Name: automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

A facilidade de cristalização de MRC-LMB é gentilmente apoiado pelo Conselho de pesquisa médica (UK). Agradecemos a membros do LMB para seu apoio: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent e Pat Edwards (estudos estruturais), Steve Scotcher e os outros membros da oficina mecânica, Neil Grant e Jo Westmoreland (ajudas visuais), Paul Hart e Tom Pratt (TI). Também gostaríamos de agradecer a Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart e Heather Ringrose (Hamilton robótica, UK), Paul Thaw, Robert Lewis e Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Suíça), George Stephens e Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem Imaje, UK) e Graham Harris (The Cleveland Agency) para ajuda técnica.

1. os dois sistemas (triagem inicial) totalmente automatizados
<ol><li>
Sistema 1: preparação de 72 placas de 96 poços cristalização repleta de kits (placas LMB) de rastreio
	<ol>
<li>Antes de realizar o procedimento, certifique-se de que os robôs do sistema são inicializados e seu software de controle é aberto. Ligue o refrigerador do porta-tubo de refrigeração em cerca de 30 minutos antes do programa principal será iniciado.</li>
		<li>Coloque uma placa de teste sobre a transportadora SBS motorizada do aferidor de placa. Execute o aferidor de placa e verifique que a película é aplicada corretamente. Repita este teste mais duas vezes para verificar se o aferidor de prato está pronto.</li>
		<li>Em seguida, adicione 20 L de água deionizada para o recipiente principal do manipulador de líquido. As inserções de acoplamento do recipiente pequeno (etanol 20% de solução de lavagem) e ligue as inserções para o recipiente principal.</li>
		<li>Digite o nome de tela apropriada (tabela 1) no ecrã táctil de impressora a jato de tinta. Em seguida, abra e feche a porta do carrossel para acionar a rotação de carrossel. Quando a primeira pilha apresenta-se, abra a porta.</li>
		<li>Carregar totalmente a primeira pilha com 22 placas de cristalização, cada um com voltado para a coluna 1 para fora. Carrega totalmente as próximas duas pilhas da mesma forma.</li>
		<li>Carrega as restantes 6 placas nos mais altos cargos da quarta pilha. Em seguida, feche a porta do carrossel.</li>
		<li>Verifique se que o display do refrigerador indica 14 ° C. Suavemente e repetidamente inverta os kits de triagem selecionado por 1 minuto. Em seguida, abra o painel frontal do manipulador de líquido.</li>
		<li>Abra os tubos e coloque-os em refrigeração transportadora de acordo com o layout padrão de 96 poços (A1, A2, etc.). Após a colocação de cada tubo no portador, coloque a tampa em uma bandeja no mesmo layout de 96 poços.</li>
		<li>Verificar o tubo posições e garantir que todos os tubos são de nível e se estabeleceram no portador. Em seguida, feche o painel frontal.</li>
		<li>Na janela do software líquido manipulador 'Inicialização', selecione 'Executar manutenção' e abrir o programa de lavagem. Execute o programa para liberar o etanol 20% do sistema e para lavar as paredes laterais das dicas de fornecimento de líquido.</li>
		<li>Quando a descarga estiver concluída, clique em 'Cancelar' para voltar à 'Inicialização'. Selecione 'Executar um processo existente' e clique em 'Iniciar sua seleção'. Abra o programa 'MRC kit distribuição'. Preencha '18' 'Instâncias' na configuração de tela e executar o programa.</li>
		<li>Monitore o sistema como as quatro primeiras placas são rotuladas, preenchidas e seladas.</li>
		<li>Uma vez que todas as 72 placas foram preparadas e colocado de volta no carrossel, mudar as inserções de acoplamento do recipiente principal para o recipiente pequeno. Execute o programa 'Arranque flush' (consulte a etapa 1.1.10).</li>
		<li>Desligar o refrigerador e descartar a esvaziar os tubos kit de triagem. Remova cuidadosamente as 72 placas preparadas no carrossel. Descarte de placas preenchido incorretamente ou mal vedada. Armazenar as placas de ready-to-use a 10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sistema 2: criação de uma única amostra em 20 placas de LMB de gotículas de cristalização (proteína de nL 100 + 100 condição nL)
	<ol>
