Name: automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

De faciliteit van de kristallisatie MRC-LMB is vriendelijk, ondersteund door de medische Raad voor onderzoek (UK). Wij danken de leden van de LMB voor hun steun: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent en Pat Edwards (structurele Studies), Steve Scotcher en de andere leden van de mechanische Workshop, Neil Grant en Jo Westmoreland (visuele hulpmiddelen), Paul Hart en Tom Pratt (IT). Ook wil wij bedanken Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart en Heather Ringrose (Hamilton Robotica, UK), Paul Thaw, Robert Lewis en Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Zwitserland), George Stephens en Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem-Imaje, UK) en Graham Harris (The Cleveland Agency) voor technische hulp.

1. de twee geautomatiseerde volledig systemen (eerste screening)
<ol><li>
Systeem 1: voorbereiding van 72 kristallisatie van de 96-wells-platen gevuld met screening kits (LMB platen)
	<ol>
<li>Voordat u de procedure uitvoert, ervoor zorgen dat het systeem robots worden geïnitialiseerd en hun controlerende software open is. Zet de chiller van de buis-koeling vervoerder ongeveer 30 minuten voordat het eigenlijke programma wordt gestart.</li>
		<li>Plaats een plaat van de test op de gemotoriseerde SBS drager van de plaat sealer. Voer de plaat sealer en controleer dat de film correct wordt toegepast. Herhaal deze test twee keer meer om te controleren dat de plaat sealer klaar is.</li>
		<li>Dan, Voeg 20 L gedeïoniseerd water aan de belangrijkste container van de vloeibare handler. Koppelt de koppeling invoegt vanuit de kleine container (20% ethanol oplossing spoelen) en sluit de inzetstukken op de belangrijkste container.</li>
		<li>Voer de juiste schermnaam (tabel 1) op de inkjet printer touchscreen. Vervolgens opent en sluit de deur van de carrousel om te activeren van de rotatie van de carrousel. De deur open wanneer de eerste stack zichzelf presenteert.</li>
		<li>Volledig laden de eerste stack met 22 kristallisatie platen, elk met kolom 1 naar beneden uit. De volgende twee stapels op dezelfde manier volledig te laden.</li>
		<li>De resterende 6 platen in de hoogste posities van de vierde stack worden geladen. Vervolgens sluit u de deur van de carrousel.</li>
		<li>Verifiëren dat de chiller display 14 ° C. verschijnt Zachtjes en herhaaldelijk omkeren de geselecteerde screening kits voor 1 minuut. Open vervolgens het voorpaneel van de vloeibare handler.</li>
		<li>Open de tubes en plaats ze in de koeling vervoerder volgens de standaard indeling van de 96-Wells (A1, A2, enz.). Bij het plaatsen van elke buis in de vervoerder, plaats de deksel op een dienblad in dezelfde 96-Wells-indeling.</li>
		<li>Toetsing de buis posities en ervoor zorgen dat alle buizen niveau zijn en vestigde zich in de drager. Vervolgens sluit het voorpaneel.</li>
		<li>In het venster 'Opstarten' van de vloeibare handler-software, selecteert u 'Run onderhoud' en open de afboekingsmethode programma. Voer het programma om de 20%-ethanol uit het systeem spoelen en te wassen van de buitenkant van de vloeistof-verstrekking tips.</li>
		<li>Wanneer spoelen voltooid is, klikt u op 'Annuleren' om terug te keren naar 'Opstarten'. Selecteer 'Uitvoeren een bestaand proces' en klik op 'Start uw selectie'. Open het programma 'MRC kit dispensing'. Invullen '18' voor 'Exemplaren' in de configuratie scherm en het programma start.</li>
		<li>Monitor het systeem als de eerste vier platen worden aangeduid, gevuld en verzegeld.</li>
		<li>Zodra alle 72 platen zijn opgesteld en de koppeling invoegt vanuit de belangrijkste container geplaatst terug in de carrousel, naar de kleine container overschakelen. Voer het programma 'Start omhoog vloed' (zie stap 1.1.10).</li>
		<li>Uitschakelen van de chiller en gooi de lege screening kit buizen. Verwijder voorzichtig de 72 bereid platen van de carousel. Gooi ten onrechte gevulde of slecht-verzegeld platen. Opslaan van de kant-en-klare platen bij 10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Systeem 2: instellen van kristallisatie druppels (100 nL eiwit + 100 nL voorwaarde) vanuit één sample in 20 LMB platen
	<ol>
<li>Controleer eerst dat het systeem robots zijn op de nanoliter dispenser met haar open software is geïnitialiseerd en de vloeibare handler methode manager geopend is. Zet de vervoerder microtube-koeling ongeveer 15 minuten voordat het eigenlijke programma wordt gestart.</li>
		<li>Plaats een plaat van de test op de gemotoriseerde SBS drager van de plaat sealer. Voer de plaat sealer en verifiëren dat de plaat goed wordt verzegeld. Test de plaat sealer driemaal.</li>
