,40.
5. flere overvejelser
God praksis: De fleste skærme indeholder skadelige eller endda giftige stoffer og dermed tilstrækkelig personlig beskyttelse skal være ansat under protokollerne. Lige, bevægelige dele af robotter kan føre til skader, især når de forsøger at manuelt blande mens et program kører (selv om de fleste af robotterne har nødstop-knappen/system). På grund af de tekniske kompleksitet involveret, regelmæssig kontrol af robotter, skærme og programmer med tidligere karakteriseret testprøver, der er vigtige for vedvarende høje niveauer af reproducerbarhed.
Produktion: Som en indikation, mellem 4.000 til 8.000 LMB er plader produceret årligt med 1-system (og efterfølgende ansat af brugere for indledende screening). Det er ikke tilpasset de bestand en stor mængde af fyldt plader på 10 ° C, når den forventede omsætning er meget lavere, som efter 4-5 måneder, nogle betingelser vil begynde at blive forværret og fordampe. Forskellige tilgange til automatisering protokoller er blevet gennemført for små til medium størrelse laboratorier41.
Lagring og vurdering af eksperimenter: Efter udarbejdelsen af dråber, er pladerne gemt på vibrationsminimeret hylder i et værelse på 4 eller 18 ° C med stramt kontrolleret temperatur (+/-0,5 ° C maksimal afvigelse). Eksperimenter er vurderet ved hjælp af koldt lys kilde mikroskoper. Forskellige automatiske Billeddannende systemer er kommercielt tilgængelige, men man bør nøje overveje alle aspekter: vil den hastighed, der kræves til at scanne en plade være tilstrækkeligt for høj produktivitet? Påvirker objekter end krystaller med autofokus? Bliver den resulterende kvalitet af billeder nok til at stedet meget små krystaller (især omkring kanten af dråberne)? 42 , 43 , 44
Sammenligning af krystallisering betingelser: Efter omhyggelige undersøgelser om karakteren af de i første omgang fremstillede krystaller, kan man analysere tendenser og ligheder på tværs af betingelser ved hjælp af <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB skærmen database</a> eller C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Webværktøj</a>45.

