Name: automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

Средство кристаллизации MRC-LMB любезно поддерживается путем Совета медицинских исследований (Великобритания). Мы благодарим членов ЛКМ для их поддержки: Ольга Perisic (PNAC), Тони Warne, Ent ван ден Fusinita и ПЭТ Эдвардс (структурные исследования), Стив Scotcher и других членов механическую мастерскую, Нил Грант и Джо Westmoreland (вспомогательные), Пол Харт и тома Пратт, (он). Мы также хотели бы поблагодарить Стив Эллиот (Текан, Великобритания), Стюарт Митчелл и Хизер Рингроуз (Гамильтон робототехника, Великобритания), Пол оттепель, Роберт Льюис и Joby Дженкинс (ТТП Labtech, Великобритания), Пол Реардон (Swissci AG, Швейцария), Джордж Стивенс и Ogg (Alphabiotech, Дональд Великобритания), Нейл Уильямс (Markem-Imaje, Великобритания) и Грэхем Харрис (Кливленд агентство) для получения технической помощи.

Мы заявляю конфликтующие коммерческий интерес, так как LifeArc коммерциализирует следующие пункты: 96 и 48 хорошо MRC плиты, MRC висит падение печать, MORPHEUS, Pi, Ангстрем и ЛКМ кристаллизации экранов.

