Name: automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

L’installation de cristallisation des MRC-LMB est pris en charge par le Medical Research Council (RU). Nous remercions les membres de la LMB pour leur soutien : Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent et Pat Edwards (études structurales), Steve Scotcher et les autres membres de l’atelier mécanique, Neil Grant et Jo Westmoreland (aides visuelles), Paul Hart et Tom Pratt (IT). Nous tenons également à remercier Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart et Heather Ringrose (Hamilton Robotics, UK), Paul Thaw, Robert Lewis et Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Suisse), George Stephens et Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem Imaje, UK) et Graham Harris (l’Agence de Cleveland) pour l’aide technique.

1. les deux systèmes (présélection) entièrement automatisés
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Système 1 : préparation des plaques de 96 puits cristallisation 72 rempli de dépistage kits (plaques LMB)
	<ol>
<li>Avant d’effectuer la procédure, faire en sorte que les robots du système sont initialisées et leur logiciel de contrôle est ouvert. Allumez le refroidisseur du transporteur tube refroidissement environ 30 minutes avant le programme principal sera lancé.</li>
		<li>Placez une plaque d’essai sur le support motorisé de SBS de l’adhésif. Exécutez le film adhésif et vérifiez que le film est correctement appliqué. Répéter ce test deux fois plus que le film adhésif est prêt.</li>
		<li>Puis, ajoutez 20 L d’eau déionisée au conteneur principal du gestionnaire liquid. Débrancher les inserts de couplage du petit récipient (20 % d’éthanol solution de rinçage) et les inserts au conteneur principal.</li>
		<li>Entrez le nom d’écran approprié (tableau 1) sur l’écran tactile l’imprimante jet d’encre. Ensuite, ouvrez et fermez la porte du carrousel pour déclencher la rotation du carrousel. Ouvrir la porte lorsque la première pile se présente.</li>
		<li>Charger complètement la première pile avec 22 plaques de cristallisation, chacune avec revêtement de colonne 1 dehors. Charger complètement les deux cheminées de la même manière.</li>
		<li>Charger les 6 plaques restants dans les postes les plus élevés de la quatrième pile. Ensuite, fermez la porte du carrousel.</li>
		<li>Vérifier que le refroidisseur affiche 14 ° C. Doucement et à plusieurs reprises il faut inverser les kits de dépistage sélectionnée pendant 1 minute. Ensuite, ouvrez le panneau avant du gestionnaire liquid.</li>
		<li>Ouvrir les tubes et les placer dans le support de refroidissement selon la norme-cadre 96 puits (A1, A2, etc.). À placer chaque tube dans le porte-bébé, placer le couvercle sur un plateau dans la même disposition de 96 puits.</li>
		<li>Recouper le tube positions et faire en sorte que tous les tubes sont de niveau et se sont installés dans le porte-bébé. Ensuite, fermez le panneau avant.</li>
		<li>Dans la fenêtre de « Démarrage » du logiciel gestionnaire liquide, sélectionnez « Run maintenance » et ouvrez le programme rinçage. Exécutez le programme afin d’éliminer l’éthanol de 20 % du système et pour laver les surfaces extérieures des conseils de distribution de liquides.</li>
		<li>Lorsque le rinçage est terminé, cliquez sur « Annuler » pour revenir au « Démarrage ». Sélectionnez « Exécuter un processus existant » et cliquez sur « Démarrer votre sélection ». Ouvrez le programme « MRC kit distribution ». Renseignez '18' pour « Instances » dans la configuration de l’écran et lancez le programme.</li>
		<li>Surveiller le système comme les quatre premières plaques sont étiquetés, remplis et scellés.</li>
		<li>Une fois que toutes les 72 plaques ont été élaborés et placés dans le carrousel, placez-vous dans les inserts de couplage du conteneur principal le petit récipient. Exécutez le programme « Start up flush » (voir étape 1.1.10).</li>
		<li>Éteindre le refroidisseur et jeter le vide des tubes de trousse de dépistage. Retirez soigneusement les 72 plaques préparées au carrousel. Jeter les plaques remplies de manière incorrecte ou mal scellés. Stocker les plaques prêtes à l’emploi à 10 ° C.</li>
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Système 2 : mise en place des gouttelettes de cristallisation (protéine de nL 100 + 100 nL condition) d’un seul échantillon dans 20 plaques LMB
