Name: automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

La instalación de cristalización de MRC-LMB es amablemente respaldado por el Medical Research Council (Reino Unido). Agradecemos a los miembros del LMB por su apoyo: Olga Perisic (PNAC) y Tony Warne, Fusinita Van den Ent, Pat Edwards (estudios estructurales), Steve Scotcher, los otros miembros del taller mecánico, Neil Grant y Jo Westmoreland (ayudas visuales), Paul Hart y Tom Pratt (IT). También nos gustaría dar las gracias a Steve Elliot (Tecan, Reino Unido), Mitchell Stuart y Heather Ringrose (robótica de Hamilton, Reino Unido), Paul Thaw, Robert Lewis y Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Suiza), George Stephens y Donald Ogg (Alphabiotech, Reino Unido), Neil Williams (Markem Imaje, Reino Unido) y Graham Harris (la Agencia de Cleveland) para la ayuda técnica.

1. los dos sistemas (proyección inicial) totalmente automáticos
<ol><li>
Sistema 1: preparación de placas de 96 pocillos cristalización 72 lleno de proyección kits (placas LMB)
	<ol>
<li>Antes de realizar el procedimiento, asegúrese de que los robots del sistema son inicializados y su software de control está abierta. Encienda el refrigerador de la compañía tubo de enfriamiento aproximadamente 30 minutos antes de iniciar el programa principal.</li>
		<li>Coloque una placa de prueba en la compañía SBS motorizada del sellador de placa. Ejecute el sellador de placa y compruebe que la película se aplica adecuadamente. Repita esta prueba dos veces más para verificar que el sellador de placa está listo.</li>
		<li>Luego, añada 20 L de agua desionizada en el contenedor principal del controlador del líquido. Desconecte los insertos de acople del recipiente pequeño (etanol del 20% solución de enjuague) y conectar los insertos en el contenedor principal.</li>
		<li>Escriba el nombre de pantalla apropiada (tabla 1) en la pantalla táctil de la impresora de inyección de tinta. A continuación, abra y cierre la puerta de carrusel para activar la rotación del carrusel. Abrir la puerta cuando se presenta la primera pila.</li>
		<li>La primera pila con 22 placas de cristalización, cada uno con la cara de la columna 1 de cargarse hacia fuera. De la misma forma de cargarse las dos pilas.</li>
		<li>Carga de las 6 placas restantes en las posiciones más altas de la pila de cuarto. A continuación, cierre la puerta del carrusel.</li>
		<li>Verificar que el display del refrigerador indica 14 ° C. Suavemente y varias veces invierten los kits de detección seleccionado durante 1 minuto. A continuación, abra el panel frontal del controlador del líquido.</li>
		<li>Abrir los tubos y colocarlos en el transportador de enfriamiento según la disposición estándar de 96 pocillos (A1, A2, etcetera). Al colocar cada tubo en el portabebé, coloque la tapa sobre una bandeja en el mismo diseño de 96 pocillos.</li>
		<li>Comprobar el tubo de posiciones y asegurar que todos los tubos de nivel y se instalaron en el portador. A continuación, cierre el panel frontal.</li>
		<li>En la ventana de 'Inicio' del software controlador líquido, seleccione "Ejecutar mantenimiento" y abrir el programa de lavado. Ejecute el programa para eliminar el etanol del 20% del sistema y el exterior de las puntas de dosificación de líquido de lavado.</li>
		<li>Cuando termine la descarga, haz clic en 'Cancelar' para volver a la 'Startup'. Seleccione 'Ejecutar un proceso existente' y pulse 'Inicio su selección. Abrir el programa 'MRC kit distribución'. Rellene '18' para 'Casos' en la configuración de la pantalla y ejecutan el programa.</li>
		<li>Monitor del sistema están marcados los cuatro primeros platos, llenado y sellado.</li>
		<li>Una vez que todas las 72 placas han sido preparadas y colocados en el carrusel, cambiar los insertos de acople del contenedor principal para el recipiente. Ejecute el programa de 'Puesta en marcha flush' (ver paso 1.1.10).</li>
		<li>Apagar el refrigerador y deseche el vacío kit tubos de detección. Cuidadosamente retire las placas preparadas 72 el carrusel. Deseche el llenado incorrectamente o mal sellado de las placas. Almacenar las placas listo para su uso a 10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sistema 2: configuración de gotas de cristalización (proteína nL 100 + 100 nL condición) de una muestra de 20 placas LMB
	<ol>
<li>En primer lugar, asegúrese de que robots del sistema están en el dispensador nanoliter se inicializa con el software abierto y administrador del método del controlador líquido está abierta. Gire en el transportador de enfriamiento microtubo unos 15 minutos antes de iniciar el programa principal.</li>
		<li>Coloque una placa de prueba en la compañía SBS motorizada del sellador de placa. Ejecute el sellador de placa y verificar que la placa está correctamente sellada. Pruebe el sellador de placa tres veces.</li>
		<li>A continuación, ejecute el nanoliter dispensador para nL 100 gotas de solución de la prueba en una placa de prueba. Ver bajo un microscopio que las gotas están ajustadas correctamente. Cierre el software de dispensador nanoliter y retire el bloque del sostenedor de la tira de la cubierta.</li>
		<li>A continuación, inserte en el portaplacas personalizados (ver Resultados de representante: cristalización dispositivos desarrollados en el LMB) la placa de la LMB con la mayor cantidad relativa de reactivos volátiles en sus condiciones (tabla 1). Quite la película adhesiva de la placa.</li>
		<li>Abrir el panel frontal del controlador líquido y coloque la placa no sellada en la cubierta, en la parte posterior de la primera compañía de deslizamiento (deslizamiento portadores puede sacarse para facilitar el acceso).</li>