<li>Em primeiro lugar, garantir que robôs do sistema estão em, o dispensador de nanolitros é inicializado com seu software aberto, e gerente do método do manipulador líquido está aberto. Ligue a transportadora microtubo e refrigeração cerca de 15 minutos antes do programa principal será iniciado.</li>
		<li>Coloque uma placa de teste sobre a transportadora SBS motorizada do aferidor de placa. Executar o aferidor da placa e verificar que a placa está devidamente selada. Teste o aferidor de placa três vezes.</li>
		<li>Em seguida, execute o dispensador de nanolitros para definir 100-nL gotas da solução de teste em uma placa de teste. Verificar sob um microscópio que as gotas estão definidas corretamente. Feche o software do dispensador de nanolitros e remover o bloco tira-titular do baralho.</li>
		<li>Em seguida, insira no porta-placa personalizados (ver Resultados de representante: cristalização dispositivos desenvolvidos para o LMB) a placa LMB com a maior quantidade relativa dos reagentes voláteis em suas condições (tabela 1). Remova a película adesiva da placa.</li>
		<li>Abrir o painel frontal do manipulador de líquido e coloque a placa sem lacre no deck, na parte de trás o primeiro transportador de deslizamento (portadores de deslizamento pode ser puxada para a facilidade de acesso).</li>
		<li>Cubra o prato com uma tampa de alumínio SBS. Resolver a tampa em direção ao canto esquerdo traseiro da transportadora, aplicando uma pressão suave ao canto oposto da tampa.</li>
		<li>Unseal, carregar para as deslizamento das transportadoras e cobrir as restantes 19 placas da mesma forma, trabalhando a partir mais para condições menos voláteis. Uma vez que a transportadora microtubo de refrigeração a 4 ° C, conforme indicado pela luz verde, remova sua capa.</li>
		<li>Corte a tampa de um microtubo contendo (pelo menos) 440 µ l da amostra de proteína (tabela 2). Certifique-se de que a amostra tem sem espuma acima do menisco, como isso irá interferir com o sistema de detecção de líquido. Coloca o tubo na posição 1 da transportadora microtubo e refrigeração.</li>
		<li>Coloque um prato PCR no convés manipulador de líquido na frente da transportadora adaptador placa-movendo-se. Em seguida, feche o painel frontal.</li>
		<li>Depois de carregar o convés, certifique-se que o baralho de dispensador de nanolitros é claro do bloco tira-titular e que as transportadoras na parte de trás das pilhas de ponta de 50 µ l são claras das tampas de alumínio SBS.</li>
		<li>Na interface de 'Método de gestão' líquido manipulador, selecione 'Setup placas'. Monitorar a inicialização de ambos os sistemas e preencher os parâmetros de execução. Siga as diretrizes de interface de gerenciamento método (prompts, figuras e um sistema de gestão de ponta ajudar com preparação).</li>
		<li>Verifique que todas as componentes estão prontos e em seguida, iniciar o processo.</li>
		<li>Monitore o sistema como o dispensador de nanolitros define as gotas na primeira placa e o aferidor de placa posteriormente selos da placa.</li>
		<li>Uma vez que todas as 20 placas foram preparadas com gotículas de cristalização e retornadas automaticamente para os portadores de deslizamento, abrir o painel frontal e remova cuidadosamente as placas. Verifica que as placas são seladas corretamente antes de guardá-los por cristalização.</li>
		<li>Limpe as tampas SBS com uma solução de etanol a 20% antes de empilhá-los no lado esquerdo do manipulador de líquido para o armazenamento. Descarte a placa PCR e o microtubo.</li>
		<li>Desligue a transportadora microtubo e refrigeração e enxugar a condensação. Deixe uma toalha de papel sobre a superfície do refrigerador de absorver ainda mais condensação. Em seguida, recoloque a tampa do porta-aviões e feche o painel frontal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. otimização das condições
<ol><li>
Manipulador de líquidos baseados em seringa: produzindo dois gradientes lineares das concentrações em reservatórios de uma placa de cristalização (o método 4-canto).
	<ol>
<li>Em primeiro lugar, garantir que o manipulador de líquido é na e inicializado com seu software aberto.</li>
		<li>Na 'Gradiente' tab: Abra o programa necessário, selecione o tipo de placa de cristalização e o volume final dos reservatórios (tabela 3). A configuração avançada para 'máximo tiro vol' deve ser diminuída de 6.000 para 3.000 quando usando soluções contendo [isopropanol] > 10% v/v e [MPD] > 20% v / v.