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<li>Tout d’abord, veiller à ce que les robots du système sont sur le distributeur nanolitre est initialisé avec son logiciel ouvert et gestionnaire de méthode du gestionnaire liquide est ouvert. Allumez le transporteur microtube-refroidissement environ 15 minutes avant le programme principal sera lancé.</li>
		<li>Placez une plaque d’essai sur le support motorisé de SBS de l’adhésif. Exécuter le film adhésif et vérifier que la plaque est bien scellée. Tester le film adhésif trois fois.</li>
		<li>Ensuite, exécutez le distributeur nanolitres pour définir 100-nL gouttes de solution d’essai dans une coupelle. Vérifier au microscope que les gouttelettes sont correctement définies. Fermez le logiciel de distributeur nanolitre et retirer le bloc de porte-bande depuis le pont.</li>
		<li>Ensuite, insérer dans le support de plaque personnalisée (voir Résultats représentant: cristallisation dispositifs mis au point à la LMB) la plaque de la LMB avec la plus grande quantité relative des réactifs instables dans ses conditions (tableau 1). Retirer la pellicule adhésive de la plaque.</li>
		<li>Ouvrir le panneau avant du gestionnaire liquide et placer la plaque non scellée sur le pont, à l’arrière du premier transporteur coulissant (glissement de transporteurs peut être retiré pour faciliter l’accès).</li>
		<li>Couvrir la plaque avec un couvercle en aluminium SBS. Régler le couvercle vers le coin arrière gauche du transporteur en appliquant une légère pression jusqu'à l’angle opposé du couvercle.</li>
		<li>Desceller, charger dans les transporteurs coulissants et recouvrir les 19 plaques restants de la même façon, travaillant de plus à des conditions moins volatiles. Une fois que le transporteur microtube-refroidissement est à 4 ° C, comme indiqué par une lumière verte, enlevez le couvercle.</li>
		<li>Coupez le couvercle d’un microtube contenant (au moins) 440 µL de l’échantillon de protéine (tableau 2). S’assurer que l’échantillon a sans mousse au-dessus du ménisque, comme cela n’interférera pas avec le système de détection de liquide. Placer le tube dans la Position 1 du transporteur microtube-refroidissement.</li>
		<li>Posez une plaque PCR sur le pont de gestionnaire liquide devant le transporteur adaptateur plaque de terrassement. Ensuite, fermez le panneau avant.</li>
		<li>Après avoir chargé le pont, faire en sorte que le pont de distributeur nanolitre est clair du bloc porte-bande et que les transporteurs à l’arrière les piles d’extrémité 50 µL sont claires des couvercles en aluminium SBS.</li>
		<li>Dans l’interface de « Gestion de la méthode » gestionnaire liquide, sélectionnez « Setup plaques ». Surveiller l’initialisation des deux systèmes, puis renseignez les paramètres d’exécution. Suivez les indications de l’interface de gestion de la méthode (invites, figures et un système de gestion de pointe aide à la préparation).</li>
		<li>Vérifiez que tous les requis de composants sont prêts et puis démarrez le processus.</li>
		<li>Surveiller le système comme le distributeur nanolitres définit les gouttes dans la première plaque et le film adhésif joints par la suite la plaque.</li>
		<li>Une fois que toutes les plaques de 20 ont été élaborés avec des gouttelettes de cristallisation et automatiquement renvoyées aux transporteurs coulissants, ouvrir le panneau avant et retirer délicatement les plaques. Vérifiez que les plaques soient correctement scellés avant leur stockage de cristallisation.</li>
		<li>Nettoyer les couvercles SBS avec une solution d’éthanol à 20 % avant les empilant sur le côté gauche du gestionnaire de stockage liquid. Jeter la plaque PCR et microtube.</li>
		<li>Désactiver le support de refroidissement microtube et essuyer la condensation. Laissez une serviette en papier sur le dessus de la surface plus froide d’absorber plus de condensation. Ensuite, replacez le couvercle du transporteur et refermer le panneau avant.</li>
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</li>
</ol>2. optimisation des conditions
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Axée sur la seringue de liquide gestionnaire : produisant deux dégradés linéaires des concentrations dans les réservoirs d’une plaque de cristallisation (la méthode des 4 coins).
