Name: automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

MRC-LMB krystallisering anlegget er vennlig støttes av Medical Research Council (UK). Vi takker medlemmer av LMB for deres støtte: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent og Pat Edwards (strukturelle studier), Steve Scotcher og de andre medlemmene av mekaniske verksted, Neil Grant og Jo Westmoreland (visuelle hjelpemidler), Paul Hart og Tom Pratt (det). Vi vil gjerne takke Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart og Heather Ringrose (Hamilton Robotics, UK), Paul Thaw, Robert Lewis og Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Sveits) George Stephens og Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem Imaje, UK) og Graham Harris (The Cleveland Agency) for teknisk hjelp.

1. to helautomatisk systemer (første screening)
<ol><li>
System 1: Forberedelse av 72 96-brønns krystallisering plater fylt med screening kits (LMB plater)
	<ol>
<li>Før du utfører prosedyren, sikre at systemets roboter er initialisert og deres kontrollerende programvare er åpen. Aktivere chiller av rør-nedkjøling transportør ca 30 minutter før den viktigste programmet startes.</li>
		<li>Plass en test plate på motorisert SBS bærer av platen sealer. Kjøre platen sealer og sjekk at filmen er riktig anvendt. Gjenta denne testen to ganger mer for å kontrollere at platen sealer er klar.</li>
		<li>Deretter legge til 20 L deionisert vann viktigste beholderen til den flytende handler. Koble kopling skivene fra den liten beholderen (20% etanol skylling løsning) og koble skivene viktigste beholderen.</li>
		<li>Angi passende navnet (tabell 1) på inkjet-skriver berøringsskjermen. Deretter åpner og lukker karusellen døren for å utløse karusellen rotasjon. Åpne døren når første stabelen presenterer seg.</li>
		<li>Fullt laste første bunken med 22 krystallisering plater, hver med kolonne 1 vendt ut. Fullt laste neste to stabler på samme måte.</li>
		<li>Legg resterende 6 platene i de høyeste stillingene i fjerde stabelen. Lukk deretter døren karusellen.</li>
		<li>Kontroller at det chiller viser 14 ° C. Forsiktig og gjentatte ganger invertere det merkede screening kits i 1 minutt. Deretter åpne frontpanelet på flytende behandleren.</li>
		<li>Åpne rør og plassere dem i kjøling transportøren ifølge 96-brønns standardoppsettet (A1, A2, etc.). Ved å plassere hver rør i transportøren, plassere sin lokket på et brett i oppsettet for samme 96-brønnen.</li>
		<li>Kryssjekke røret posisjoner og sikre at alle rør nivå og slo seg ned i holderen. Lukk frontpanelet.</li>
		<li>I vinduet "Oppstart" av flytende handler programvare Velg "Kjør vedlikehold" og åpne programmet rødme. Kjør programmet å spyle 20% etanol fra systemet og vaske outsides væske-dispensing tips.</li>
		<li>Når tømming er fullført, klikk 'Avbryt' Hvis du vil gå tilbake til "Oppstart". Velg "Kjør en eksisterende prosess" og klikk "Start valget". Åpne programmet 'MRC kit dispensing'. Fyll ut '18' for 'tilfeller"konfigurasjonen skjermen og kjøre programmet.</li>
		<li>Overvåke systemet som første fire platene er merket, fylt, og forseglet.</li>
		<li>Når alle 72 platene er utarbeidet og tilbake i karusellen, bytte kopling skivene fra beholderen viktigste liten beholderen. Kjøre programmet "Starte opp flush" (se trinn 1.1.10).</li>
		<li>Slå av kjøleren og forkaste tomme screening kit rør. Fjern forsiktig 72 forberedt platene fra karusellen. Forkast fylt med feil eller dårlig-forseglet plater. Lagre klar-å-bruke platene på 10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
System 2: definere krystallisering dråper (100 nL protein + 100 nL tilstand) fra et enkelt eksempel på 20 LMB plater
	<ol>
<li>Forsikre at systemets roboter er på nanoliter dispenser initialiseres med programvaren åpent og det flytende hånd metoden manager er åpen. Slå på microtube-kjøling carrier cirka 15 minutter før den viktigste programmet startes.</li>
		<li>Plass en test plate på motorisert SBS bærer av platen sealer. Kjøre platen sealer og kontroller at platen er ordentlig lukket. Teste platen sealer tre ganger.</li>