</li>
		<li>Prepare as seringas. Colocar um pistão em cada seringa (extremidades pontiagudas para baixo) e parte de trás das seringas nas ranhuras designadas por baixo da cabeça do robô. Uma seringa gire no sentido horário para travar na posição (o programa irá iniciar somente com todas as seringas necessárias anexadas corretamente).</li>
		<li>Prepare os bebedouros. Retire a armação de aço inoxidável e inserir os bebedouros. As 4 posições da esquerda correspondem aos 4 cantos A, B, C, D. interruptor para 'SET UP' guia que exibe os volumes das soluções necessárias em cada seringa (na tabela 3, 0.5 volume morto mL foi adicionado aos volumes exibidos). Despeje as soluções de canto em suas respectivas calhas e coloque o quadro de volta no chão (o quadro mantém em posição com 2 pequenos ímãs, localizados na parte dianteira da plataforma). Uma maneira alternativa para prosseguir com este passo é para as soluções despeje os bebedouros quando eles já são colocados no convés.
</li>
		<li>Coloque a placa de cristalização ao transportador motorizado de SBS.</li>
		<li>Clique em 'Aspirar' e esperar que esta etapa seja concluída (quando pistões pararam a caminho).</li>
		<li>Alterne para a guia 'RUN' e execute o programa.</li>
		<li>Após a conclusão do programa, volte para o guia SET UP e clique em 'Remover': o sistema limpa as seringas de soluções de sobras e então levanta os pistões todo o caminho. 'PURGE' pode ser solicitado em vez de 'Remover'; isso vai deixar os pistões na posição inferior, pronta para aspirar mais soluções com as mesmas seringas.
</li>
		<li>Retire as seringas rodando-as no sentido anti-horário.</li>
		<li>Descarte de seringas e depressões na caixa apropriada (ou lave-as com água desionizada e, em seguida, a solução de etanol 20% v/v para reutilização).</li>
		<li>A placa do selo e coloque-a sobre o misturador de microplacas para 3 min a 1.000 rpm, ou 10 min quando estão sendo misturadas soluções altamente viscosas. A placa está pronta para criação de gotículas de cristalização sobre o dispensador de nanolitros.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aditivo de triagem protocolo 1 (criação de gotículas de cristalização em uma placa de 96 poços cristalização pré-preenchido com tela aditiva)
	<ol>
<li>Primeiro, prepare a condição com concentrações iniciais de reagentes aumentados 10% (min. vol. 15 mL ao transferir a condição de um contêiner na tela aditivo com o manipulador de líquido).</li>
		<li>Certifique-se de que o manipulador de líquido está pronto para operar. Abra o programa 'Tela de adicionar aos aditivos' por um prato único (Insira o volume em reservatórios: 'µ l 72'). Solicita, figuras e um sistema de ponta-gestão (dicas de 12 x 1.000 µ l necessários) ajuda em certificar-se de que o robô está pronto para operar de acordo com as seleções.
</li>
		<li>Recuperar a tela aditiva de-20 ° C a temperatura da incubadora e remover imediatamente seu selo de alumínio (uso o suporte da placa) e, em seguida, coloque a placa no convés do manipulador de líquido. o programa funciona de acordo com um layout de retrato (a placa é colocada com o A1-canto localizado no canto esquerdo da frente da transportadora). Também também coloca o recipiente com a condição. Execute o programa.</li>
		<li>Uma vez que os reservatórios da placa tem sido preenchidos, coloque-a sobre o agitador microplacas e executar o programa. Lave o recipiente de condição com etanol água e 20% desionisada para reutilização.</li>
		<li>
Configurar as gotas sobre o dispensador de nanolitros. Primeiro, remover o lacre da placa de cristalização (uso o suporte da placa). Então, lugar a placa e a proteína de 8 poços tira na primeira posição do bloco tira-titular. Na guia 'Configuração' sobre o software de controle exibe as posições reais de cada componente no convés. Cada um carregar bem da tira com amostra de proteína de acordo com o tamanho da gota exigido (tabela 4). Executar o programa para preparar gotículas.