	<ol>
<li>Tout d’abord, assurez-vous que le gestionnaire liquid est activé et initialisé avec son logiciel ouvert.</li>
		<li>Sous le « dégradé » onglet : Ouvrez le programme requis, sélectionnez le type de plaque de cristallisation et le volume final dans les réservoirs (tableau 3). Le paramètre avancé pour « max vol shot » devrait être ramené de 6 000 à 3 000 lors de l’utilisation de solutions contenant [isopropanol] > 10 % v/v et MPD] > 20 % v / v
</li>
		<li>Préparer les seringues. Placez un piston dans chaque seringue (bout pointu vers le bas) et insérez le dos des seringues dans les rainures désignés sous la tête du robot. Tordre une seringue dans le sens horaire pour le bloquer en position (le programme va commencer qu’avec toutes les seringues nécessaires bien fixés).</li>
		<li>Préparer les auges. Retirez le cadre en acier inoxydable et insérer les auges. 4 positions de gauche correspondent aux 4 coins A, B, C, D. commutateur sur « SET UP » onglet qui affiche les volumes des solutions requises dans chaque seringue (le tableau 3, 0,5 volume mort de mL a été ajouté à l’affiche des volumes). Verser les solutions d’angle dans leurs creux respectifs et replacez le cadre sur le pont (l’armature maintient en position avec 2 petits aimants positionnés à l’avant du pont). Une autre manière de procéder à cette étape consiste à verser les solutions dans les auges, lorsqu’ils sont déjà placés sur le pont.
</li>
		<li>Placer la plaque de cristallisation sur le support motorisé de la SBS.</li>
		<li>Cliquez sur « Aspirer » et d’attendre pour cette étape à compléter (lorsque les pistons s’est arrêté sur le chemin vers le haut).</li>
		<li>Basculez vers l’onglet « RUN » et exécuter le programme.</li>
		<li>Une fois le programme terminé, retournez à l’onglet configurer, puis cliquez sur « Supprimer » : le système supprime les seringues de solutions de restes et puis soulève les pistons tout le chemin. « Purger » peut être demandé au lieu de « Supprimer » ; ceci laissera les pistons à la position de fond, prête à aspirer plus de solutions avec les mêmes seringues.
</li>
		<li>Enlever les seringues en tournant dans le sens anti-horaire.</li>
		<li>Jeter les seringues et les creux dans la benne appropriée (ou rincez-les à l’eau désionisée et puis solution à 20 % v/v d’éthanol pour les réutiliser).</li>
		<li>Sceller la plaque et placez-la sur la table de mixage de microplaque pendant 3 min à 1000 tr/min ou 10 min quand des solutions hautement visqueuses sont mixées. La plaque est prête pour la mise en place des gouttelettes de cristallisation sur la distributeur nanolitre.</li>
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Additif 1 (mise en place des gouttelettes de cristallisation dans une plaque à 96 puits cristallisation pré-remplie avec écran additive) de protocole de dépistage
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<li>Tout d’abord, préparer l’État où les concentrations initiales des réactifs a augmenté de 10 % (min. vol. 15 mL lors du transfert de la condition d’un conteneur sur l’écran d’additif avec le gestionnaire de liquid).</li>
		<li>Assurez-vous que le gestionnaire liquid est prêt à fonctionner. Ouvrez le programme « Écran Ajouter aux additifs » pour une seule plaque (entrez le volume dans les réservoirs : 'µL 72 »). Invite, figures et une astuce-gestion système (conseils de 12 x 1 000 µL requis) aide à veiller à ce que le robot est prêt à fonctionner selon les sélections.
</li>
		<li>Récupérer l’écran additive de l’incubateur de-20 ° C et retirer immédiatement son sceau d’en aluminium (utilisez le support de plaque), puis placer la plaque sur le pont du gestionnaire liquid. Le programme fonctionne selon un schéma de portrait (la plaque est placée avec l’A1-angle situé à l’avant gauche du transporteur). Aussi placer aussi le conteneur rempli la condition. Exécutez le programme.</li>
		<li>Une fois les réservoirs de la plaque ont été pourvus, le placer sur un agitateur de microplaque et exécuter le programme. Rincer le récipient de condition avec désionisée éthanol eau et 20 % pour la réutilisation.</li>
		<li>
Mettre en place les gouttelettes sur la distributeur nanolitre. Tout d’abord, desceller la plaque de cristallisation (utilisez le support de plaque). Puis, placez la plaque et la protéine de 8 puits bande en première position du bloc porte-bande. L’onglet « Configuration » sur le logiciel de commande affiche les positions réelles de chaque composant sur le pont. Chargez chaque puits de la bande avec l’échantillon de protéine selon la taille des gouttes nécessaire (tableau 4). Exécuter le programme pour préparer les gouttelettes.