		<li>Deretter Kjør nanoliter dispenser angir 100-nL dråper av test løsning i en test-plate. Sjekk under et mikroskop at dråpene er angitt riktig. Lukk nanoliter dispenser programvaren og fjerne strip-holderen blokken fra kortstokken.</li>
		<li>Deretter inn i spesialdesignede plate holderen (se Representant resultater: krystallisering enheter utviklet ved LMB) LMB platen med høyeste relative antall flyktige reagenser i vilkårene (tabell 1). Fjerne lim fra platen.</li>
		<li>Åpne frontpanelet flytende handler og utette platen på dekk, bak første skyve transportør (skyve bærere kan trekkes ut for enkel tilgang).</li>
		<li>Dekk platen med en SBS aluminium lokket. Utligne lokket mot bakre venstre hjørne av transportøren ved å bruke lett trykk mot motsatt hjørne av lokket.</li>
		<li>Fjerne forseglingen laste inn skyve bærere og dekke gjenværende 19 platene i samme måte, arbeider fra mest til minst flyktige forhold. Når microtube-kjøling transportøren er 4 ° C, som indikert av et grønt lys, fjerne coveret.</li>
		<li>Klipp av lokket av en microtube som inneholder (minst) 440 µL av protein utvalg (tabell 2). Kontroller at utvalget har ingen skum over meniscus, som dette vil forstyrre væske oppdagelsen system. Sett røret i posisjon 1 av microtube-nedkjøling transportør.</li>
		<li>Plass en PCR-plate på flytende handler dekk foran plate bevegelse kortet bærer. Lukk frontpanelet.</li>
		<li>Etter lasting dekk, sikre at nanoliter dispenser dekk er tomt for stripe-holderen blokken og at bærere bak 50-µL tips stabler er klar av aluminium SBS lokkene.</li>
		<li>Flytende handler "metoden" administrasjonsgrensesnitt, velg 'Setup plater'. Overvåke initialiseringen av begge systemene og fylle inn løpe parameterne. Følg retningslinjene i metoden administrasjonsgrensesnitt (ledetekster, tall og et tips-management system hjelp med forberedelse).</li>
		<li>Kontroller at alle nødvendige komponenter er klar, og deretter starte prosessen.</li>
		<li>Overvåke systemet som nanoliter dispenser angir dråper i første plate og plate sealer senere tetter platen.</li>
		<li>Når alle 20 platene er forberedt med krystallisering dråper og automatisk tilbake til skyve bærere, åpne frontpanelet og Fjern platene. Kontroller at platene er riktig forseglet før lagre dem for krystallisering.</li>
		<li>Rengjør SBS lokkene med en 20% etanol løsning før stable dem på venstre side av flytende håndteringsfunksjonen for lagring. Kast PCR platen og microtube.</li>
		<li>Slå av microtube-kjøling bærer og tørke kondens. La et papirhåndkle på kjøligere overflaten å absorbere ytterligere kondens. Deretter erstatte carrier dekselet og lukke frontpanelet.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. optimalisering av vilkårene
<ol><li>
Sprøyte-baserte flytende handler: produsere to lineære graderinger av konsentrasjoner i reservoarer av en krystallisering plate (4-hjørnet-metoden).
	<ol>
<li>Forsikre at flytende behandleren er på og initialisert med programvaren åpen.</li>
		<li>På "GRADIENT" kategorien: åpne programmet nødvendig, Velg hvilken krystallisering plate og det siste bindet i reservoarene (tabell 3). Avansert innstillingen for 'max skutt vol' bør reduseres fra 6000 til 3000 ved løsninger som inneholder [isopropanol] > 10% v/v og [MPD] > 20% v / v.
</li>
		<li>Forberede sprøyter. Plasser et stempel i hver sprøyten (spisse ender ned) og inn på baksiden av sprøyter utpekte grooves under roboten hodet. Tvinn sprøyte klokkeretning for å låse det i posisjon (programmet starter bare med alle nødvendige sprøyter festet).</li>
		<li>Forberede daler. Ta rustfritt stål rammen og sett på trau. De 4 posisjonene til venstre tilsvarer de 4 hjørnene A, B, C, D. bytte til "Satt opp"-kategorien som viser volum av lobbyer i hver sprøyten (på tabell 30,5 mL døde volumet ble lagt til volumene vises). Hell hjørne løsningene i deres respektive daler og plasser rammen tilbake på dekk (rammen holder i posisjon med 2 små magneter ligger foran dekk). En alternativ måte å fortsette med dette er å helle løsninger til trau når de plasseres allerede på dekket.