1 - подготовка и использование первоначального экранов, хранящиеся в плитах
Скрининг комплекты должна быть смешанной перед будучи обойтись в тарелки, потому что легких осадков или фаза разделение происходит в некоторых трубы во время хранения. Когда экран состоит из двух комплектов (2 x 48 трубки), первый трубки второй комплект помещается в расположение E1 охлаждения перевозчика. Когда экран состоит из 4 наборы (4 x 24 трубки), первый трубки второй комплект помещается в расположение C1, первый трубки третий комплект помещается в расположение E1 и первый трубки четвертое комплект помещается в расположение G1. Во время вставки трубы в их охлаждения перевозчика, крышки размещаются на подносе после стандартных 96-луночных пейзаж макета. Так как производители верхней крышки указаны также номера, это позволяет перекрестная проверка если все трубы были помещены в правильном порядке. Это также помогает заменить правильное крышки на трубы при заполнении снижение количество пластин.
Мы храним предварительно заполненные пластин при 10 ° C, компромисс, чтобы избежать замораживания и хранения при 4 ° C, который может вызвать ухудшение условий и проблем с уплотнением. Плиты хранятся до нескольких месяцев с обычно не заметно конденсация на внутренней стороне печати. Это менее верно для плиты LMB05, LMB06, LMB09 и LMB10, как они содержат условия с относительно высокой концентрации летучих реагентов (Таблица 1). Небольшое количество конденсата на внутренней стороне печати снижает эффективность герметизации и может вызвать перекрестного загрязнения между скважинами при вскрытии пластины. Чтобы помочь с предотвращения конденсации во время первоначального охлаждения, пластины могут передаваться сначала от Карусель в изолированные пикник кулер, который хранится в холодной комнате 4 ° C на ночь. Очень медленное охлаждение минимизирует развитие температурных градиентов в запечатанном скважин и тем самым снижает конденсации общий15. Кроме того после пластины хранятся в инкубаторе 10 ° C, собственных пользовательских SBS полистирола крышкой помещается на плите в верхней части каждого стека (не показан).
Весь набор наших предварительно заполненные плит может использоваться как большой начальный экран против образец роман, водорастворимые, белка. Кроме того меньше пластин может быть выбран в соответствии с конкретными требованиями. К примеру, LMB15 и LMB19 являются экраны разработаны специально для мембранных белков образцы26,27, или LMB20 является экран, сформулированы с тяжелым атомы для облегчения экспериментальных этапов дифракции данных28 (см. также : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Формулирование экранов кристаллизации белка МОРФЕУС</a>).
2. настройка кристаллизации капельки
При использовании системы 2, скрининг комплекты с значительное количество летучих реагенты должны обрабатываться в первую очередь. Это позволяет избежать конденсации, образуя на резиновые крышки SBS, которые могут повлиять на обработку крышкой и уплотнительные пластины. SBS-крышка имеет немного разминирования при вершине пластины, именно поэтому они должны быть выровнены первоначально (см. протокол, шаг 1.2.6). Белок мертвых тома в скважинах ПЦР пластины являются сравнительно щедрые (0,8 мкл, легенда см. Таблицу2). Обратите внимание, что одинаково щедрым мертвых тома работают при использовании nanoliter распределитель индивидуально с белком в 8-Ну полоски (Таблица 4). Меньшие объемы мертвых может работать, однако некоторые образцы придерживаться советов, калибровка робот может стать немного неточен, комната может быть теплее, чем обычно, и т.д. Все ведут к образца потерь, охватываемых щедрой мертвых томов с целью консолидации подхода.
Последние события позволили дальнейшего миниатюризация экспериментов и следовательно объем выборки, необходимых для отбора кристаллизации условий может быть значительно снижено путем интеграции соответствующих технологий29,30 . Однако некоторые аспекты дальнейшей миниатюризации нуждаются тщательного рассмотрения, например испарение капелек31 и манипуляции микрокристаллов32.
Наконец центрифугирования пластины (2000 об/мин, 1 мин) могут быть включены в качестве обычной последнего шага при настройке кристаллизации капель (в сферических верхний скважин). Более последовательной размер и форму капель результате центрифугирования может уменьшить воспроизводимость вопросы33,34. Конечно по центру капли облегчит позднее оценки экспериментов с использованием микроскопа как Фокусное будет похож по всей пластине.
3. преимущества метода 4-угловой