</li>
		<li>Após a conclusão do programa, retirar a placa do baralho e selá-lo imediatamente (use o aferidor de placa, adesivo de 3 polegadas de largo). Descarte a tira na caixa apropriada.</li>
		<li>Avaliar o tamanho, forma e centralização de gotas sob o microscópio antes do armazenamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aditivo de triagem protocolo 2 (criação de gotículas de cristalização em uma placa de 96 poços cristalização com uma tela de aditiva de re-utilizável)
	<ol>
<li>Primeiro, prepare a tela aditiva: deixar a placa de cultura de células congeladas de 96 poços correspondente para descongelar à temperatura ambiente por 40 min. Em seguida, centrifugar a tela aditiva a 1.000 x g por 2 min.</li>
		<li>Prepare a condição (min. vol. 15 mL ao transferir a condição de um contêiner na tela aditivo com o manipulador de líquido).</li>
		<li>Encha os reservatórios de uma placa de 96 poços de cristalização com a condição. No manipulador de líquido, proceda da mesma forma que o protocolo 1, etapa 2.2.2, mas digitar '80 µ l' para o volume nos reservatórios.</li>
		<li>Configure as gotas sobre o dispensador de nanolitros com 3 componentes no convés (a placa contendo a aditiva tela, juntamente com a placa de cristalização e a tira de 8 poços proteína na primeira posição do bloco tira-titular, tabela 4).</li>
		<li>Selar a placa de cultura de células que contém a tela com uma folha de alumínio e colocá-lo de volta na incubadora de-20 ° C.</li>
		<li>Avaliar o tamanho, forma e centralização de gotas sob o microscópio antes do armazenamento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Pelo presente afirmamos que um conflito de interesse comercial desde LifeArc comercializa os seguintes produtos: placas de 96 - e 48-poço MRC, o selo de gota suspensão MRC, os MORPHEUS, Pi, ANGSTROM e LMB telas de cristalização.

1 - preparação e uso de telas iniciais armazenados em placas
Kits de triagem deve ser misturado antes de ser dispensado em placas porque separação de precipitação ou fase luminosa ocorre em alguns tubos durante o armazenamento. Quando uma tela é composta de dois kits (2 x 48 tubos), o primeiro tubo do segundo kit é colocado no local E1 da transportadora refrigeração. Quando uma tela é composta de 4 kits (4 x 24 tubos), o primeiro tubo do segundo kit é colocado no local C1, o primeiro tubo do terceiro kit é colocado em local E1 e o primeiro tubo do kit quarto é colocado em local G1. Ao introduzir os tubos em seu portador de resfriamento, as tampas são colocadas em uma bandeja, seguindo o layout padrão paisagem de 96 poços. Desde que bem números são indicados em cima as tampas pelos fabricantes, isto permite verificar se todos os tubos foram colocados na ordem certa. Isso também ajuda a substituir as tampas corretas nos tubos quando um número reduzido de chapas de enchimento.
Nós armazenamos as placas previamente enchidas entre 10 ° C, um compromisso para evitar o congelamento e armazenamento a 4 ° C que pode causar a deterioração das condições e problemas com selagem. As placas são armazenadas por até diversos meses com normalmente sem condensação perceptível na face interna do selo. Isto é menos verdadeiro para placas LMB05, LMB06, LMB09 e LMB10 como estes contêm condições com relativamente altas concentrações de reagentes voláteis (tabela 1). Pequena quantidade de condensação no interior do selo reduz a eficiência de vedação e pode causar contaminação cruzada entre poços durante a retirada do selo as placas. Para ajudar a impedir a condensação durante o resfriamento inicial, as placas podem ser transferidas primeiro no carrossel em um piquenique isolado mais fresco que é armazenado em um quarto frio de 4 ° C durante a noite. O resfriamento muito lento minimiza o desenvolvimento de gradientes de temperatura dentro dos poços selados e, consequentemente, reduz a condensação total15. Além disso, uma vez que as placas são armazenadas na incubadora de 10 ° C, uma in-house personalizada tampa poliestireno SBS é colocada na placa no topo de cada pilha (não mostrado).
Todo o conjunto de nossos pratos previamente enchidos pode ser usado como uma grande tela inicial contra uma amostra de novela, solúvel em água, proteína. Alternativamente, placas menos podem ser selecionadas para atender às necessidades específicas. Por exemplo, LMB15 e LMB19 são telas formuladas especificamente para a proteína de membrana amostras26,27, ou LMB20 é uma tela formulada com átomos pesados para facilitar a supressão experimentais de difração dados28 (ver também : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formulação das telas de cristalização de proteínas do MORPHEUS</a>).