		<li>Voer vervolgens de nanoliter dispenser om in te stellen 100-nL druppels van meetoplossing ligt in een test-plaat. Kijk onder een Microscoop dat de druppels goed zijn ingesteld. Sluit de nanoliter dispenser software en verwijder het strip-houder blok van het dek.</li>
		<li>Steek vervolgens in de houder plaat maat ontworpen (Zie Vertegenwoordiger resultaten: kristallisatie apparaten ontwikkeld op de LMB) de LMB plaat met de hoogste relatieve hoeveelheid vluchtige reagentia in de voorwaarden (tabel 1). Verwijder de zelfklevende folie van de plaat.</li>
		<li>Open het voorpaneel vloeibare handler en plaats van de onverharde plaat op het dek, aan de achterkant van de eerste drager van de glijdende (Sliding vervoerders kan worden teruggetrokken voor gemakkelijke toegang).</li>
		<li>De afdekplaat met een SBS aluminium deksel. Genoegen nemen met het deksel naar de achterste linker hoek van de vervoerder door zachte druk toe te passen naar de tegenoverliggende hoek van het deksel.</li>
		<li>Verzegelde, in de glijdende vervoerders laden en dekking van de overige 19 platen op dezelfde manier, werken van meest naar minst vluchtige voorwaarden. Zodra de vervoerder microtube-koeling bij 4 ° C, is zoals aangegeven door een groen licht, verwijder de cover.</li>
		<li>Afgesneden het deksel van een microtube met (ten minste) 440 µL van eiwitSteekproef (tabel 2). Zorg ervoor dat het monster geen schuim boven de meniscus, als dit met het vloeibare detectiesysteem interfereren zal. Plaats de buis in positie 1 van de vervoerder microtube-koeling.</li>
		<li>Plaats een PCR-plaat op het dek met vloeibare handler voor de adapter plaat voortbewegende vervoerder. Vervolgens sluit het voorpaneel.</li>
		<li>Na het laden van het dek, ervoor zorgen dat het nanoliter dispenser dek duidelijk van het blok van de strip-houder is en dat de dragers aan de achterkant van de 50-µL tip stapels duidelijk van de aluminium SBS deksels zijn.</li>
		<li>Selecteer in de vloeibare handler ' methode ' beheerinterface, 'Setup platen'. De initialisatie van beide systemen controleren en invullen van de parameters uitvoeren. Volg de richtlijnen van de methode beheerinterface (aanwijzingen, cijfers en een tip-management systeem helpen met voorbereiding).</li>
		<li>Controleer of alle vereiste componenten zijn klaar en start het proces.</li>
		<li>Monitor het systeem zeehonden als de dispenser nanoliter de druppels in de eerste plaat en de plaat sealer vervolgens ondergaat de plaat.</li>
		<li>Zodra alle 20 platen zijn bereid met kristallisatie druppels en automatisch terug naar de glijdende dragers, open het voorpaneel en de platen voorzichtig te verwijderen. Controleren dat de platen goed alvorens ze op te slaan voor de kristallisatie zijn verzegeld.</li>
		<li>Reinig de SBS deksels met een oplossing van 20% ethanol voordat stapelen ze op de linker kant van de vloeibare handler voor opslag. De PCR-plaat en de microtube negeren.</li>
		<li>Uitschakelen van de vervoerder microtube-koeling en veeg weg de condensatie. Laat een papieren handdoek op de top van het koeler te absorberen verder condensatie oppervlak. Dan, breng het klepje van de vervoerder en sluit het voorpaneel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. optimalisering van de voorwaarden
<ol><li>
Spuit-gebaseerde vloeibare handler: produceren van twee lineaire verlopen van concentraties in de reservoirs van een kristallisatie plaat (de 4-hoek-methode).
	<ol>
<li>Controleer eerst dat de vloeibare handler brandt en geïnitialiseerd met haar open software.</li>
		<li>Op het 'verloop' tab: Open het vereiste programma, selecteert u het type van de plaat kristallisatie en het eindvolume in de reservoirs (tabel 3). De geavanceerde instelling voor 'max shot vol' van 6.000 tot 3000 moet worden verlaagd wanneer met behulp van oplossingen met [isopropanol en] > 10% v/v en [MPD] > 20% v / v.
</li>
		<li>Voorbereiding van het spuiten. Plaats een zuiger in elke spuit (spits uiteinde naar beneden) en de achterkant van de spuiten invoegen de aangewezen groeven onder het hoofd van de robot. Draai een spuit met de klok mee om het te vergrendelen in positie (alleen met alle vereiste spuiten goed aangesloten zal het programma starten).</li>
		<li>Bereiden de troggen. Verwijder het roestvrijstalen frame en plaats van de troggen. De 4 standpunten aan de linkerkant komen overeen met de 4 hoeken A, B, C, D. gaat u naar 'Instellen' tabblad waarin de volumes van oplossingen nodig in elke spuit (op tabel 3, 0,5 mL dood volume werd toegevoegd aan de volumes weergegeven). Giet de hoekoplossingen in hun respectieve troggen en plaats het frame terug op het dek (het frame heeft in positie met 2 kleine magneten, gelegen aan de voorzijde van het dek). Een alternatieve manier om door te gaan met deze stap is om te gieten de oplossingen in de troggen wanneer zij al op het dek geplaatst zijn.