</li>
		<li>Sted krystallisering plate motorisert SBS transportøren.</li>
		<li>Klikk "Sug opp" og vent for dette trinnet fullføres (når stempler stoppet på vei opp).</li>
		<li>Bytt til kategorien "Kjør" og kjører programmet.</li>
		<li>Ved ferdigstillelse av programmet, gå tilbake til kategorien Oppsett og klikk "Fjern": systemet tømmer sprøyter fra leftover løsninger, og deretter heiser stempler oppover. 'Tøm' kan kreves i stedet for 'Fjern', dette vil forlate stempler nederst posisjon, klar inneholder flere løsninger med samme sprøyter.
</li>
		<li>Fjerne sprøyter ved å vri dem mot klokken.</li>
		<li>Forkaste sprøyter og trau i den aktuelle hyllen (eller skyll med deionisert vann og 20% v/v etanol løsning for gjenbruk).</li>
		<li>Seal platen og plassere den på microplate blandebatteri for 3 min på 1000 rpm eller 10 min da tankeren løsninger er blandes. Platen er klar for å sette opp krystallisering dråper på nanoliter dispenser.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Additiv screening protokoll 1 (sette opp krystallisering dråper i en 96-brønns krystallisering plate forhåndsutfylt med additiv skjermen)
	<ol>
<li>Først forberede tilstanden med første konsentrasjoner av reagenser økte med 10% (min. vol. 15 mL ved overføring tilstanden fra en beholder på additiv skjermen med det flytende hånd).</li>
		<li>Kontroller at den flytende behandleren er klare til bruk. Åpne programmet 'Legg til skjermen til tilsetningsstoffer' for en enkelt plate (Angi volum i reservoarene: '72 µL'). Spørsmål, figurer og en tips-management system (12 x 1000 µL tips kreves) hjelp med roboten er klar å operere i henhold til valgene.
</li>
		<li>Hente additiv skjermen settefiskanlegg 20 ° C og fjerne dens aluminium segl umiddelbart (bruk plate holderen), og Plasser platen på dekket av flytende behandleren. Programmet opererer etter en stående oppsett (platen plasseres med A1-hjørnet ligger foran til venstre av transportøren). Også plassere også beholderen fylt med tilstanden. Kjør programmet.</li>
		<li>Når reservoarene av plate har blitt fylt, plasserer den på microplate shaker og kjøre programmet. Skyll av tilstand med deionisert vann og 20% etanol for gjenbruk.</li>
		<li>
Sette opp dråpene på nanoliter dispenser. Først fjerne forseglingen krystallisering plate (bruk plate abonnenten). Deretter sted platen og 8-og protein stripe i første posisjon av strip-holderen blokken. 'Setup' kategorien kontrollere programvare viser faktiske plasseringen av hver komponent på dekk. Laste hver godt av stripe med protein prøve avhengig slipp kreves (Tabell 4). Kjøre programmet å forberede dråper.