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		<li>Une fois le programme terminé, retirez la plaque du pont et scellez-la immédiatement (utiliser le film adhésif, ruban adhésif large de 3 pouces). Jetez la bandelette dans l’emplacement approprié.</li>
		<li>Évaluer la taille, la forme et le centrage des gouttelettes sous le microscope avant stockage.</li>
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Additif dépistage protocole 2 (mise en place des gouttelettes de cristallisation dans une plaque de 96 puits cristallisation avec un écran additif réutilisable)
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<li>Tout d’abord, préparer l’écran additif : laisser la plaque de culture cellulaires congelés de 96 puits correspondant à décongeler à température ambiante pendant 40 min. Puis, centrifuger l’écran additif à 1 000 x g pendant 2 min.</li>
		<li>Préparer la condition (min. vol. 15 mL lors du transfert de la condition d’un conteneur sur l’écran d’additif avec le gestionnaire de liquid).</li>
		<li>Remplir les réservoirs d’une plaque 96 puits cristallisation avec la condition. Sur le liquide-gestionnaire, procéder de la même manière que le protocole 1, étape 2.2.2, mais entrez '80 µL » pour le volume dans les réservoirs.</li>
		<li>Mettre en place les gouttelettes sur la distributeur nanolitre avec 3 composantes sur le pont (la plaque contenant l’additif écran, ainsi que la plaque de cristallisation et de la bande de 8 puits protéine en première position du bloc porte-bande, tableau 4).</li>
		<li>Sceller la plaque de culture cellulaire contenant l’écran avec une feuille d’aluminium et placez-le dans l’incubateur de-20 ° C.</li>
		<li>Évaluer la taille, la forme et le centrage des gouttelettes sous le microscope avant stockage.</li>
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Nous déclare par les présentes un intérêt commercial contradictoire puisque LifeArc commercialise les éléments suivants : le 96 et 48-puits MRC assiettes, le joint suspendu MRC, les écrans de cristallisation MORPHEUS, Pi, ANGSTROM et LMB.

1 - préparation et utilisation des dépistages initiaux stockés en plaques
Trousses de dépistage doit être mélangé avant d’être distribués en plaques car légère séparation de phase ou de précipitations se produit dans quelques tubes pendant le stockage. Quand un écran est composé de deux kits (tubes 2 x 48), le premier tube du second kit est placé dans emplacement E1 du transporteur refroidissement. Quand un écran est composé de 4 kits (4 x 24 tubes), le premier tube du second kit est placé dans emplacement C1, le premier tube du troisième kit est placé dans l’emplacement E1 et le premier tube du quatrième kit est placé dans l’emplacement G1. Tout en insérant des tubes dans leur entreprise de refroidissement, les couvercles sont placés sur un plateau suite à la mise en page standard 96 puits paysage. Car bien numéros sont indiqués sur le dessus des couvercles par les fabricants, cela permet de recouper si tous les tubes ont été placés dans le bon ordre. Cela permet également de remplacer les couvercles correctes sur les tubes lors du remplissage d’un nombre réduit de plaques.
Nous stockons les plaques pré-rempli à 10 ° C, un compromis pour éviter la congélation et stockage à 4 ° C qui peut causer une détérioration des conditions et des problèmes avec étanchéité. Plaques sont stockées pendant plusieurs mois avec normalement sans condensation visible sur la face intérieure du joint. C’est moins vrai pour les plaques de LMB05, LMB06, LMB09 et LMB10, car ceux-ci contiennent des conditions avec des concentrations relativement élevées de réactifs instables (tableau 1). Petite quantité de condensation sur la face interne du joint réduit étanchéité et peut engendrer une contamination croisée entre les loges tandis qu’apposés les plaques. Pour aider à prévenir la condensation pendant le refroidissement initial, plaques peuvent être transférées d’abord au carrousel dans un pique-nique isotherme glacière qui est stocké dans une chambre froide de 4 ° C durant la nuit. Le refroidissement très lent réduit le développement des gradients de température dans les puits scellés et donc réduit la condensation globale15. En outre, une fois que les plaques sont stockées dans un incubateur à 10 ° C, un couvercle de polystyrène SBS personnalisé interne est placé sur la plaque en haut de chaque pile (non illustré).
L’ensemble de nos assiettes remplies au préalable peut être utilisé comme un grand écran initial contre un échantillon de protéines solubles dans l’eau, roman. Par ailleurs, moins de plaques peuvent être sélectionnés pour répondre aux besoins spécifiques. Par exemple, LMB15 et LMB19 sont des écrans formulées spécialement pour les protéines de membrane échantillons26,27, ou LMB20 est un écran formulé avec des atomes lourds pour faciliter l’élimination expérimentale de la diffraction données28 (voir aussi : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formulation des protéines MORPHEUS cristallisation écrans</a>).