</li>
		<li>Plaats de kristallisatie plaat op de gemotoriseerde SBS vervoerder.</li>
		<li>Klik op 'Gecombineerd' en wacht tot deze stap voltooid moet zijn (wanneer zuigers op hun weg omhoog gestopt).</li>
		<li>Ga naar het tabblad 'Uitvoeren' en start programma.</li>
		<li>Na voltooiing van het programma, ga terug naar het tabblad instellen en klik op 'Verwijderen': het systeem zuiveringen van het spuiten van overgebleven oplossingen, en dan het liften van de zuigers helemaal naar boven. 'Leegmaken' in plaats van 'Verwijderen' kunnen worden verzocht; dit de zuigers laat in de onderste positie, klaar om meer oplossingen met de dezelfde spuiten gecombineerd.
</li>
		<li>Verwijder de spuiten door deze linksom te draaien.</li>
		<li>Spuiten en troggen in de juiste bak negeren (of spoel ze af met gedeïoniseerd water en vervolgens 20% v/v ethanol oplossing voor hergebruik).</li>
		<li>Afdichting van de plaat en plaats deze op de microplate-mixer voor 3 min op 1000 toeren per minuut, of 10 min wanneer zijn zeer viskeuze oplossingen worden vermengd. De plaat is klaar voor het opzetten van kristallisatie druppels op de nanoliter dispenser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Additief screening van protocol 1 (het opzetten van kristallisatie druppels in een kristallisatie van de 96-wells-plaat vooraf gevuld met additieve scherm)
	<ol>
<li>Ten eerste bereiden de voorwaarde met een initiële concentratie van reagentia verhoogd met 10% (min. vol. 15 mL bij het overzetten van de voorwaarde van een container op het additieve scherm met de vloeibare handler).</li>
		<li>Zorg ervoor dat de vloeibare handler bereid is te werken. Open het programma 'Scherm toevoegen aan additieven' voor een enkele plaat (voer volume in reservoirs: '72 µL'). Wordt gevraagd, cijfers en een tip-beheer systeem (12 x 1.000 µL tips nodig) hulp met ervoor te zorgen dat de robot is klaar om te werken volgens de selecties.
</li>
		<li>Ophalen van de additieve scherm uit de incubator van-20 ° C en verwijderen zijn aluminium zegel onmiddellijk (gebruik de plaat houder), dan plaatst de plaat op het dek van de vloeibare handler. Het programma werkt volgens een portret lay-out (de plaat is geplaatst met de A1-hoek gelegen in de voorkant-links van de drager). Ook plaatsen ook de container gevuld met de voorwaarde. Voer het programma.</li>
		<li>Zodra de reservoirs van de plaat zijn ingevuld, plaats het op het schudapparaat microplate en start het programma. Spoel de container van de conditie met gedeïoniseerd water en 20% ethanol voor hergebruik.</li>
		<li>
Instellen van de druppels op de nanoliter dispenser. Eerst, unseal de kristallisatie plaat (gebruik de houder plaat). Dan, plaats de plaat en de proteïne 8-well strip in de eerste positie van het blok van de strip-houder. De 'Setup'-tab op de controlerende software toont de werkelijke positie van elk onderdeel op het dek. Laden elk goed van de strip met eiwitSteekproef volgens de grootte van de druppel nodig (tabel 4). Uitvoeren van het programma voor te bereiden van druppels.