Røntgenkrystallografi er i vid udstrækning anvendes til yderligere fremme vores forståelse af biologiske og sygdom mekanismer på det atomare niveau og efterfølgende hjælpe rationel tilgange til drug discovery1. For dette, renset og koncentreret (2-50 mg/mL) makromolekylære prøver af proteiner, DNA, RNA, andre ligander og deres komplekser er trialed for deres tilbøjelighed til at danne bestilte tre-dimensionelle lattices gennem krystallisering2,3 ,4. Når høj kvalitet krystaller er fremstillet, diffract x-stråler, kan krystalstruktur løses på nær atomic opløsning5,6. Afgørende, betingelser at krystallisere en roman prøve kan ikke forudsiges og udbyttet af høj kvalitet krystaller er normalt meget lavt. En underliggende årsag er, at mange prøver af interesse har udfordrende biokemiske egenskaber, som gør dem ustabile på tilsvarende tidsskalaen for krystallisering (typisk et par dage). Endelig, processen er forværret af den tid, det tager at producere prøver og prøve varianter og optimere deres rensning og krystallisation7,8.
Betingelsen krystallisering er en løsning med en fældningsmiddel, der reducerer prøve opløselighed, og ofte også indeholder buffere og tilsætningsstoffer. Hundredvis af sådanne reagenser er velegnet til at ændre parametrene for krystallisering eksperimenter, som de har lav tilbøjelighed til at forstyrre prøve integritet (såsom protein eller nukleinsyre udfoldning). Mens testning millioner af kombinationer af krystallisering reagenser ikke er mulig, er test flere til mange screening kits - formuleret med forskellige strategier9,10 - muligt med miniaturized forsøg og automatiseret protokoller. I dette perspektiv er den mest medgørlige teknik sandsynligvis vapor diffusion med 100-200 nL dråber sidder på et lille godt over et reservoir, der indeholder betingelsen krystallisering (25-250 µL), gennemført i specialiserede krystallisering plader11 , 12. protein prøve og tilstand kombineres ofte i forholdet 1:1 for en samlet maengde paa 200 nL når du opretter slipværktøjer i øvre-brønde. Robot nanoliter protein krystallisering kan gennemføres med alternative teknikker og plader som manglende olie batch13 og Lipidic Cubic fase14 (den nyeste ene at blive anvendt specifikt til trans-membran proteiner, der er meget dårligt opløselige i vand).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">Krystallisering facilitet på MRC-LMB</a> blev startet i begyndelsen af 2000 ' erne og en tidlig Resumé af vores automatiserede protokoller blev præsenteret i 200515. En historisk Introduktion til protein krystallisering blev præsenteret og også en oversigt over fordelene ved robot nanoliter tilgang (derefter en ny metode til rutinemæssig eksperimenter). Siden makromolekylære krystallisering er hovedsagelig en stokastiske proces med meget lidt eller ingen nyttige forhåndsoplysninger, ansætte en bred vifte af (egnet) begyndelsesbetingelser øge udbyttet af kvalitet diffraktion krystaller16. Desuden er en ofte overset fordel af et stort indledende skærm at reducere behovet for optimering af prøver og krystaller i mange tilfælde. Selvfølgelig kan man stadig nødt til at fortsætte med optimering af nogle oprindelige betingelser senere. Typisk, koncentrationen af reagenser og pH er derefter systematisk undersøgt. Flere reagenser kan også indføres i den optimerede betingelse(r) yderligere ændre parametrene for krystallisering. Sikkert, man bør forsøge krystallisering med en prøve frisklavede, dermed de tilhørende protokoller skal være enkle og tilgængelige helst.
Her, to fuldt automatiseret systemer designet på MRC-LMB (systemer 1 og 2) og de tilhørende protokoller er fuldt beskrevet. Den vigtigste anvendelse af disse to systemer er indledende screening af vapor diffusion siddende drop krystallisering plader. System 1 integrerer en flydende handleren, en automatiseret karrusel til stock plader, en inkjetprinter for plade mærkning og en selvklæbende plade sealer. På system 1, er 72 96-brønd plader fyldt med kommercielt tilgængelige screening kits (80 µL af betingelsen overføres til reservoir fra en start volumen på 10 mL i reagensglas), mærket og forseglet. Pladerne opbevares derefter i en 10 ° C incubator, hvor de er tilgængelige for brugerne når som helst (som indledende skærme kaldet 'LMB plader').
System 2 integrerer en flydende handleren, en nanoliter dispenser og en selvklæbende plade sealer. På systemet 2, sidder dråber (100-1.000 nL) for dampe diffusion eksperimenter er produceret ved at kombinere betingelser og prøven i øvre-wells af 20 48 eller 96 brønde plader fyldt med betingelser. Dette betyder 1.920 indledende screening betingelser er trialed, når du bruger 20 LMB plader på systemet 2.
Robotter bruges også individuelt for optimering af udvalgte forhold, og de tilsvarende halvautomatiske protokoller er beskrevet. 4-hjørne metoden17 er ansat rutinemæssigt at producere optimering skærme. Tilsvarende protokollen først kræver manuel udarbejdelse af 4 løsninger ("A, B, C og D'). To lineære gradueringer af koncentrationer (for to vigtigste krystallisering agenter) er derefter automatisk genereret direkte til reservoirer for en krystallisering plade. For dette dispenserer en sprøjte-baseret flydende handler 4 hjørne løsninger på forskellige nøgletal.
For at optimere yderligere en betingelse, kan man ansætte tilsætningsstof skærme, der potentielt forbedre egenskaberne for resulterende krystaller18. To tilgange er tilgængelige for tilsætningsstoffet screening: en protokol, begyndende med tilsætningsstoffer hældes reservoirer for krystallisering plader før du konfigurerer dråber (protokol 1) og en anden protokol, hvor tilsætningsstoffet skærmen er udleveret direkte på dråber (protokol 2).
Andre nyttige udviklinger, der blev indledt på MRC-LMB til lette automatiseret makromolekylære krystallisering, er også præsenteret. Det væsentlige, krystallisering plader og tilknyttede enheder såsom en stabelbar samfund af Biomolekylær Screening (SBS) låg der minimerer fordampning af betingelser, når du bruger system 2.
For korthed antages det, at brugerne er fortrolige med de grundlæggende funktioner og vedligeholdelse af nanoliter dispenser, inkjetprinter og selvklæbende plade sealer. Medmindre andet er angivet, plader på dækket af robotter er placeret sådan, at de godt A1 ("A1-hjørne') er mod tilbage til venstre i en plade luftfartsselskab.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Robots</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freedom EVO&#174;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microlab&#174; STAR&#8482;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&#8482; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mosquito&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dragonfly&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive plate sealer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inkjet printer 9232</td>
			<td>Markem-Imaje</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystallization screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-110</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen 2&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-112</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009530</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009531</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Ammonium Sulfate</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-211</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG/LiCl</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-217</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick Screen&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-221</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Sodium Chloride</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-219</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG 6000</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-213</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; MPD</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-215</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemFac&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-114</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PEG/Ion&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-126</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Natrix&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-116</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen Lite&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Lite screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009536</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009537</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS1</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-101L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS2</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-102L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS3</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-103L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS4</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-104L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS5</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-105L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS6</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-106L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS7</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-107L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS8</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-108L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS9</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-109L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS10</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-110L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Index&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-144</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-107</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 2</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-109</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemStar&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-21</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemSys&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-25</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JCSG-plus&#8482; Suite</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >130720</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-46</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi minimal screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-127</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi-PEG screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; II screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-91</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LMB crystallization screen&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-98</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Additive screens</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT additive screen</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-138</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-93-500</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (500 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-93</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped wells (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100-FX</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped well (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HIPPOCRATES additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>n/a</td>
			<td >48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS&#174; III).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Other consumables</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well MRC 2-drop plate</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MRC 96T-UVP</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >48-well MRC 1-drop plate&#160; (&#39;MAXI plate&#39;)</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MMX01-UVP&#160;</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 &#181;L. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MRC hanging drop seal</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive sealing tape</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR4-50</td>
			<td >3-inch wide Duck&#174; HD Clear&#8482; for sealer and manual sealing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive aluminium sheet</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >538619</td>
			<td >Used to reseal additive screens.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ink cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>9651</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Solvent cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>8652</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L tips&#160;</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>235947</td>
			<td >System 2 (STAR&#8482; liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE&#8482; tips in disposable stacks.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent container</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>194052</td>
			<td >Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate</td>
			<td >Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td >AB-2150</td>
			<td >System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito&#174;). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microsyringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03020</td>
			<td >Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito&#174; nanoliter dispenser (9mm spacing).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >strip-holder block</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >3019-05013</td>
			<td >SSB device for the Mosquito&#174; strips, aka &#39;4-way Reagent Holder&#39;.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03110</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03100</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL syringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07100</td>
			<td >Syringe body and piston for the Dragonfly&#174; liquid handler. Pack of 100.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Troughs/Reservoirs</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07103</td>
			<td >Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly&#174;. Pack of 50.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital microplate shaker</td>
			<td>CamLab Limited</td>
			<td>n/a</td>
			<td >Variomag&#174; for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate mixer</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>3121-01015</td>
			<td>MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology

Når høj kvalitet krystaller er fremstillet, diffract x-stråler, kan krystalstruktur løses på nær atomic opløsning. Betingelser til at krystallisere proteiner, DNAs, RNA'er og deres komplekser kan dog ikke være forudsagt. Ansætte en bred vifte af betingelserne er en måde at øge udbyttet af kvalitet diffraktion krystaller. To fuldt automatiserede systemer er blevet udviklet på den MRC laboratorium for Molekylærbiologi (Cambridge, England, MRC-LMB) at lette krystallisering screening mod 1.920 oprindelige betingelser ved vapor diffusion i nanoliter dråber. Semi-automatiske protokoller har også udviklet til at optimere betingelser ved at ændre koncentrationen af reagenser, pH-værdien, eller ved at indføre tilsætningsstoffer, der potentielt forbedre egenskaberne af de resulterende krystaller. Alle de tilhørende protokoller bliver beskrevet i detaljer og kort drøftet. Taget sammen, aktiverer de praktisk og meget effektiv makromolekylære krystallisering i en multi-user facilitet, og giver brugerne kontrol over vigtige parametre for deres eksperimenter.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Automatiserede systemer og protokoller for den rutinemæssige forberedelse af et stort antal skærme og nanoliter krystallisation dråber til vapor diffusion forsøg beskrives og diskuteres.

Automatiseret protokoller for makromolekylære krystallisering på MRC Laboratory i Molekylærbiologi

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET på enkeltmolekyliveau for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskellige dimensioner ved hjælp af automatiseret krystallisering kombineret med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Enkelt-trins rensning af makromolekylære komplekser ved hjælp af RNA knyttet til Biotin og et foto-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekyleniveau ved hjælp af robuste biokemiske tilgange af et nyt kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening og karakterisering af Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for vellykket krystallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spot variation fluorescens korrelationsspektroskopi til analyse af molekylær diffusion ved plasmamembranen af levende celler

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Expression, Fast Protein Rensning Protokoller og krystallisering af wild type og mutant former for Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Fast target seriel dataindsamling på Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening på Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...