2. mise en place des gouttelettes de cristallisation
Lorsque vous utilisez le système 2, kits avec des quantités importantes de réactifs instables de dépistage doit être traitée en premier. Cela évite la condensation sur le caoutchouc des couvercles SBS, qui pourrait affecter la manipulation du couvercle et plaque d’étanchéité. Un couvercle SBS a un peu d’espace libre lorsque sur le dessus d’une plaque, c’est pourquoi ils doivent être alignés au départ (voir le protocole, étape 1.2.6). Les volumes morts de protéine dans les puits de la plaque de la PCR sont relativement généreux (0,8 µL, voir la légende du tableau 2). Notez que tout aussi généreux volumes morts sont employés lorsque vous utilisez le distributeur nanolitres individuellement avec les protéines en bandes de 8 puits (tableau 4). Petits volumes morts peut fonctionner, cependant certains échantillons respectent les conseils, étalonnage d’un robot peut devenir légèrement inexacte, la salle peut être plus chaude que d’habitude, etc.. Toutes mènent à des pertes d’échantillon couvertes par les généreux volumes morts afin de consolider l’approche.
Développements récents a permis plus loin la miniaturisation des expériences et par conséquent le volume d’échantillon requis pour le dépistage des conditions de cristallisation peut être significativement réduit en intégrant la technologie correspondante29,30 . Cependant, certains aspects de la miniaturisation de plus besoin d’un examen minutieux, tels que l’évaporation des gouttelettes31 et la manipulation des microcristaux32.
Enfin, la centrifugation de la plaque (2 000 tr/min, 1 min) pourrait être intégrée comme une étape de routine lorsque vous configurez des gouttelettes de cristallisation (en sphériques supérieure-puits). Taille et leur forme de gouttelettes résultant de la centrifugation plus cohérente peuvent réduire la reproductibilité questions33,34. Sûrement, gouttes centrés facilitera l’évaluation ultérieure des expériences à l’aide d’un microscope car la distance focale nécessaire sera similaire dans l’ensemble de la plaque entière.
3. les avantages de la méthode 4-coin
L’avantage plus important de la méthode 4-coin réside dans sa simplicité, ce qui minimise les erreurs et facilite les protocoles automatisés simples. Par exemple, les solutions de 4 angle seront toujours placées sur le pont d’un gestionnaire liquid suivant la même présentation. Aussi, tous les programmes sont basés sur des rapports fixes entre les solutions (Figure 3). Manuel de préparation des solutions 4 coin est préféré au traitement automatisé des solutions à des concentrations élevées qui peuvent être fortement visqueuses. Il est alors possible sur la plupart des types de gestionnaires de liquides avec des exigences minimales pour l’optimisation des classes liquides d’aspiration/distribution relativement rapide et précise. Néanmoins, certaines solutions d’angle est peut-être encore trop visqueuses pour un robot fonctionnant avec un liquide-système de fonctionner efficacement. C’est pourquoi nous avons opté pour un gestionnaire liquid fonctionnant avec déplacement positif (Figure 3 b).
Outre les 2 dégradés linéaires, des opérations de concentration, un troisième volet (c.-à-d., un ensemble de tampons/additifs) peut être testé à une concentration constante d’une manière pratique. Pour ce faire, un volume relativement important d’un ensemble de solutions d’angle à une concentration appropriée, à l’exclusion de la composante de faire varier, on prépare tout d’abord. Solutions courantes, y compris ce composant est ensuite rajouté pour ajuster les concentrations finales. Par exemple, 50 mL d’un ensemble de 4 solutions d’angle sont préparés à des concentrations supérieures à 10 % celles initialement. Cette série de base est ensuite divisée en 5 sous-ensembles de 4. Enfin, 10 % en volume des solutions tampon pH différent est ajouté à chaque sous-ensemble.
4. les formats et types d’écrans additifs
Les écrans sont normalement stockés à-20 ° C (Figure 4), car ils ne sont pas utilisés régulièrement et contiennent des composés volatiles/unstable. L’utilisation d’un écran additif congelé stocké dans un bloc de puits profonds (1 mL dans les puits) doit être planifiée dès le début parce qu’il faudra de 12 à 24 heures pour toutes les solutions additives décongeler complètement à température ambiante. Aussi, une multitude d’utilisateurs partagent le même écran additif, pouvant causer des problèmes avec la contamination croisée. Enfin, la hauteur des blocs de puits profonds qui les rend impropres pour la plupart des distributeurs de nanolitre. Comme une solution pratique pour contourner ces problèmes, l’écran doit être transférée du puits profond bloc à profil bas plaques (Figure 4).