</li>
		<li>Na voltooiing van het programma, verwijderen de plaat uit het dek en verzegel het onmiddellijk (gebruik de plaat sealer, 3-inch breed plakband). Gooi de strip in de juiste bak.</li>
		<li>Beoordelen van de grootte, vorm, en de centrering van de druppels onder de Microscoop voor opslag.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Additief screening van protocol 2 (opzetten van kristallisatie druppels in een kristallisatie van de 96-wells-plaat met een herbruikbare additieve scherm)
	<ol>
<li>Eerst, het voorbereiden van het additief scherm: laat de overeenkomstige bevroren 96-Wells-cel cultuur plaat te ontdooien bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten. Vervolgens Centrifugeer het additieve scherm bij 1.000 x g gedurende 2 min.</li>
		<li>De voorwaarde (min. vol. 15 mL bij het overzetten van de voorwaarde van een container op het additieve scherm met de vloeibare handler) voor te bereiden.</li>
		<li>Vul de reservoirs van een kristallisatie van de 96-wells-plaat met de voorwaarde. Van de vloeistof-handler, gaan op dezelfde manier als protocol 1, 2.2.2 stap, maar het invoeren van '80 µL' voor het volume in reservoirs.</li>
		<li>Instellen van de druppels op de nanoliter dispenser met 3 componenten op het dek (de plaat met de additieve scherm, samen met de kristallisatie-plaat en de 8-well eiwit strip in de eerste positie van het blok van de strip-houder, tabel 4).</li>
		<li>Zegel van de cel cultuur plaat met het scherm met een aluminium blad en plaats deze terug in de incubator van-20 ° C.</li>
		<li>Beoordelen van de grootte, vorm, en de centrering van de druppels onder de Microscoop voor opslag.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

We stellen hierbij een conflicterende commercieel belang aangezien LifeArc de volgende producten commercialiseert: de 96 - en 48-well MRC platen, het MRC opknoping drop zegel, de MORPHEUS, Pi, ANGSTROM en LMB kristallisatie-schermen.

1 - voorbereiding en het gebruik van de eerste schermen opgeslagen in platen
Screening van kits moet worden vermengd voordat het wordt afgeleverd in platen, omdat lichte neerslag of fase scheiding in sommige buizen tijdens de opslag plaatsvindt. Wanneer een scherm is samengesteld uit twee kits (2 x 48 buizen), is de eerste buis van de tweede kit geplaatst op locatie E1 van de koeling vervoerder. Wanneer een scherm bestaat uit 4 kits (4 x 24 buizen), de eerste buis van de tweede kit geplaatst op locatie C1, de eerste buis van de derde kit wordt geplaatst in de locatie E1 en de eerste buis van de vierde kit is geplaatst in de locatie G1. Bij het invoegen van de buizen in hun koeling carrier, worden deksels geplaatst op een dienblad na de lay-out van de standaard 96-Wells-landschap. Aangezien goed nummers worden aangeduid op de top van de deksels met de fabrikanten, hierdoor kruiscontroles als alle buizen zijn geplaatst in de juiste volgorde. Dit helpt ook om de juiste deksels op de buizen vervangen bij het invullen van een beperkt aantal platen.
We slaan de vooraf ingevulde platen bij 10 ° C, een compromis invriezen en opslag bij 4 ° C, die leiden verslechtering van de omstandigheden en problemen met de afdichting tot kan te vermijden. Platen worden opgeslagen voor tot enkele maanden met normaal geen merkbare condensatie op de binnenzijde van het zegel. Dat geldt minder voor LMB05, LMB06, LMB09 en LMB10 platen zoals deze voorwaarden met relatief hoge concentraties van vluchtige reagentia (tabel 1 bevatten). Kleine hoeveelheid condensatie aan de binnenkant van het zegel afdichting efficiëntie vermindert en kruisbesmetting tussen putten terwijl de platen ontzegeling kan veroorzaken. Om te helpen met het voorkomen van condensatie tijdens eerste koeling, kunnen de platen eerst vanuit de carrousel in een geïsoleerde picknick koeler, dat is opgeslagen in een koelruimte van 4 ° C's nachts worden overgezet. De zeer langzame afkoeling minimaliseert de ontwikkeling van temperatuurgradiënten binnen de verzegelde putten en vandaar vermindert condensatie algemene15. Bovendien, zodra de platen worden opgeslagen in de 10 ° C incubator, wordt een in-house aangepaste SBS polystyreen deksel gezet op de plaat aan de bovenkant van elke stack (niet afgebeeld).
Het geheel van onze vooraf ingevulde platen kan worden gebruikt als een groot eerste scherm tegen een roman, in water oplosbare, eiwitSteekproef. Als alternatief kunnen minder platen worden geselecteerd om aan specifieke eisen voldoen. Bijvoorbeeld, LMB15 en LMB19 zijn schermen geformuleerd speciaal voor membraan eiwit monsters26,27, of LMB20 is een scherm met zware-atomen om experimentele fasering van diffractie gegevens28 geformuleerd (Zie ook : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formulering van de MORPHEUS eiwit kristallisatie schermen</a>).
2. het opzetten van kristallisatie druppels
Wanneer u het systeem 2, moet screening kits met aanzienlijke hoeveelheid vluchtige reagentia worden verwerkt eerst. Dit vermijdt condensatie vormen op het rubber van de SBS-deksels, die invloed kunnen zijn op de behandeling van de deksel en plaat afdichting. Een SBS-deksel heeft een beetje van goedkeuring wanneer op de bovenkant van een plaat, dat is waarom ze moeten in eerste instantie worden aangepast (Zie Protocol, stap 1.2.6). De dode volumes van eiwit in de putjes van de plaat PCR zijn relatief genereuze (0.8 µL, zie legende van tabel 2). Merk op dat even gul dode volumes worden ingezet bij het gebruik van de dispenser nanoliter individueel met eiwit in 8-well strips (tabel 4). Kleinere dode volumes kan werken, maar sommige monsters voldoen aan de tips, kalibratie van een robot kan worden enigszins onnauwkeurig, de kamer kan worden warmer dan gebruikelijk, enz. Al leiden tot monster verliezen gedekt door de gulle dode volumes om te consolideren van de aanpak.