</li>
		<li>Ved ferdigstillelse av programmet, Fjern platen fra kortstokken og forsegle den umiddelbart (bruk plate sealer, 3-tommen bred teip). Kast stripe i den aktuelle hyllen.</li>
		<li>Vurdere størrelse, form, og sentrering av dråper under mikroskopet før lagring.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Additiv screening protokoll 2 (sette opp krystallisering dråper i en 96-brønns krystallisering plate med gjenbrukbare additiv skjerm)
	<ol>
<li>Først forberede skjermbildet additiv: La tilsvarende frosne 96-brønns celle kultur plate å tine ved romtemperatur for 40 min. Deretter sentrifuge additiv skjermen 1000 x g i 2 minutter.</li>
		<li>Forberede betingelsen (min. vol. 15 mL ved overføring tilstanden fra en beholder på additiv skjermen med det flytende hånd).</li>
		<li>Fyll reservoarene av en 96-brønns krystallisering plate med tilstanden. Væske-handler, fortsette på samme måte som protokoll 1, trinn 2.2.2, men angi "80 µL" for volumet i reservoarer.</li>
		<li>Definere dråper på nanoliter dispenser med 3 komponenter på dekk (plate som inneholder skjermbildet additiv krystallisering platen og 8-og protein stripe i første posisjon av strip-holderen blokken, Tabell 4).</li>
		<li>Seal celle kultur plate inneholder skjermen med en aluminium ark og sett den tilbake i inkubator 20 ° C.</li>
		<li>Vurdere størrelse, form, og sentrering av dråper under mikroskopet før lagring.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Vi herved uttrykke en motstridende kommersiell interesse siden LifeArc kommersialiserer følgende elementer: 96 - og 48-brønnen MRC plater, MRC hengende slipp selen, MORPHEUS, Pi, ANGSTROM og LMB krystallisering skjermene.

1 - utarbeidelse og bruk av første skjermbildene lagres i plater
Screening kits skal blandes før utlevert i platene fordi lys nedbør eller fase separasjon oppstår i noen rør under lagring. Når en skjerm består av to kits (2 x 48 rør), plasseres første tuben til andre kit i sted E1 av nedkjøling transportør. Når en skjerm er sammensatt av 4 kits (4 x 24 rør), første tuben til andre kit plasseres i sted C1, første røret i tredje kit er plassert på et sted E1 og første tube fjerde settet er plassert på et sted G1. Stund setter inn rør i deres nedkjøling transportør, plasseres lokk på et brett etter oppsettet standard 96-brønnen-landskapet. Siden godt numrene angis på lokkene av produsenter, kan dette kors-kontroll hvis alle rør er plassert i riktig rekkefølge. Dette bidrar også til å erstatte riktige lokkene på rør når du fyller et redusert antall plater.
Vi lagrer forhåndsutfylte platene på 10 ° C, et kompromiss å unngå frysing og lagring på 4 ° C som kan føre til forverring av forholdene og problemer med tetting. Platene er lagret i opptil flere måneder med vanligvis ingen merkbar kondens på indre ansiktet av segl. Dette er mindre sant for LMB05, LMB06, LMB09 og LMB10 plater som disse inneholder forhold med relativt høye konsentrasjoner av ustabile reagenser (tabell 1). Liten mengde kondens på innsiden av segl reduserer tetting effektivitet og kan forårsake kryssforurensning mellom brønner mens unsealing platene. For å hjelpe med å hindre kondens under innledende nedkjøling, kan plater først overføres fra karusellen i en isolert piknik kjøligere som lagres i et kaldt rom 4 ° C over natten. Den meget langsom avkjøling minimerer utviklingen av temperatur graderinger i forseglet brønnene og dermed reduserer kondens samlede15. I tillegg når platene er lagret i 10 ° C inkubator, plasseres en in-house tilpasset SBS polystyren lokket på tallerkenen øverst i hver bunke (vises ikke).
Hele settet med våre forhåndsutfylte plater kan brukes som første storskjerm mot en roman, vannløselige, protein prøve. Færre plater kan også velges tilsvarer spesifikke krav. For eksempel LMB15 og LMB19 er skjermer formulert spesielt for membran protein prøver26,27, eller LMB20 er en skjerm formulert med tunge-atomer å lette eksperimentelle utfasing Diffraksjon data28 (se også : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formulering av MORPHEUS protein krystallisering skjermer</a>).
2. sette opp krystallisering dråper
Når du bruker systemet 2, skal screening sett med betydelige mengder ustabile reagenser behandles først. Dette unngår kondens dannet på gummi av SBS lokkene, som kan påvirke lokket håndtering og plate tetting. En SBS lokk har litt klaring når på en plate, og det er derfor de må justeres først (se protokollen, trinn 1.2.6). Protein døde volumene i brønnene av PCR plate er relativt sjenerøse (0,8 µL, se legenden om tabell 2). Merk at like sjenerøse døde volumer er ansatt ved nanoliter dispenser individuelt med protein i 8-brønns strimler (Tabell 4). Mindre døde volumer kan fungere, men noen prøver følge tipsene, kalibrering av en robot kan bli litt unøyaktig, rommet kan bli varmere enn vanlig, etc. Alle føre til eksempel tap dekket av generøse døde volumene for å konsolidere tilnærming.