2. criação de gotículas de cristalização
Quando se utiliza o sistema 2 kits com quantidades significativas de reagentes voláteis de triagem deve ser processada primeiro. Isso evita a condensação, formando-se na borracha das tampas SBS, que podem afetar sua manipulação de tampa e vedação da placa. Uma tampa SBS tem um pouco de folga quando no topo de uma placa, que é por isso que eles precisam ser alinhados inicialmente (Veja o protocolo, passo 1.2.6). Os volumes de proteína morto nos poços da placa da PCR são relativamente generoso (0,8 µ l, ver legenda de tabela 2). Note-se que igualmente generosos volumes mortos são empregadas quando usando o dispensador de nanolitros individualmente com proteína em tiras de 8 poços (tabela 4). Volumes menores mortos podem funcionar, no entanto algumas amostras aderem às pontas, calibração de um robô pode tornar-se um pouco imprecisa, o quarto pode ser mais quente que o habitual, etc. Tudo levar a perdas de amostra abrangidas pelos volumes mortos generosos para consolidar a abordagem.
Desenvolvimentos recentes mais habilitado a miniaturização dos experimentos e, portanto, o volume de amostra necessário para condições de cristalização de triagem pode ser significativamente reduzido através da integração da correspondente tecnologia29,30 . No entanto, alguns aspectos da miniaturização ainda mais precisam de cuidadosa consideração, tais como a evaporação de gotículas31 e a manipulação de microcristais32.
Finalmente, centrifugação da placa (2.000 rpm, 1min) poderia ser integrada como um passo final rotineiro ao configurar gotículas de cristalização (no esféricos superior-poços). Um tamanho e a forma de gotículas resultantes de centrifugação mais consistente podem reduzir problemas de reprodutibilidade33,34. Certamente, centradas gotas facilitará a posterior avaliação de experimentos utilizando um microscópio, como a necessária distância focal será semelhante uma placa inteira.
3. vantagens do método 4-canto
A vantagem mais significativa do método 4-canto é sua simplicidade, o que minimiza os erros e facilita simples protocolos automatizados. Por exemplo, as soluções de 4 canto serão sempre colocadas no convés de um manipulador líquido seguindo o mesmo layout. Também, todos os programas são baseados em proporções fixas entre as soluções (Figura 3). Preparação manual das soluções de 4 canto é preferível à manipulação automatizada de soluções em concentrações elevadas, que podem ser altamente viscosas. Aspiração/distribuição relativamente rápido e preciso, é possível na maioria dos tipos de manipuladores de líquidos com requisitos mínimos para a otimização das classes líquidas. Todavia, algumas soluções de canto ainda podem ser muito viscosas para um robô operando com um sistema de líquido para operar eficientemente. É por isso que optamos por um manipulador líquido, operando com deslocamento positivo (Figura 3B).
Além dos 2 gradientes lineares das concentrações, um terceiro componente (ou seja, um conjunto de amortecedores/aditivos) pode ser testado em uma concentração constante de forma conveniente. Por isso, um volume relativamente grande de um conjunto de soluções de canto em uma concentração maior devidamente, excluindo o componente a ser variada, é preparado primeiro. Em seguida, Soluções conservadas em estoque, incluindo este componente é adicionado para ajustar as concentrações finais. Por exemplo, 50 mL de um conjunto de 4 soluções de canto são preparados em altas concentrações de 10% do que inicialmente. Este conjunto de núcleo é então dividido em 5 subconjuntos menores de 4. Finalmente, 10% em volume de soluções tampão-pH diferente é adicionado a cada subconjunto.
4. formatos e tipos de telas de aditivos
As telas são normalmente armazenadas a-20 º C (Figura 4), desde que eles não são usados regularmente e contêm compostos voláteis/instável. O uso de uma tela de aditivo congelada armazenado em um bloco de poço profundo (1 mL em poços) deve ser planejado mais cedo porque vai demorar 12-24 horas para todas as soluções de aditivas descongelar completamente em temperatura ambiente. Também, uma infinidade de usuários compartilham a mesma tela de aditiva, potencialmente causando problemas com contaminação cruzada. Finalmente, a altura do poço profundo blocos torna inadequados para a maioria dos distribuidores de nanolitros. Como uma solução conveniente para contornar esses problemas, a tela deve ser transferida do bloco poço profundo para placas de perfil baixo (Figura 4).