Наиболее важным преимуществом метода 4-угол является его простота, которая минимизирует ошибки и облегчает простой автоматизированные протоколы. Например 4 угла решения всегда будет делаться на палубе жидкого обработчика после тот же макет. Кроме того все программы основываются на фиксированных соотношений между решениями (рис. 3 c). Ручная подготовка 4 угла решений является предпочтительным для автоматизированной обработки решений при высоких концентрациях, которые могут быть высоковязких. Относительно быстрый и точный стремление/дозирования затем возможно на большинстве типов жидких обработчиков с минимальным требованиям для оптимизации жидкого классов. Тем не менее некоторые решения угол может быть слишком вязкие робота с жидкостью системы эффективно работать. Вот почему мы выбрали для обработчика жидкость с положительным смещением (рисунок 3B).
В дополнение к 2 линейных градиентов концентраций третий компонент (например, набор буферов/добавок) может испытываться при постоянной концентрации удобным способом. Для этого относительно большой объем основного набора решений угол в достаточно высокой концентрации, за исключением компонента, чтобы быть разнообразны, подготовлен впервые. Затем запасов решения, включая этот компонент добавляется отрегулировать последний концентрации. Например 50 мл набора 4 угла решений готовятся при более высоких концентрациях 10% чем первоначально. Этот основной набор затем делится на 5 небольших подмножеств 4. Наконец 10% объема различных буфера рН растворов добавляется к каждому подмножеству.
4. форматы и типы добавка экранов
Экраны обычно хранятся при температуре-20 ° C (рис. 4), так как они не используются регулярно и содержат летучих/нестабильных соединений. Использование замороженных добавка экрана, хранящиеся в блоке глубоких скважин (1 мл в скважинах) должна быть спланирована рано, потому что это займет 12-24 hr для всех добавка решения полностью разморозить при комнатной температуре. Кроме того множество пользователей доля же добавка экрана, потенциально вызывая проблемы с перекрестного загрязнения. Наконец высота глубинно блоков делает их непригодными для большинства nanoliter распылителей. Как удобное решение для обхода этих проблем экран должны быть переданы из блока глубинно низкопрофильные пластины (рис. 4).
Исторически добавка экраны, которые включают в себя широкий спектр одного реагентов (с одной концентрации) были очень популярны в35,36. Однако были разработаны другие виды добавка экранов, которые интегрируют смеси добавок37 или уменьшение количества одного добавок в различных концентрациях38. Наконец дополнительный подход является исследовать влияние добавок на образцах до кристаллизации39,40.
5. Дополнительные соображения
Хорошая практика: Большинство экранов содержат вредных или даже токсичных веществ и следовательно надлежащей личной защиты должны быть использованы во время протоколов. Аналогичным образом движущихся частей роботов может привести к травм, особенно при попытке вручную вмешаться во время программы (хотя большинство роботов имеют кнопки/системы аварийной остановки). Из-за технических сложностей, участвующих, регулярные проверки роботов, экраны и программ с ранее характеризуется испытательные образцы имеют важное значение для устойчивого высокий уровень воспроизводимости.
Пропускная способность: Как признак между 4000 до 8000 ЛКМ пластины производится ежегодно с системой 1 (и впоследствии занятых пользователями для первоначальной проверки). Она не адаптирована к складе большое количество предварительно заполненные пластин при 10 ° C, когда ожидаемый оборот значительно ниже, поскольку после 4-5 месяцев, некоторые условия начнут ухудшаться и испаряются. Различные подходы к автоматизации протоколы были реализованы для малого и среднего размера лаборатории41.
Хранение и оценки экспериментов: После подготовки капельки, пластины, хранятся на полках низкой вибрации в комнате на 4 или 18 ° C с плотно контролируемой температуре (+ /-0,5 ° C максимальное отклонение). Эксперименты, оцениваются с помощью Микроскопы источник холодного света. Различных автоматизированных систем тепловидения коммерчески доступны, однако следует тщательно рассмотреть все аспекты: скорость, необходимые для сканирования пластина будет достаточно для обеспечения высокой пропускной способности? Помешает ли объекты, отличные от кристаллов с автофокусом? Результирующее качество изображения будет достаточно, чтобы пятно очень маленькие кристаллы (особенно вокруг края капель)? 42 , 43 , 44
Сравнение условий кристаллизации: После тщательного исследования о природе первоначально полученные кристаллы можно анализировать тенденции и сходство через условий с использованием <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">ЛКМ экран базы данных</a> или C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Веб-инструмент</a>45.