Recente ontwikkelingen ingeschakeld verdere miniaturisatie van experimenten en dus de hoeveelheid monster nodig voor het screenen van kristallisatie voorwaarden kan aanzienlijk worden verkleind door de integratie van de bijbehorende technologie29,30 . Bepaalde aspecten van verdere miniaturisatie moeten echter zorgvuldig, zoals de verdamping van druppels31 en de manipulatie van microcrystals32.
Ten slotte, centrifugeren van de plaat (2.000 rpm, 1 min) kan worden geïntegreerd als een routine laatste stap bij het instellen van kristallisatie druppels (in sferische boven-wells). Een meer consistente grootte en vorm van druppels als gevolg van centrifugeren kunnen verminderen reproduceerbaarheid kwesties33,34. Zeker, gecentreerd druppels zal verlichten de latere evaluatie van experimenten met behulp van een Microscoop, zoals de vereiste brandpuntsafstand gelijk over de gehele plaat zijn zullen.
3. de voordelen van de methode 4-hoek
Het belangrijkste voordeel van de methode 4-corner is de eenvoud, die minimaliseert fouten en eenvoudige geautomatiseerde protocollen vergemakkelijkt. Bijvoorbeeld, zal de 4 hoekoplossingen altijd worden geplaatst op het dek van een vloeibare handler na de dezelfde lay-out. Ook zijn alle programma's gebaseerd op vaste verhoudingen tussen de oplossingen (Figuur 3 c). Handmatige voorbereiding van de 4 hoekoplossingen verdient de voorkeur aan geautomatiseerde behandeling van oplossingen bij hoge concentraties die zeer viskeuze kunnen. Relatief snel en accuraat aspiratie/verstrekking is dan mogelijk op de meeste soorten vloeibare handlers met minimumeisen voor optimalisatie van vloeibare klassen. Toch, sommige hoekoplossingen mogelijk nog niet al te visceus voor een robot met een vloeistof-systeem efficiënt kan werken. Daarom hebben we gekozen voor een vloeibare handler met verdringerpomp (figuur 3B).
Naast de 2 lineaire verlopen van concentraties, kan een derde component (dat wil zeggen, een aantal buffers/additieven) met een constante concentratie worden getest in een handige manier. Hiervoor is eerst een relatief grote hoeveelheid een kernset van hoekoplossingen op een voldoende hogere concentratie, met uitzondering van het onderdeel worden gevarieerd, bereid. Vervolgens voorraadoplossingen met inbegrip van dit onderdeel wordt toegevoegd aan de eindconcentraties aanpassen. Bijvoorbeeld zijn 50 mL een reeks van 4 hoekoplossingen bereid bij 10% hogere concentraties dan in eerste instantie. Dit basispakket is vervolgens opgesplitst in 5 kleinere subsets van 4. Tot slot, 10% in volume van verschillende buffer-pH oplossingen wordt toegevoegd aan elke deelverzameling.
4. formaten en soorten additieve schermen
De schermen worden normaal gesproken opgeslagen bij-20 ° C (Figuur 4) omdat ze niet regelmatig worden gebruikt en volatile/unstable verbindingen bevatten. Het gebruik van een bevroren additieve scherm opgeslagen in een diep goed blok (1 mL in putten) moet vroeg worden gepland, omdat het duurt 12-24 hr voor alle additieve oplossingen te volledig ontdooien bij kamertemperatuur. Ook een groot aantal gebruikers delen hetzelfde additief scherm, mogelijk veroorzaakt problemen met inbegrip van kruisbesmetting. Tot slot, de hoogte van diep goed blokken maakt ze ongeschikt voor de meeste nanoliter dispensers. Als een handige oplossing voor het omzeilen van deze kwesties, moet het scherm van het diep goed blok worden overgedragen aan laag-profiel platen (Figuur 4).
Historisch, additieve schermen die een breed scala aan enkele reagentia (met enkele concentraties omvatten) geweest zeer populaire35,,36. Echter, andere soorten additieve schermen hebben ontwikkeld die mixen van additieven37 of een beperkt aantal één additieven vinden op verschillende concentraties38 integreren. Tenslotte is een aanvullende benadering om te onderzoeken van het effect van additieven op de monsters voorafgaande aan de kristallisatie39,40.