Historicamente, aditivas telas que incluem uma ampla variedade de reagentes único (com concentrações único) têm sido muito populares35,36. No entanto, outros tipos de aditivos telas foram desenvolvidos que integram a mistura de aditivos37 ou um número reduzido de aditivos único encontrado em diferentes concentrações de38. Finalmente, uma abordagem complementar é investigar o efeito de aditivos em amostras antes da cristalização39,40.
5. mais considerações
Boas práticas: A maioria das telas contêm substâncias nocivas ou mesmo tóxicas e, portanto, a proteção pessoal adequada deve ser empregada durante os protocolos. Igualmente, as partes dos robôs móveis podem levar a lesões, especialmente quando tentando interferir manualmente enquanto um programa está sendo executado (embora a maioria dos robôs tem sistema/botão de parada de emergência). Devido as complexidades técnicas envolvidas, regulares verificação de robôs, telas e programas com anteriormente caracterizadas amostras de teste são importantes sustentados níveis elevados de reprodutibilidade.
Taxa de transferência: Como uma indicação, entre 4.000 a 8.000 LMB placas são produzidas anualmente com o sistema 1 (e posteriormente empregados pelos usuários para triagem inicial). Isso não é adaptado para estocar uma grande quantidade de chapas previamente enchidas entre 10 ° C, quando o volume de negócios esperado é muito menor, como após 4-5 meses, algumas condições vai começar a deteriorar-se e evaporar. Diferentes abordagens para protocolos de automação foram implementadas para laboratórios de pequeno para médio-tamanho41.
Armazenar e avaliar experiências: Depois de preparar as gotas, as placas são armazenadas em prateleiras de baixa-vibração em um quarto no 4 ou 18 ° C com temperatura rigidamente controlada (+ /-0,5 ° C máximo desvio). Experimentos são avaliados usando microscópios de fonte de luz fria. Vários sistemas automatizados de imagem estão disponíveis comercialmente, no entanto, deve-se considerar cuidadosamente todos os aspectos: a velocidade necessária para digitalizar uma placa será suficiente para a alta taxa de transferência? Objetos diferentes cristais interferirá com autofocus? A qualidade resultante das imagens serão suficiente para ponto cristais muito pequenos (especialmente em torno da borda das gotículas)? 42 , 43 , 44
Comparação das condições de cristalização: Após cuidadosos investigações sobre a natureza dos cristais obtidos inicialmente, um pode analisar as tendências e as semelhanças entre condições usando o <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">banco de dados de tela LMB</a> ou o C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Ferramenta Web</a>45.

Cristalografia de raios x é aplicada extensivamente para avançar ainda mais a nossa compreensão dos mecanismos biológicos e doença ao nível atómico e posteriormente ajudar racionais abordagens para descoberta de drogas1. Por isso, purificado e concentrado (2-50 mg/mL) macromolecular amostras de proteínas, DNA, RNA, outros ligantes e seus complexos são julgadas por sua propensão a forma ordenada grades tridimensionais através de cristalização2,3 ,4. Quando cristais de alta qualidade são obtidos que difração de raios-x, a estrutura de cristal pode ser resolvida perto de resolução atômica5,6. Fundamentalmente, as condições para se cristalizar uma nova amostra não podem ser previstas e o rendimento de cristais de alta qualidade é geralmente muito baixo. Uma razão subjacente é que muitas amostras de interesse desafiadoras propriedades bioquímicas, que os tornam instável a escala temporal correspondente para cristalização (normalmente alguns dias). Finalmente, o processo é agravado pelo tempo necessário para produzir amostras e variantes de amostra e para otimizar a sua purificação e cristalização7,8.