Siste utviklingen aktivert ytterligere miniatyrisering eksperimenter og dermed volumet av eksempel kreves for screening krystallisering forhold kan reduseres betydelig ved å integrere de tilsvarende teknologi29,30 . Men må noen aspekter av ytterligere miniatyrisering nøye overveielse, som fordampning av dråper31 og manipulering av microcrystals32.
Til slutt, sentrifugering av platen (2000 rpm, 1 min) kunne integreres til rutinemessig slutt når krystallisering dråper (i sfærisk øvre-wells). En mer konsekvent størrelsen og formen på dråper fra sentrifugering redusere reproduserbarhet problemer33,34. Sikkert, sentrert drops vil lette senere eksperimenter med et mikroskop som nødvendig brennvidden vil ligne over hele platen.
3. fordelene metoden 4-hjørnet
Den viktigste fordelen med metoden 4 hjørner er dens enkelhet, som minimerer feil og muliggjør enkel automatisert protokoller. For eksempel vil 4 hjørnet løsningene alltid bli plassert på dekket av en flytende handler følge samme oppsett. Alle programmer er basert på fast forhold mellom løsninger (Figur 3 c). Manuell forberedelse av 4 hjørnet løsninger er foretrukket automatisk håndtering av løsninger på høye konsentrasjoner som kan være svært tyktflytende. Relativt rask og nøyaktig aspirasjon/dispenser er mulig på de fleste typer flytende handlers med minimumskravene for optimalisering av flytende klasser. Likevel kan noen hjørne løsninger fremdeles for viskøse for en robot som opererer med en flytende-systemet til å fungere effektivt. Det er derfor vi valgte en flytende handler med positiv forskyvning (figur 3B).
I tillegg til de 2 lineære forløpninger for kan en tredje komponent (dvs., et sett av buffere/tilsetningsstoffer) testes i en konstant konsentrasjon på en praktisk måte. For dette, er et relativt stort volum sett av hjørnet løsninger på en hensiktsmessig høyere konsentrasjon, unntatt komponenten skal varieres, utarbeidet først. Deretter lager løsninger inkludert denne komponenten legges til å justere de endelige konsentrasjonene. For eksempel er 50 mL av 4 hjørnet løsninger forberedt på 10% høyere konsentrasjoner enn opprinnelig. Dette sett er deretter delt i 5 mindre deler av 4. Til slutt, 10% i volum av ulike buffer-pH løsninger legges til hver delsett.
4. formater og typer additiv skjermer
Skjermbildene lagres vanligvis på 20 ° C (Figur 4) siden de ikke brukes regelmessig og inneholde flyktige/ustabilt forbindelser. Bruk av en frossen additiv skjerm lagret i en dyp godt blokk (1 mL i brønner) må planlegges tidlig fordi det vil ta 12-24 hr for alle additiv løsninger å tine helt ved romtemperatur. Også en rekke brukere dele samme additiv skjermen, potensielt forårsake problemer med kryss-kontaminering. Endelig gjør høyden på dypt godt blokker dem uegnet for de fleste nanoliter dispensere. Som en praktisk løsning å omgå disse problemene, skal skjermen overføres fra dypt godt blokken til lav profil plater (Figur 4).
Historisk har additiv skjermer som inkluderer en rekke enkelt reagenser (med enkelt konsentrasjoner) vært svært populære35,36. Men er andre typer additiv skjermer utviklet som integrerer blandinger av tilsetningsstoffer37 eller redusert antall enkelt tilsetningsstoffer på ulike konsentrasjoner38. Endelig er en utfyllende tilnærming å undersøke effekten av tilsetningsstoffer på prøvene før krystallisering39,40.
5. mer hensyn
God praksis: De fleste skjermer inneholder skadelig eller selv giftige stoffer og derfor tilstrekkelig personlig beskyttelse må brukes under protokoller. Like, bevegelige deler av roboter kan føre til skader, særlig når prøver å manuelt inn mens et program kjører (selv om de fleste av roboter har Nødstopp-knappen/system). På grunn av tekniske kompleksiteten involvert, vanlig kontroll av roboter, skjermer og programmer med tidligere preget test prøver er viktige for vedvarende høye nivåer av reproduserbarhet.