5. meer overwegingen
Goede praktijken: De meeste schermen schadelijk of zelfs giftige stoffen bevatten en vandaar adequate persoonlijke bescherming moet worden ingezet tijdens de protocollen. Even, bewegende delen van de robots kan leiden tot verwondingen, vooral wanneer het proberen om handmatig een conflict veroorzaakt terwijl een programma wordt uitgevoerd (hoewel de meeste van de robots noodstop/knopsysteem hebben). Vanwege de technische complexiteit betrokken, regelmatige controle van de robots, schermen en programma's met eerder gekenmerkt monsters zijn belangrijk voor de aanhoudende hoge niveaus van reproduceerbaarheid.
Doorvoer: Als een indicatie, tussen 4000 tot 8000 LMB worden platen geproduceerd jaarlijks met het systeem 1 (en vervolgens werknemer door gebruikers voor de eerste screening). Het is niet aangepast aan de voorraad een grote hoeveelheid vooraf ingevulde platen bij 10 ° C wanneer de verwachte omzet veel lager, als na 4-5 maanden, sommige voorwaarden is beginnen zal te verslechteren en verdampen. Verschillende benaderingen van automatisering protocollen zijn doorgevoerd voor kleine tot middelgrote laboratoria41.
Opslaan en de evaluatie van experimenten: Na de voorbereiding van de druppels, worden platen opgeslagen op de planken van de lage-trillingen in een kamer op 4 of 18 ° C met strak gecontroleerde temperatuur (± 0,5 ° C maximale afwijking). Experimenten worden beoordeeld met behulp van koude licht bron microscopen. Verschillende geautomatiseerde beeldvormingssystemen commercieel beschikbaar zijn, maar men moet alle aspecten zorgvuldig overwegen: de snelheid die is vereist voor het scannen van een plaat zullen volstaan voor hoge doorvoersnelheid? Objecten die geen kristallen verstoort autofocus? De resulterende kwaliteit van beelden voldoende zal zijn om ter plaatse zeer kleine kristallen (met name rond de rand van de druppels)? 42 , 43 , 44
Vergelijking van kristallisatie voorwaarden: Na zorgvuldig onderzoek over de aard van de aanvankelijk verkregen kristallen, kunt een trends en overeenkomsten over voorwaarden gebruik van de <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB scherm database</a> of de C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Webtool</a>45analyseren.

Röntgendiffractie wordt uitgebreid toegepast op verder ons begrip van de mechanismen van de biologische en ziekte op het atomaire niveau en vervolgens bij het rationele aanpak van drug discovery1. Voor dit, gezuiverd en geconcentreerde (2-50 mg/mL) macromoleculaire monsters van eiwitten, DNA, RNA, andere liganden en hun complexen zijn trialed want hun neiging om vorm besteld driedimensionale roosters door kristallisatie2,3 ,4. Wanneer hoge kwaliteit kristallen worden verkregen die diffract van x-stralen, kan de kristalstructuur worden opgelost op in de buurt van atomaire resolutie5,6. Cruciaal, de voorwaarden om een nieuwe steekproef kristalliseren niet kan worden voorspeld en de opbrengst van hoge kwaliteit kristallen is meestal zeer laag. Een onderliggende reden is dat veel monsters van belang hebben uitdagende biochemische eigenschappen, waardoor ze unstable op het bijbehorende tijdschema voor de kristallisatie (meestal een paar dagen). Tot slot, het proces wordt nog verergerd door de tijd die nodig is om monsters en varianten van de steekproef te produceren, en voor het optimaliseren van hun zuivering en kristallisatie7,-8.
Een voorwaarde van kristallisatie is een oplossing met een neerslaande dat vermindert de oplosbaarheid van de steekproef en voorwaarden bevatten vaak ook buffers en additieven. Honderden van dergelijke reagentia zijn geschikt om te veranderen van de parameters van de kristallisatie experimenten zoals ze weinig geneigd hebben te bemoeien met monster integriteit (zoals eiwit of nucleïnezuur ontvouwen). Terwijl miljoenen combinaties van kristallisatie reagentia testen is niet haalbaar, is testen verschillende te veel screening kits - geformuleerd met verschillende strategieën9,10 - het mogelijk met verkleinde proeven en geautomatiseerde protocollen. In dit perspectief moet is het meest vatbaar techniek waarschijnlijk damp verspreiding met 100-200 nL druppels zittend op een kleine ruim boven een reservoir met de kristallisatie voorwaarde (25-250 µL), uitgevoerd in gespecialiseerde kristallisatie platen11 , 12. het eiwitSteekproef en voorwaarde die vaak worden gecombineerd in een 1:1 verhouding voor een totaal volume van 200 nL bij het opzetten van de druppels in de bovenste-putten. Robotic nanoliter eiwit kristallisatie kan worden geïmplementeerd met alternatieve technieken en platen zoals de minderjarigen olie batch13 en de Lipidic kubieke fase14 (de laatste een worden specifiek toegepast op trans-membraaneiwitten die zijn zeer slecht oplosbaar in water).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">De kristallisatie faciliteit in het MRC-LMB</a> werd gestart in de vroege 2000s, en een vroege overzicht van onze geautomatiseerde protocollen werd gepresenteerd in 200515. Een historische inleiding aan eiwit kristallisatie werd gepresenteerd en ook een overzicht van de voordelen van robotic nanoliter benaderen (en vervolgens een nieuwe benadering voor routinematige experimenten). Sinds macromoleculaire kristallisatie is in wezen een stochastisch proces met zeer weinig of geen nuttige informatie vooraf, met een breed scala van de initiële voorwaarden op grond (geschikt) verhogen het rendement van kwaliteit diffractie kristallen16. Bovendien, is een vaak vergeten voordeel van een grote aanvangsscherm aanzienlijk te verminderen de noodzaak voor optimalisatie van monsters en kristallen in veel gevallen. Natuurlijk kan een nog moeten gaan met de optimalisering van een aantal initiële voorwaarden later. De concentratie van de reagentia en de pH zijn meestal daarna systematisch onderzocht. Meer reagentia kunnen ook worden ingevoerd in de geoptimaliseerde of meerdere voorwaarden parameters van kristallisatie verder te wijzigen. Zeker, men kristallisatie moet proberen met een vers bereide monster, vandaar de bijbehorende protocollen moet eenvoudig en beschikbaar elk moment.