Des écrans additifs incluent une grande variété de réactifs simples (avec des concentrations unique) ont toujours été très populaire35,36. Toutefois, autres types d’écrans additifs ont été développés qui intègrent les mélanges d’additifs37 ou un nombre réduit d’additifs unique à différentes concentrations,38. Enfin, une approche complémentaire est d’étudier l’effet des additifs sur les échantillons avant cristallisation39,40.
5. autres considérations
Bonnes pratiques : La plupart des écrans contiennent des substances dangereuses ou toxiques même et donc protection individuelle adéquats doit être employée pendant les protocoles. Également, pièces des robots mobiles peuvent entraîner des blessures, surtout lorsque vous essayez d’intervenir manuellement alors qu’un programme s’exécute (bien que la plupart des robots ont système/bouton d’arrêt d’urgence). À cause des complexités techniques impliquées, régulières vérifiant des robots, des écrans et des programmes avec caractérisait auparavant échantillons testés sont importants pour des niveaux élevés soutenus de reproductibilité.
Débit : À titre indicatif, entre 4 000 à 8 000 LMB tôles sont produites chaque année avec le système 1 (et par la suite employées par les utilisateurs pour le dépistage initial). Il n’est pas adapté au stock une grande quantité de plaques pré-rempli à 10 ° C lorsque le chiffre d’affaires escompté est beaucoup plus faible, comme après 4-5 mois, certaines conditions commencera à se détériorer et s’évaporer. Différentes approches aux protocoles d’automatisation ont été appliquées pour les laboratoires de petites à moyennes,41.
Stockage et évaluer les expériences : Après avoir préparé les gouttelettes, plaques sont stockés sur des étagères de bas-vibration dans une chambre à 4 ou 18 ° C et température étroitement contrôlée (+/-écart maximal de 0,5 ° C). Des expériences sont évaluées à l’aide de microscopes de source de lumière froide. Divers systèmes d’imagerie automatisées sont disponibles dans le commerce, mais on devrait considérer soigneusement tous les aspects : la vitesse requise pour analyser une plaque sera suffisante pour un débit élevé ? Objets autres que les cristaux n’interférera avec autofocus ? La qualité qui en résulte des images sera suffisante pour spot très petits cristaux (surtout sur le pourtour des gouttelettes) ? 42 , 43 , 44
Comparaison des conditions de cristallisation : Après enquêtes prudents quant à la nature des cristaux obtenus au départ, on peut analyser les tendances et les similitudes dans l’ensemble des conditions à l’aide de la <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">base de données LMB écran</a> ou la C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Webtool</a>45.

Cristallographie aux rayons x est largement appliquée pour faire progresser notre compréhension des mécanismes biologiques et la maladie au niveau atomique et d’aider par la suite des approches rationnelles de drogue découverte1. Pour ce faire, purifié et échantillons macromoléculaires (2 à 50 mg/mL) concentré de protéines, ADN, ARN, autres ligands et leurs complexes sont testés pour leur propension à former commandé des grilles tridimensionnelles par cristallisation2,3 ,4. Lorsque des cristaux de haute qualité sont obtenus qui diffracter des rayons x, la structure cristalline peut être résolue à près de résolution atomique5,6. Fondamentalement, les conditions de cristalliser un nouvel échantillon ne peuvent être prédit et le rendement des cristaux de haute qualité est généralement très faible. Une raison est que plusieurs échantillons d’intérêt ont des propriétés biochimiques difficiles, qui les rendent instables à l’échelle de temps correspondante pour la cristallisation (généralement quelques jours). Enfin, le processus est aggravé par le temps nécessaire pour produire des échantillons et des variantes de l’échantillon et d’optimiser leur purification et cristallisation7,8.