Produksjon: Som en indikasjon, mellom 4000 til 8000 LMB produseres plater årlig med systemet 1 (og senere ansatt av brukere for første screening). Det er ikke tilpasset lager en stor mengde pre-fylt plater på 10 ° C når forventet inntekt er mye lavere, som etter 4-5 måneder, noen forhold vil begynne å svekkes og fordampe. Ulike tilnærminger til automatisering protokoller er gjennomført for små til mellomstore laboratorier41.
Lagre og vurdere eksperimenter: Etter å forberede dråpene, lagres plater på lite vibrasjoner hyllene i et rom på 4 eller 18 ° C med strengt kontrollert temperatur (+/-0,5 ° C maksimalt avvik). Eksperimenter vurderes med kaldt lys kilde mikroskop. Ulike automatisert imaging-systemer er kommersielt tilgjengelig, men man bør nøye vurdere alle aspekter: samme hastighet til å skanne en plate blir nok for høy gjennomstrømming? Vil objekter enn krystaller forstyrre autofokus? Resulterende kvaliteten på bildene er tilstrekkelig å flekk svært små krystaller (særlig rundt kanten av dråpene)? 42 , 43 , 44
Sammenligning av krystallisering vilkår: Etter forsiktig undersøkelser om innholdet av krystallene først innhentet, kan en analysere trender og likheter over ved hjelp av <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB skjermen databasen</a> eller C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Webverktøy</a>45.

Røntgenkrystallografi brukes mye lenger fremme vår forståelse av biologisk og sykdom mekanismer på Atom-nivå og deretter hjelpe rasjonelle tilnærmingsmåter til narkotika funnet1. For dette, renset og konsentrert (2-50 mg/mL) macromolecular prøver av protein, DNA, RNA, andre ligander og deres komplekser er trialed for deres tilbøyelighet til skjemaet bestilt tredimensjonale lattices gjennom krystallisering2,3 ,4. Når høy kvalitet krystaller er oppnådd som diffract x-stråler, kan krystallstruktur løses på nær Atom løsning5,6. Avgjørende, betingelsene til å krystallisere en roman prøve ikke kan forutses og avkastningen av høy kvalitet krystaller er vanligvis svært lav. En underliggende årsak er at mange prøver rundt utfordrende biokjemiske egenskaper, som gjør dem ustabil på tilsvarende tidsskalaen for krystallisering (vanligvis noen dager). Til slutt, prosessen er forsterket av tiden det tar å produsere prøver og prøve varianter, og å optimalisere sine rensing og krystallisering7,8.
En krystallisering tilstand er en løsning med en precipitant som reduserer eksempel løselighet vilkårene også inneholder buffere og tilsetningsstoffer. Hundrevis av slike reagenser er godt egnet for å endre parameterne for krystallisering eksperimenter som de har lav tilbøyelighet til å forstyrre eksempel integriteten (som protein eller nukleinsyre utspiller seg). Mens testing millioner av kombinasjoner av krystallisering reagensene ikke er gjennomførbart, er testing på mange screening kits - formulert med ulike strategier9,10 - mulig med miniatyriserte prøvelser og automatisert protokoller. I dette perspektivet er mest mottagelig teknikken sannsynligvis damp diffusjon med 100-200 nL dråper sitter på en liten godt over et reservoar som inneholder krystallisering tilstanden (25-250 µL), implementert i spesialiserte krystallisering plater11 , 12. de protein prøve og tilstand kombineres i en 1:1 ratio for et totalt volum på 200 nL når dråper i øvre-brønnene. Robot nanoliter protein krystallisering kan gjennomføres med alternative teknikker og plater som under olje satsvise13 og Lipidic kubikk fase14 (den siste som blir brukt spesifikt på trans-membran proteiner som er veldig dårlig løselig i vann).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">Funksjonen krystallisering på MRC-LMB</a> ble startet tidlig på 2000-tallet og en tidlig oppsummering av våre automatiserte protokollene ble presentert i 200515. En historisk innføring protein krystallisering ble presentert og også en oversikt over fordelene med robot nanoliter tilnærming (deretter en ny tilnærming til rutinemessig eksperimentering). Siden macromolecular krystallisering er i hovedsak en stokastiske prosessen med svært lite eller ingen nyttig tidligere informasjon, ansette en bred rekke (passer) første forhold øke avkastningen av kvalitet Diffraksjon krystaller16. Dessuten er en ofte oversett nytte av første storskjerm å redusere behovet for optimalisering av prøver og krystaller i mange tilfeller. Selvfølgelig kan en fortsatt må fortsette med optimalisering av noen innledende forhold senere. Vanligvis konsentrasjonen av reagenser og pH er deretter systematisk undersøkt. Flere reagenser kan også bli introdusert i optimalisert betingelsen(e) ytterligere endre parameterne for krystallisering. Sikkert, en forsøkte krystallisering med et utvalg ferskt tilberedte, derfor tilsvarende protokollene må være enkel og tilgjengelig helst.