Hier twee volautomatische systemen ontworpen op het MRC-LMB (systemen 1 en 2) en de bijbehorende protocollen volledig worden beschreven. De belangrijkste toepassing van deze twee systemen is eerste screening door damp diffusie in drop kristallisatie platen zitten. Systeem 1 integreert een vloeibare handler, een geautomatiseerde carrousel op voorraad platen, een inkjet-printer voor het labelen van de plaat en een zelfklevende plaat sealer. Op het systeem 1, zijn 72 96-wells-platen gevuld met verkrijgbare screening kits (80 µL van voorwaarde overgedragen aan reservoir van een startende volume van 10 mL in proefbuizen), label en verzegeld. De platen worden vervolgens opgeslagen in een incubator van de 10 ° C waar ze beschikbaar voor gebruikers op elk gewenst moment (als eerste schermen zijn 'LMB platen' genoemd).
Systeem 2 integreert een vloeibare handler, een nanoliter dispenser en een zelfklevende plaat sealer. Op het systeem 2, druppels (100-1000 nL) zitten voor damp diffusie experimenten worden geproduceerd door het combineren van voorwaarden en het monster in de bovenste-putten van 20 48 - of 96-wells-platen vooraf gevuld met voorwaarden. Dit betekent 1.920 eerste screening voorwaarden trialed bij het gebruik van 20 LMB platen op het systeem 2.
Robots zijn ook individueel gebruikt voor de optimalisatie van de geselecteerde voorwaarden, en de bijbehorende semi-geautomatiseerde protocollen zijn ook beschreven. De 4-hoek methode17 is routinematig aangewend om te produceren optimalisatie schermen. Het bijbehorende protocol vereist eerst de handmatige voorbereiding van 4 oplossingen ('A, B, C en D'). Twee lineaire verlopen van concentraties (voor twee belangrijkste kristallisatie agenten) worden dan automatisch gegenereerd rechtstreeks in de reservoirs van een plaat van kristallisatie. Hiervoor opleidingscyclus een spuit-gebaseerde vloeibare handler de 4 hoekoplossingen in verschillende verhoudingen.
Voor het verder optimaliseren van een voorwaarde, kan een additief schermen die potentieel de eigenschappen van de resulterende kristallen18 verbeterendienst. Twee benaderingen zijn beschikbaar voor additieve screening: een protocol beginnen met additieven in de reservoirs van de kristallisatie platen afgeleverd vóór de oprichting van de druppels (protocol 1) en een ander protocol waar het additieve scherm wordt aangeboden direct op de druppels (protocol 2).
Andere nuttige ontwikkelingen die ingeleid bij het MRC-LMB ter vergemakkelijking van de geautomatiseerde macromoleculaire kristallisatie, worden ook gepresenteerd. In wezen, kristallisatie platen en bijbehorende voorzieningen zoals een stapelbare samenleving van biomoleculaire Screening (SBS) deksel dat minimaliseert verdamping van voorwaarden bij het gebruik van het systeem 2.