Рентгеноструктурного анализа широко применяется для дальнейшего продвижения нашего понимания механизмов биологического и болезни на атомном уровне и впоследствии оказать рациональные подходы к обнаружения наркотиков1. Для этого, очищенной и концентрированные (2-50 мг/мл) высокомолекулярных образцы белков, ДНК, РНК, других лигандов и их комплексы тестируется для их склонность к форме приказал трехмерной решетки через кристаллизации2,3 ,4. Когда высокое качество кристаллов получаются которые преломлять рентгеновские лучи, Кристаллическая структура может быть решена в вблизи атомных резолюции5,6. Самое главное условий кристаллизоваться Роман образец не может быть предсказана и доходность высококачественных кристаллов обычно очень низка. Основная причина, что многие образцы интерес сложных биохимических свойств, которые делают их нестабильным на соответствующей шкале для кристаллизации (обычно через несколько дней). Наконец этот процесс осложняется время, необходимое для получения образцов и образцов вариантов и оптимизировать их очистки и кристаллизации7,,8.
Условие кристаллизации представляет собой решение с осадителя, что уменьшает растворимость образца, и условия также часто содержат буферов и добавок. Изменить параметры кристаллизации экспериментов, как у них низкая склонность к мешать образца целостность (например, белка или нуклеиновых кислот разворачивается) хорошо подходят сотни таких реагентов. Хотя тестирование миллионы комбинаций кристаллизации реагентов не осуществимо, тестирование нескольких до многих наборы скрининг - сформулированы с различными стратегиями9,10 - возможна с миниатюризировано испытания и автоматизированные протоколы. С этой точки зрения наиболее поддаются техника, вероятно, диффузии паров с 100-200 nL капельки, сидя на небольшой хорошо выше водохранилища, содержащий состояние кристаллизации (25-250 мкл), в специализированных кристаллизации пластины11 , 12. Образец протеина и состояния часто комбинируются в соотношении 1:1 общий объем 200 nL при настройке капельки в верхнем Уэллс. Робот nanoliter кристаллизации белка может быть реализован с альтернативные методы и пластины как заместитель нефти партии13 и липидный кубической фазы14 (последний применяется специально для транс мембранных белков, которые являются очень плохо растворим в воде).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">Средство кристаллизации на MRC-LMB</a> было начато в начале 2000-х и начале резюме наших автоматизированных протоколов был представлен в 2005 году15. Был представлен исторический введение в кристаллизации белка и также наброски преимущества роботов nanoliter подход (затем новаторский подход к обычной эксперименты). С макромолекулярных кристаллизации является по существу стохастический процесс с очень мало или вообще не предварительного информацию, используя широкий спектр (подходит) начальных условий увеличить выход качество дифракции кристаллы16. Кроме того преимуществом часто упускается из виду большой начальный экран является значительно сократить потребность в оптимизации образцов и кристаллов во многих случаях. Конечно может все еще нужно приступить к оптимизации некоторых первоначальных условий позднее. Как правило затем систематически исследованы концентрации реагентов и рН. Больше реагентов может быть также введено в оптимизированный условие(я) далее изменить параметры кристаллизации. Конечно один следует попытаться кристаллизации с образцом свежеприготовленные, поэтому соответствующие протоколы должны быть просто и доступно любое время.
Здесь два полностью автоматизированных систем, направленных на MRC-ЛКМ (системы 1 и 2) и полностью описаны соответствующие протоколы. Основное применение этих двух систем первоначальный отбор путем диффузии паров в сидя падение кристаллизации пластины. Система 1 интегрирует жидкого обработчик, автоматизированных карусель на складе пластины, струйный принтер для маркировки пластины и герметик клей пластины. В системе 1 72 96-луночных пластины заполнены с коммерчески доступных скрининг наборы (80 мкл состояния переданы водохранилища от начального объема 10 мл в пробирки), помечены и опечатаны. Пластины, затем хранятся в 10 ° C инкубатор, где они доступны для пользователей в любое время (как первоначальный экраны под названием «ЛКМ пластины»).
Система 2 интегрирует жидкого обработчик, диспенсером nanoliter и герметик клей пластины. В системе 2, сидя капельки (100-1000 nL) для экспериментов диффузии пара производится путем объединения условий и образец в верхнем Уэллс 20 пластин 48 или 96-луночных предварительно заполнены с условиями. Это означает, что 1,920 условия первоначальной проверки тестируется при использовании 20 пластин ЛКМ в системе 2.
Роботы используются также индивидуально для оптимизации выбранных условий, а также описываются соответствующие полуавтоматические протоколы. 4-угол метод17 используется регулярно производить оптимизации экраны. Соответствующий протокол сначала требует ручной подготовки 4 решения («A, B, C и D»). Затем два линейных градиентов концентраций (для двух основных кристаллизации агентов) автоматически создаются непосредственно в водоемы кристаллизации плиты. Для этого обработчик жидкого шприц обходится 4 угла решения в различных соотношениях.
Для дальнейшей оптимизации условие, можно использовать добавки экраны, которые потенциально улучшают свойства результате кристаллы18. Существуют два подхода для добавка скрининга: протокол, начиная с добавками, обойтись в водоемы кристаллизации пластины перед настройкой капельки (протокол 1) и еще один протокол, где распределяется добавка экран непосредственно на капельки (протокол 2).
Также представлены другие полезные события, которые были инициированы на MRC-ЛКМ для облегчения автоматизированных макромолекулярных кристаллизации. По существу кристаллизации пластины и связанных устройств, таких как стекируемых общества из биомолекулярных скрининг (SBS) крышкой, что сводит к минимуму испарения условий при использовании системы 2.
Для краткости предполагается, что пользователи знакомы с основными функциями и поддержания nanoliter распылитель, струйный принтер и sealer клейкой пластины. Если не указано иное, пластины на палубе роботов расположены таким образом, что хорошо A1 («A1-уголок») — к обратно левый угол пластины перевозчика.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Robots</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freedom EVO&#174;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microlab&#174; STAR&#8482;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&#8482; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mosquito&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dragonfly&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive plate sealer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inkjet printer 9232</td>
			<td>Markem-Imaje</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystallization screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-110</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen 2&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-112</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009530</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009531</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Ammonium Sulfate</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-211</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG/LiCl</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-217</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick Screen&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-221</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Sodium Chloride</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-219</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG 6000</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-213</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; MPD</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-215</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemFac&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-114</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PEG/Ion&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-126</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Natrix&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-116</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen Lite&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Lite screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009536</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009537</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS1</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-101L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS2</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-102L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS3</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-103L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS4</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-104L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS5</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-105L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS6</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-106L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS7</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-107L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS8</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-108L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS9</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-109L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS10</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-110L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Index&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-144</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-107</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 2</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-109</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemStar&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-21</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemSys&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-25</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JCSG-plus&#8482; Suite</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >130720</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-46</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi minimal screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-127</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi-PEG screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; II screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-91</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LMB crystallization screen&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-98</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Additive screens</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT additive screen</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-138</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-93-500</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (500 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-93</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped wells (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100-FX</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped well (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HIPPOCRATES additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>n/a</td>
			<td >48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS&#174; III).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Other consumables</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well MRC 2-drop plate</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MRC 96T-UVP</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >48-well MRC 1-drop plate&#160; (&#39;MAXI plate&#39;)</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MMX01-UVP&#160;</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 &#181;L. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MRC hanging drop seal</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive sealing tape</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR4-50</td>
			<td >3-inch wide Duck&#174; HD Clear&#8482; for sealer and manual sealing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive aluminium sheet</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >538619</td>
			<td >Used to reseal additive screens.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ink cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>9651</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Solvent cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>8652</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L tips&#160;</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>235947</td>
			<td >System 2 (STAR&#8482; liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE&#8482; tips in disposable stacks.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent container</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>194052</td>
			<td >Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate</td>
			<td >Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td >AB-2150</td>
			<td >System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito&#174;). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microsyringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03020</td>
			<td >Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito&#174; nanoliter dispenser (9mm spacing).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >strip-holder block</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >3019-05013</td>
			<td >SSB device for the Mosquito&#174; strips, aka &#39;4-way Reagent Holder&#39;.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03110</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03100</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL syringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07100</td>
			<td >Syringe body and piston for the Dragonfly&#174; liquid handler. Pack of 100.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Troughs/Reservoirs</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07103</td>
			<td >Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly&#174;. Pack of 50.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital microplate shaker</td>
			<td>CamLab Limited</td>
			<td>n/a</td>
			<td >Variomag&#174; for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate mixer</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>3121-01015</td>
			<td>MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology

Когда высокое качество кристаллов получаются которые преломлять рентгеновские лучи, Кристаллическая структура может быть решена в вблизи атомных резолюции. Условия для кристаллизации белков, ДНК, РНК и их комплексы, однако, не может быть предсказано. Используя широкий спектр условий является способом увеличить выход качество дифракции кристаллов. Два полностью автоматизированных систем разработаны на MRC лаборатории молекулярной биологии (Кембридж, Англия, MRC-LMB), способствовать кристаллизации скрининг против 1,920 начальных условий путем диффузии пара в nanoliter капель. Полуавтоматические протоколы были также разработаны для оптимизации условий путем изменения концентрации реагентов, рН, или путем введения добавки, которые потенциально улучшают свойства результирующего кристаллов. Все соответствующие протоколы будут подробно описаны и кратко обсудили. Взятые вместе, они позволяют удобно и очень эффективным макромолекулярных кристаллизации в объекте нескольких пользователей, давая пользователям контроль над ключевыми параметрами своих экспериментов.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Автоматизированные системы и протоколы для регулярной подготовки большого числа экранов и nanoliter кристаллизации капельки для экспериментов диффузии паров описаны и обсуждены.

Автоматизированные протоколы для высокомолекулярных кристаллизации в MRC лаборатории молекулярной биологии

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Высокая точность FRET на уровне одиночной молекулы для определения структуры биомолекулы

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Растущий белок кристаллы с отдельных измерений с помощью автоматизированных кристаллизации, в сочетании с в Situ Динамическое рассеяние света

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Single-step очистка макромолекулярных комплексов с помощью РНК, биотин и фото горные компоновщика

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Характеристика на молекулярном уровне с использованием надежных биохимических подходов нового белка киназы

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Стратегический скрининг и характеристика визуального GPCR-мини-G Белковый сигнальный комплекс для успешной кристаллизации

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Точечная вариационная флуоресцентная корреляционная спектроскопия для анализа молекулярной диффузии на плазматической мембране живых клеток

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

ПЦР-мутагенез, клонирование, экспрессия, протоколы быстрой очистки белка и кристаллизация дикого типа и мутантных форм триптофанссинтазы

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Сбор последовательных данных с фиксированной целью на алмазном источнике света

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Рабочий процесс и инструменты для скрининга кристаллографических фрагментов в Берлинском центре Гельмгольца

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...