Une condition de cristallisation est une solution avec un précipitant qui réduit la solubilité de l’échantillon, et conditions contiennent souvent aussi des tampons et additifs. Des centaines de ces réactifs sont bien adaptés pour modifier les paramètres de l’expériences de cristallisation, comme ils l’ont faible propension à interférer avec l’intégrité des échantillons (tels que des protéines ou des acides nucléiques qui se déroulent). Alors qu’il n’est pas possible de tester des millions de combinaisons de réactifs de cristallisation,,10 - plusieurs à plusieurs kits de dépistage - formulés avec diverses stratégies9essais est possible avec essais miniaturisés et protocoles automatisés. Dans cette perspective, la technique plus favorable est probablement diffusion de la vapeur avec des gouttelettes de nL 100-200 assis sur un petit puits au-dessus d’un réservoir contenant l’état de cristallisation (25-250 µL), mis en œuvre dans la cristallisation spécialisées plaques11 , 12. l’échantillon de protéine et l’État sont souvent combinés dans un rapport 1:1 pour un volume total de 200 nL lorsque vous configurez les gouttelettes dans les puits supérieur. La cristallisation de protéines nanolitres robotique peut être implémentée avec des techniques alternatives et plaques telles que le pétrole sous lot13 et la Phase cubique lipidiques14 (la dernière étant appliquée spécifiquement à des protéines membranaires qui sont très peu solubles dans l’eau).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">L’installation de cristallisation à la MRC-LMB</a> a débuté dans les années 2000 et un résumé au début de nos protocoles automatisés a été présenté en 200515. Une introduction historique à la cristallisation de protéines a été présentée et aussi un aperçu des avantages de robotique nanolitres approche (puis une nouvelle approche à l’expérimentation systématique). Depuis macromoléculaire cristallisation est essentiellement un processus stochastique avec peu ou pas utile information préalable, qui emploient une grande variété de conditions initiales (adaptées), augmenter le rendement de qualité diffraction cristaux16. En outre, un avantage souvent négligée d’un grand écran initial est de réduire considérablement le besoin d’optimisation des échantillons et des cristaux dans de nombreux cas. Bien sûr, on peut toujours avoir besoin de procéder à l’optimisation de certaines conditions initiales plus tard. En général, la concentration des réactifs et le pH sont ensuite systématiquement étudié. Plus réactifs peuvent également être introduits dans l’ou les conditions optimisée de plus modifier paramètres de cristallisation. Certes, on devrait essayer de cristallisation auprès d’un échantillon fraîchement préparé, c’est pourquoi les protocoles correspondants doivent être simples et disponibles n’importe quel moment.
Ici, deux entièrement automatisée des systèmes conçus à la MRC-LMB (circuits 1 et 2) et les protocoles correspondants sont décrits en détail. L’application principale de ces deux systèmes est initiale de dépistage par la diffusion de la vapeur en séance les plaques de cristallisation de goutte. Système 1 intègre un gestionnaire de liquid, un carrousel automatisé aux plaques de stock, une imprimante jet d’encre pour l’étiquetage de la plaque et un film adhésif adhésive. Sur le système 1, 72 plaques à 96 puits sont remplis avec les kits de dépistage disponibles dans le commerce (80 µL de condition transférée au réservoir d’un volume de 10 mL dans des éprouvettes de départ), étiquetés et scellées. Les plaques sont ensuite stockés dans un incubateur à 10 ° C où ils sont accessibles aux utilisateurs à tout moment (comme initiales écrans appelés « Plaques LMB »).
Système 2 intègre un gestionnaire de liquid, un distributeur nanolitre et un film adhésif adhésive. Sur le système 2, assis de gouttelettes (100-1 000 nL) pour les expériences de diffusion de vapeur sont produites en combinant les conditions et l’échantillon dans les haut-puits de 20 plaques de 48 ou 96 puits pré-remplis avec conditions. Cela signifie que 1 920 conditions de présélection sont mis à l’essai lors de l’utilisation de 20 plaques LMB sur le système 2.
Robots sont également utilisés individuellement pour l’optimisation de certaines affections, et les protocoles semi-automatisé correspondantes sont également décrites. La méthode 4-coin17 est employé couramment pour produire des écrans de l’optimisation. Le protocole correspondant nécessite tout d’abord la préparation manuelle de 4 solutions (« A, B, C et D »). Deux gradients linéaires des concentrations (pour les deux agents principaux de la cristallisation) sont ensuite automatiquement générées directement dans les réservoirs d’une plaque de cristallisation. Pour ce faire, un gestionnaire de liquid axée sur la seringue distribue les solutions de 4 angle à différentes proportions.
Afin d’optimiser une condition, on peut employer écrans additifs potentiellement améliorer les propriétés du résultant cristaux18. Il existe deux approches pour le dépistage de l’additif : un protocole commençant par additifs dispensés dans les réservoirs des plaques de cristallisation avant de configurer les gouttelettes (protocole 1) et un autre protocole où l’écran additif est dispensé directement sur les gouttelettes (protocole 2).