Uma condição de cristalização é uma solução com um dessensibilizador que reduz a solubilidade da amostra e condições muitas vezes também contêm buffers e aditivos. Centenas de tais reagentes são bem adaptadas para alterar os parâmetros dos experimentos de cristalização, como eles têm baixa propensão para interferir com a integridade da amostra (como proteínas ou ácidos nucleicos desdobramento). Enquanto milhões de combinações de reagentes de cristalização de teste não é praticável, testar várias a muitos kits de triagem - formulados com várias estratégias9,10 - é possível com ensaios miniaturizados e protocolos automatizados. Nesta perspectiva, a técnica mais favorável é, provavelmente, difusão de vapor com gotas de 100-200 nL sentado sobre um pequeno poço acima de um reservatório que contém a condição de cristalização (25-250 µ l), implementada em placas de cristalização especializada11 , 12. a amostra de proteína e condição muitas vezes são combinados em uma proporção de 1:1 para um volume total de 200 nL ao configurar as gotas na parte superior-poços. Cristalização de proteínas nanolitros robótico pode ser implementada com técnicas alternativas e pratos como o óleo Under lote13 e a fase cúbica lipídico14 (o mais recente um sendo aplicado especificamente às proteínas trans-membrana que são muito pouco solúvel em água).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">A facilidade de cristalização no MRC-LMB</a> foi iniciado no início de 2000, e um resumo inicial de nossos protocolos automatizados foi apresentado em 200515. Foi apresentada uma introdução histórica à cristalização de proteínas e abordar também um resumo das vantagens da robótica nanolitros (então uma nova abordagem para a experimentação de rotina). Desde macromolecular cristalização é essencialmente um processo estocástico com muito pouco ou não útil informação prévia, empregando uma ampla variedade de condições iniciais (adequadas), aumentar o rendimento da qualidade difração cristais16. Além disso, uma vantagem de muitas vezes negligenciado, de uma grande tela inicial é reduzir significativamente a necessidade de otimização de amostras e cristais em muitos casos. Claro, um ainda pode precisar de prosseguir com a otimização de algumas condições iniciais mais tarde. Normalmente, a concentração dos reagentes e o pH são então sistematicamente investigados. Reagentes mais também podem ser introduzidos na condição (ões) otimizado para alterar mais parâmetros de cristalização. Certamente, um deve tentar cristalização com uma amostra preparada, portanto, os protocolos correspondentes devem ser simples e disponível qualquer hora.
Aqui, dois totalmente automatizada de sistemas projetados para o MRC-LMB (sistemas de 1 e 2) e os protocolos correspondentes são totalmente descritos. A principal aplicação desses dois sistemas é inicial de triagem por difusão de vapor em sentado soltar placas de cristalização. Sistema 1 integra um manipulador de líquido, um carrossel automatizado de estoque placas, uma impressora jato de tinta para a rotulagem de placa e um aferidor de placa adesiva. No sistema 1, 72 placas de 96 poços são preenchidas com kits de triagem disponíveis comercialmente (80 µ l de condição, transferida para o reservatório de um volume inicial de 10 mL em tubos de ensaio), rotuladas e seladas. As placas são então armazenadas em uma incubadora de 10 ° C, onde eles estão disponíveis para os usuários a qualquer momento (como telas iniciais chamadas 'Placas LMB').
Sistema 2 integra um manipulador de líquido, um dispensador de nanolitros e um aferidor de placa adesiva. No sistema 2, sentado gotículas (100-1.000 nL) para experiências de difusão de vapor são produzidos pela combinação de condições e a amostra no superior-poços de 20 placas de 48 ou 96-boas pré-preenchido com as condições. Isto significa 1.920 condições de rastreio inicial são julgadas quando usando 20 placas LMB no sistema 2.
Robôs também são utilizados individualmente para a otimização das condições selecionadas, e os correspondentes protocolos semi-automático também são descritos. O método 4-canto17 é empregada rotineiramente para produzir telas de otimização. O protocolo correspondente primeiro exige a preparação manual de 4 soluções ('A, B, C e D'). Dois gradientes lineares das concentrações (para dois agentes principais de cristalização) então são gerados automaticamente diretamente para os reservatórios de uma placa de cristalização. Por isso, um manipulador de líquidos baseados em seringa dispensa as soluções de 4 canto em diferentes proporções.
Para otimizar ainda mais uma condição, pode-se empregar telas aditivas que potencialmente melhoram as propriedades de resultante cristais18. Duas abordagens estão disponíveis para a seleção de aditiva: um protocolo começando com aditivos corre para os reservatórios das placas de cristalização antes de configurar as gotas (protocolo 1) e outro protocolo, onde a tela aditiva é dispensada diretamente sobre as gotas (protocolo 2).
Outros desenvolvimentos útil que foram iniciados no MRC-LMB para facilitar a cristalização macromolecular automatizada, também são apresentados. Essencialmente, placas de cristalização e dispositivos associados, tais como um empilhável sociedade de Biomolecular triagem (SBS) tampa que minimiza a evaporação das condições ao utilizar o sistema 2.