Her to helautomatisk systemer designet på MRC-LMB (systemer 1 og 2) og tilhørende protokoller er fullstendig beskrevet. Den viktigste anvendelsen av disse to systemene er første screening av damp spredning i sittende slipp krystallisering plater. Systemet 1 integrerer en flytende handler, en automatisert carousel til lager plater, en blekkskriver for plate merking og en selvklebende plate sealer. På systemet 1 er 72 96-brønns plater fylt med kommersielt tilgjengelig screening kits (80 µL av tilstand overføres til reservoaret fra en start volumet av 10 mL i test-rør), merket og forseglet. Platene lagres i en 10 ° C inkubator der de er tilgjengelige for brukerne når som helst (som første skjermer kalt 'LMB plater').
Systemet 2 integrerer en flytende hånd, en nanoliter-dispenser og en selvklebende plate sealer. På systemet 2, sitter dråper (100-1000 nL) for damp diffusjon eksperimenter er produsert ved å kombinere betingelser og eksemplet i øvre-brønnene 20 48 - eller 96-brønnen plater forhåndsutfylt med forhold. Dette betyr 1920 første screening betingelser er trialed ved 20 LMB plater på systemet 2.
Roboter også brukes individuelt for optimalisering av valgte betingelsene og tilsvarende halvautomatisk protokollene også beskrives. De 4 hjørner metoden17 ansatt rutinemessig å produsere optimalisering skjermer. Tilsvarende protokollen først krever manuell utarbeidelse av 4 løsninger ("A, B, C og D'). To lineære graderinger av konsentrasjoner (for to viktigste krystallisering agenter) deretter genereres automatisk direkte i reservoarene av en krystallisering plate. For dette dispenses en sprøyte-baserte flytende handler 4 hjørnet løsninger på ulike forhold.
For å ytterligere tilpasse en betingelse, kan man bruke additiv skjermer som potensielt forbedrer egenskapene for resulterende krystaller18. To tilnærminger er tilgjengelige for additiv screening: en protokoll med tilsetningsstoffer utlevert i reservoarene krystallisering plater før dråper (protocol 1) og en annen protokoll der additiv skjermen er utlevert direkte på dråpene (protocol 2).
Andre nyttige utviklinger som ble igangsatt på MRC-LMB å lette automatiserte macromolecular krystallisering, er også presentert. I hovedsak minimerer krystallisering plater og tilknyttede enheter som en stables samfunn av Biomolecular Screening (SBS) lokk som fordampning betingelsene ved systemet 2.