Bij beknoptheid, wordt ervan uitgegaan dat gebruikers bekend met de basisfuncties en het onderhoud van de nanoliter dispenser, de inkjetprinter en de zelfklevende plaat sealer zijn. Tenzij anders vermeld, platen op het dek van de robots zijn geplaatst zodat het goed A1 ('A1-corner') is naar de hoek van de rug links van de drager van een plaat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Robots</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freedom EVO&#174;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microlab&#174; STAR&#8482;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&#8482; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mosquito&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dragonfly&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive plate sealer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inkjet printer 9232</td>
			<td>Markem-Imaje</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystallization screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-110</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen 2&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-112</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009530</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009531</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Ammonium Sulfate</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-211</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG/LiCl</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-217</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick Screen&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-221</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Sodium Chloride</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-219</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG 6000</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-213</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; MPD</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-215</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemFac&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-114</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PEG/Ion&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-126</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Natrix&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-116</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen Lite&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Lite screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009536</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009537</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS1</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-101L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS2</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-102L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS3</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-103L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS4</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-104L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS5</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-105L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS6</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-106L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS7</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-107L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS8</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-108L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS9</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-109L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS10</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-110L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Index&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-144</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-107</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 2</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-109</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemStar&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-21</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemSys&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-25</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JCSG-plus&#8482; Suite</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >130720</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-46</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi minimal screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-127</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi-PEG screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; II screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-91</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LMB crystallization screen&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-98</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Additive screens</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT additive screen</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-138</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-93-500</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (500 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-93</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped wells (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100-FX</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped well (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HIPPOCRATES additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>n/a</td>
			<td >48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS&#174; III).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Other consumables</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well MRC 2-drop plate</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MRC 96T-UVP</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >48-well MRC 1-drop plate&#160; (&#39;MAXI plate&#39;)</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MMX01-UVP&#160;</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 &#181;L. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MRC hanging drop seal</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive sealing tape</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR4-50</td>
			<td >3-inch wide Duck&#174; HD Clear&#8482; for sealer and manual sealing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive aluminium sheet</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >538619</td>
			<td >Used to reseal additive screens.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ink cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>9651</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Solvent cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>8652</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L tips&#160;</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>235947</td>
			<td >System 2 (STAR&#8482; liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE&#8482; tips in disposable stacks.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent container</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>194052</td>
			<td >Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate</td>
			<td >Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td >AB-2150</td>
			<td >System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito&#174;). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microsyringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03020</td>
			<td >Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito&#174; nanoliter dispenser (9mm spacing).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >strip-holder block</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >3019-05013</td>
			<td >SSB device for the Mosquito&#174; strips, aka &#39;4-way Reagent Holder&#39;.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03110</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03100</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL syringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07100</td>
			<td >Syringe body and piston for the Dragonfly&#174; liquid handler. Pack of 100.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Troughs/Reservoirs</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07103</td>
			<td >Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly&#174;. Pack of 50.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital microplate shaker</td>
			<td>CamLab Limited</td>
			<td>n/a</td>
			<td >Variomag&#174; for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate mixer</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>3121-01015</td>
			<td>MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology

Wanneer hoge kwaliteit kristallen die diffract van x-stralen worden verkregen, kan de kristalstructuur op in de buurt van atomaire resolutie worden opgelost. De voorwaarden om te kristalliseren eiwitten, Ani, RNAs en hun complexen kunnen echter niet worden voorspeld. Dienst van een breed scala van voorwaarden is een manier om het verhogen van het rendement van kwaliteit diffractie kristallen. Twee volledig geautomatiseerde systemen ontwikkeld op het MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge, Engeland, MRC-LMB) die kristallisatie screening tegen 1.920 uitgangsvoorwaarden vergemakkelijken door damp diffusie in nanoliter druppels. Semi-automatische protocollen zijn ook ontwikkeld om te optimaliseren van voorwaarden door het veranderen van de concentraties van de reagentia, de pH, of door de invoering van additieven die eigenschappen van het resulterende kristallen potentieel te verbeteren. Alle bijbehorende protocollen zullen worden in detail beschreven en kort besproken. Tezamen, hierdoor handig en zeer efficiënte macromoleculaire kristallisatie in een multi-user-faciliteit, terwijl het geven van de gebruikers controle over essentiële parameters van hun experimenten.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Geautomatiseerde systemen en protocollen voor de routinematige bereiding van een groot aantal schermen en nanoliter kristallisatie druppels voor damp diffusie experimenten zijn beschreven en besproken.

Geautomatiseerd protocollen voor macromoleculaire kristallisatie bij het MRC Laboratory of Molecular Biology

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Groeiende eiwit kristallen met verschillende afmetingen, met behulp van geautomatiseerde kristallisatie in combinatie met In Situ Dynamische lichtverstrooiing

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

-Voor-stapmodus zuivering van macromoleculaire complexen met behulp van RNA gekoppeld aan biotine en een foto-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering op moleculair niveau met behulp van robuuste biochemische benaderingen van een nieuwe kinase proteïne

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategische screening en karakterisering van de Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex voor succesvolle kristallisatie

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spotvariatie fluorescentie correlatiespectroscopie voor analyse van moleculaire diffusie op het plasmamembraan van levende cellen

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenese, Klonen, Expressie, Snelle Eiwitzuiveringsprotocollen en Kristallisatie van het Wilde Type en Mutante Vormen van Tryptofaan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Vaste doel seriële gegevensverzameling bij Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Workflow en tools voor kristallografische fragmentscreening in het Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...