Por questões de brevidade, presume-se que os usuários estão familiarizados com as funções básicas e manutenção do aferidor de placa adesiva, a impressora jato de tinta e o dispensador de nanolitros. Salvo indicação em contrário, placas no convés dos robôs estão posicionadas tal que o poço A1 ('A1-canto') é no sentido de canto esquerdo atrás de uma operadora de placa.

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	<tbody>
		<tr >
			<td >Robots</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freedom EVO&#174;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microlab&#174; STAR&#8482;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&#8482; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mosquito&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dragonfly&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive plate sealer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inkjet printer 9232</td>
			<td>Markem-Imaje</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystallization screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-110</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen 2&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-112</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009530</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009531</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Ammonium Sulfate</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-211</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG/LiCl</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-217</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick Screen&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-221</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Sodium Chloride</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-219</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG 6000</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-213</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; MPD</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-215</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemFac&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-114</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PEG/Ion&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-126</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Natrix&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-116</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen Lite&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Lite screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009536</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009537</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS1</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-101L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS2</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-102L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS3</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-103L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS4</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-104L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS5</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-105L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS6</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-106L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS7</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-107L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS8</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-108L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS9</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-109L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS10</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-110L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Index&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-144</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-107</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 2</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-109</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemStar&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-21</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemSys&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-25</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JCSG-plus&#8482; Suite</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >130720</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-46</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi minimal screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-127</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi-PEG screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; II screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-91</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LMB crystallization screen&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-98</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Additive screens</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT additive screen</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-138</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-93-500</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (500 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-93</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped wells (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100-FX</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped well (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HIPPOCRATES additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>n/a</td>
			<td >48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS&#174; III).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Other consumables</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well MRC 2-drop plate</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MRC 96T-UVP</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >48-well MRC 1-drop plate&#160; (&#39;MAXI plate&#39;)</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MMX01-UVP&#160;</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 &#181;L. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MRC hanging drop seal</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive sealing tape</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR4-50</td>
			<td >3-inch wide Duck&#174; HD Clear&#8482; for sealer and manual sealing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive aluminium sheet</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >538619</td>
			<td >Used to reseal additive screens.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ink cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>9651</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Solvent cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>8652</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L tips&#160;</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>235947</td>
			<td >System 2 (STAR&#8482; liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE&#8482; tips in disposable stacks.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent container</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>194052</td>
			<td >Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate</td>
			<td >Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td >AB-2150</td>
			<td >System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito&#174;). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microsyringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03020</td>
			<td >Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito&#174; nanoliter dispenser (9mm spacing).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >strip-holder block</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >3019-05013</td>
			<td >SSB device for the Mosquito&#174; strips, aka &#39;4-way Reagent Holder&#39;.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03110</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03100</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL syringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07100</td>
			<td >Syringe body and piston for the Dragonfly&#174; liquid handler. Pack of 100.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Troughs/Reservoirs</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07103</td>
			<td >Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly&#174;. Pack of 50.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital microplate shaker</td>
			<td>CamLab Limited</td>
			<td>n/a</td>
			<td >Variomag&#174; for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate mixer</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>3121-01015</td>
			<td>MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology

Quando cristais de alta qualidade são obtidos que difração de raios-x, a estrutura de cristal pode ser resolvida perto de resolução atômica. As condições para cristalizar proteínas, DNA, RNAs e seus complexos no entanto não podem ser previsto. Empregando uma ampla variedade de condições é uma maneira de aumentar o rendimento de cristais de difração de qualidade. Dois sistemas totalmente automáticos foram desenvolvidos para o MRC laboratório de Biologia Molecular (Cambridge, Inglaterra, MRC-LMB) que facilitam a seleção de cristalização contra 1.920 condições iniciais por difusão de vapor em gotas de nanolitros. Protocolos semi-automático também foram desenvolvidos para otimizar as condições, alterando as concentrações dos reagentes, o pH, ou através da introdução de aditivos que potencialmente melhorar propriedades dos cristais resultantes. Todos os protocolos correspondentes serão descritos detalhadamente e brevemente discutidos. Tomados em conjunto, possibilitam a cristalização macromolecular altamente eficiente e conveniente numa instalação multi-usuário, dando aos usuários controle sobre parâmetros-chave de suas experiências.

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Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

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