Autres développements utiles qui ont été lancés dans la MRC-LMB pour faciliter la cristallisation macromoléculaire automatisée, sont également présentés. Essentiellement, les plaques de cristallisation et périphériques associés, tels qu’un empilable société de Biomolecular Screening (SBS) couvercle qui minimise évaporation des conditions lorsque vous utilisez le système 2.
Par souci de brièveté, on suppose que les utilisateurs sont familiers avec les fonctions de base et l’entretien de distributeur nanolitre, l’imprimante jet d’encre et le film adhésif adhésive. Sauf indication contraire, les plaques sur le pont des robots sont positionnés tel que le puits A1 (« A1-coin ») est vers l’arrière à gauche d’un support de plaque.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Robots</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freedom EVO&#174;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microlab&#174; STAR&#8482;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&#8482; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mosquito&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dragonfly&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive plate sealer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inkjet printer 9232</td>
			<td>Markem-Imaje</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystallization screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-110</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen 2&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-112</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009530</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009531</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Ammonium Sulfate</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-211</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG/LiCl</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-217</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick Screen&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-221</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Sodium Chloride</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-219</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG 6000</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-213</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; MPD</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-215</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemFac&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-114</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PEG/Ion&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-126</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Natrix&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-116</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen Lite&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Lite screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009536</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009537</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS1</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-101L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS2</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-102L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS3</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-103L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS4</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-104L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS5</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-105L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS6</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-106L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS7</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-107L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS8</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-108L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS9</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-109L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS10</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-110L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Index&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-144</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-107</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 2</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-109</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemStar&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-21</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemSys&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-25</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JCSG-plus&#8482; Suite</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >130720</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-46</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi minimal screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-127</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi-PEG screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; II screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-91</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LMB crystallization screen&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-98</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Additive screens</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT additive screen</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-138</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-93-500</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (500 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-93</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped wells (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100-FX</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped well (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HIPPOCRATES additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>n/a</td>
			<td >48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS&#174; III).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Other consumables</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well MRC 2-drop plate</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MRC 96T-UVP</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >48-well MRC 1-drop plate&#160; (&#39;MAXI plate&#39;)</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MMX01-UVP&#160;</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 &#181;L. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MRC hanging drop seal</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive sealing tape</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR4-50</td>
			<td >3-inch wide Duck&#174; HD Clear&#8482; for sealer and manual sealing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive aluminium sheet</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >538619</td>
			<td >Used to reseal additive screens.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ink cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>9651</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Solvent cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>8652</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L tips&#160;</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>235947</td>
			<td >System 2 (STAR&#8482; liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE&#8482; tips in disposable stacks.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent container</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>194052</td>
			<td >Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate</td>
			<td >Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td >AB-2150</td>
			<td >System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito&#174;). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microsyringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03020</td>
			<td >Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito&#174; nanoliter dispenser (9mm spacing).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >strip-holder block</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >3019-05013</td>
			<td >SSB device for the Mosquito&#174; strips, aka &#39;4-way Reagent Holder&#39;.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03110</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03100</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL syringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07100</td>
			<td >Syringe body and piston for the Dragonfly&#174; liquid handler. Pack of 100.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Troughs/Reservoirs</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07103</td>
			<td >Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly&#174;. Pack of 50.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital microplate shaker</td>
			<td>CamLab Limited</td>
			<td>n/a</td>
			<td >Variomag&#174; for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate mixer</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>3121-01015</td>
			<td>MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology

Lorsque des cristaux de haute qualité sont obtenus qui diffracter des rayons x, la structure cristalline peut être résolue à près de résolution atomique. Les conditions de cristallisation des protéines, ADN, ARN, ainsi que leurs complexes ne peuvent toutefois pas être prédite. Utilisant une large variété de conditions est un moyen d’augmenter le rendement des cristaux par diffraction de qualité. Deux systèmes entièrement automatisés ont été développés à la MRC laboratoire de biologie moléculaire (Cambridge, Angleterre, MRC-LMB) qui facilitent le dépistage cristallisation de 1 920 conditions initiales par diffusion de la vapeur en gouttelettes nanolitre. Semi-automatisé protocoles ont également été développés pour optimiser les conditions en changeant les concentrations des réactifs, le pH, ou en introduisant des additifs potentiellement améliorent les propriétés des cristaux qui en résulte. Tous les protocoles correspondants seront décrites en détail et discute brièvement. Pris ensemble, ils permettent la cristallisation macromoléculaire pratique et très efficace dans une installation multi-utilisateurs, tout en donnant aux utilisateurs un contrôle sur les paramètres clés de leurs expériences.

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Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

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