For enkelhets antas det at brukerne er kjent med de grunnleggende funksjonene og vedlikehold av nanoliter dispenser, inkjet-skriver og lim plate sealer. Ikke annet er angitt, plater på dekket av roboter er plassert slik at godt A1 ('A1-hjørne") er mot baksiden venstre hjørnet av en plate carrier.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Robots</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freedom EVO&#174;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microlab&#174; STAR&#8482;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&#8482; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mosquito&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dragonfly&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive plate sealer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inkjet printer 9232</td>
			<td>Markem-Imaje</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystallization screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-110</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen 2&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-112</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009530</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009531</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Ammonium Sulfate</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-211</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG/LiCl</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-217</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick Screen&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-221</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Sodium Chloride</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-219</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG 6000</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-213</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; MPD</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-215</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemFac&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-114</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PEG/Ion&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-126</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Natrix&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-116</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen Lite&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Lite screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009536</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009537</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS1</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-101L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS2</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-102L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS3</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-103L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS4</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-104L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS5</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-105L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS6</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-106L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS7</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-107L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS8</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-108L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS9</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-109L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS10</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-110L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Index&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-144</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-107</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 2</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-109</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemStar&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-21</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemSys&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-25</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JCSG-plus&#8482; Suite</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >130720</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-46</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi minimal screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-127</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi-PEG screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; II screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-91</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LMB crystallization screen&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-98</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Additive screens</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT additive screen</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-138</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-93-500</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (500 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-93</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped wells (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100-FX</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped well (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HIPPOCRATES additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>n/a</td>
			<td >48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS&#174; III).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Other consumables</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well MRC 2-drop plate</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MRC 96T-UVP</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >48-well MRC 1-drop plate&#160; (&#39;MAXI plate&#39;)</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MMX01-UVP&#160;</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 &#181;L. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MRC hanging drop seal</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive sealing tape</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR4-50</td>
			<td >3-inch wide Duck&#174; HD Clear&#8482; for sealer and manual sealing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive aluminium sheet</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >538619</td>
			<td >Used to reseal additive screens.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ink cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>9651</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Solvent cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>8652</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L tips&#160;</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>235947</td>
			<td >System 2 (STAR&#8482; liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE&#8482; tips in disposable stacks.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent container</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>194052</td>
			<td >Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate</td>
			<td >Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td >AB-2150</td>
			<td >System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito&#174;). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microsyringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03020</td>
			<td >Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito&#174; nanoliter dispenser (9mm spacing).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >strip-holder block</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >3019-05013</td>
			<td >SSB device for the Mosquito&#174; strips, aka &#39;4-way Reagent Holder&#39;.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03110</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03100</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL syringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07100</td>
			<td >Syringe body and piston for the Dragonfly&#174; liquid handler. Pack of 100.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Troughs/Reservoirs</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07103</td>
			<td >Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly&#174;. Pack of 50.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital microplate shaker</td>
			<td>CamLab Limited</td>
			<td>n/a</td>
			<td >Variomag&#174; for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate mixer</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>3121-01015</td>
			<td>MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology

Når høy kvalitet krystaller er oppnådd som diffract x-stråler, kan krystallstruktur løses på nær Atom løsning. Betingelsene til å krystallisere proteiner, DNAs, RNAs og deres komplekser kan imidlertid ikke være spådd. Ansette en rekke forhold er en måte å øke avkastningen av kvalitet Diffraksjon krystaller. To helautomatisk systemer er utviklet på av MRC Laboratory of Molecular Biology (Cambridge i England MRC-LMB) som forenkler krystallisering screening mot 1920 første vilkår av damp spredning i nanoliter dråper. Halvautomatisk protokoller har også blitt utviklet for å optimalisere betingelser ved å endre konsentrasjonen av reagenser, pH, eller ved å innføre tilsetningsstoffer som potensielt forbedrer egenskapene til de resulterende krystallene. Alle tilsvarende protokollene er beskrevet i detalj og kort diskutert. Sammen gjør de praktiske og effektive macromolecular krystallisering i multi-user anlegg, samtidig gir brukere kontroll over nøkkelparametre for sine eksperimenter.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Automatiserte systemer og protokoller for rutinemessig utarbeidelse av et stort antall skjermer og nanoliter krystallisering dråper for damp diffusjon eksperimenter er beskrevet og diskutert.

Automatisert protokoller for Macromolecular krystallisering ved MRC molekylærbiologi

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskjellige dimensjoner bruke automatisert krystallisering kombinert med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Enkeltsteg rensing av Macromolecular komplekser ved hjelp av RNA knyttet til Biotin og et foto-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på Molecular Level bruker robust biokjemiske tilnærminger av en ny kinase protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening og karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for vellykket krystallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spotvariasjon Fluorescenskorrelasjonsspektroskopi for analyse av molekylær diffusjon ved plasmamembranen til levende celler

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Uttrykk, Rask Protein Rensing Protokoller og Krystallisering av Wild Type og Mutant Former for Tryptophan Synthase

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Seriedatasamling med fast mål ved diamantlyskilde

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Arbeidsflyt og verktøy for krystallografisk fragmentscreening ved Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...