		<li>Cubra la placa con una tapa de aluminio de la SBS. Colocar la tapa hacia la esquina posterior izquierda del portador aplicando presión suave en la esquina opuesta de la tapa.</li>
		<li>Unseal, cargar en los portadores de la correderos y cubrir las restantes 19 placas de la misma manera, trabajar de más a menos volátiles condiciones. Una vez que el portador de microtubo de enfriamiento a 4 ° C, como se indica por una luz verde, retire su tapa.</li>
		<li>Cortar la tapa de un microtubo que contiene (al menos) 440 μl de la muestra de proteína (cuadro 2). Asegúrese de que la muestra no tiene ninguna espuma sobre el menisco, como esto interferirá con el sistema de detección de líquido. Coloque el tubo en la posición 1 del portador del microtubo de enfriamiento.</li>
		<li>Coloque una placa de la polimerización en cadena en la cubierta de líquido controlador frente el portador adaptador placa móvil. A continuación, cierre el panel frontal.</li>
		<li>Después de cargar la cubierta, asegúrese de que la cubierta de dispensador nanoliter está clara del bloque del sostenedor de la tira y que los portadores en la parte posterior de las pilas de punta de 50 μl de las tapas de aluminio SBS.</li>
		<li>En la interfaz de controlador líquido 'Método de gestión', seleccione 'Configuración de placas'. Controlar la inicialización de ambos sistemas y rellene los parámetros de funcionamiento. Seguir las directrices de la interfaz del método de gestión (avisos, figuras y un sistema de gestión de punta ayuda con la preparación).</li>
		<li>Comprobar que todos los necesarios componentes están listos y luego iniciar el proceso.</li>
		<li>Monitor del sistema como el dispensador de nanoliter pone las gotas en la primera placa y el sellador de placa posteriormente sella la placa.</li>
		<li>Una vez que todas las 20 placas han sido preparadas con gotitas de cristalización y volverá automáticamente a los portadores de la correderos, abrir el panel frontal y retire suavemente las placas. Compruebe que las placas estén selladas correctamente antes de almacenar para la cristalización.</li>
		<li>Limpie las tapas de la SBS con una solución de etanol al 20% antes de apilarlos en el lado izquierdo del controlador del líquido para el almacenamiento. Deseche la placa de la polimerización en cadena y microtubo.</li>
		<li>Apague el transportador enfriamiento microtubo y limpie la condensación. Deje una toalla de papel sobre la superficie del evaporador para absorber la condensación. A continuación, vuelva a colocar la cubierta del portador y cierre el panel frontal.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. optimización de las condiciones
<ol><li>
Jeringa-manejador basado en el líquido: producir dos gradientes lineales de concentraciones en los embalses de una placa de cristalización (el método de la esquina 4).
	<ol>
<li>Primero, asegúrese de que el controlador de líquido en e inicializado con su software abierto.</li>
		<li>En el 'gradiente' tab: abrir el programa deseado, seleccione el tipo de placa de cristalización y el volumen final en los reservorios (tabla 3). La configuración avanzada para 'máximo tiro vol' debe ser bajada de 6.000 a 3.000 al utilizar soluciones que contengan [isopropanol] > 10% v/v y [MPD] > 20% v / v.
</li>
		<li>Preparar las jeringas. Colocar un pistón en cada jeringa (extremos puntiagudos hacia abajo) e introduzca la parte posterior de las jeringas en las ranuras designadas por debajo de la cabeza del robot. La torcedura derecha para bloquearlo en posición (el programa se iniciará sólo con todas las jeringas requiere conectadas correctamente) una jeringa.</li>
		<li>Preparar los canales. Retire el marco de acero inoxidable e inserte las artesas. Las 4 posiciones a la izquierda corresponden a las 4 esquinas A, B, C, D. interruptor de lengüeta 'SET UP' que muestra los volúmenes de soluciones necesarias en cada jeringa (en la tabla 3, 0.5 mL de volumen muerto fue agregado a los volúmenes de muestra). Verter las soluciones de esquina en sus canales respectivos y coloque el marco en la cubierta (la estructura se mantiene en posición con 2 pequeños imanes situados en la parte delantera de la cubierta). Una forma alternativa para proceder con este paso es verter las soluciones en los canales cuando ya se colocan en la bandeja.
</li>
		<li>Coloque la placa de cristalización en el transportador motorizado de la SBS.</li>
		<li>Haga clic en 'Aspirar' y esperar a que este paso a ser completado (cuando los pistones se detuvo en su camino).</li>
		<li>Cambie a la pestaña de 'RUN' y ejecutar el programa.</li>
		<li>Al finalizar el programa, volver a la ficha Configuración y haga clic en 'Eliminar': el sistema de purga las jeringuillas con las soluciones sobrantes de y entonces levanta los pistones completamente. 'Purga' puede solicitarse en lugar de 'Eliminar'; esto dejará los pistones en la posición inferior, lista para aspirar a soluciones más con las mismas jeringas.
</li>
		<li>Retire las jeringas girándolas hacia la izquierda.</li>
		<li>Deseche las jeringas y canales en el contenedor apropiado (o enjuague con agua desionizada y luego solución etanol al 20% v/v para su reutilización).</li>
		<li>Sellar la placa y coloque en el mezclador de microplacas para 3 minutos a 1.000 rpm, o 10 minutos cuando se mezclan soluciones altamente viscosas. La placa está lista para configurar gotitas de cristalización en el dispensador nanoliter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Añadido detección protocolo 1 (configuración de gotitas de cristalización en una placa de 96 pocillos cristalización precargada con pantalla aditivo)
	<ol>
<li>En primer lugar, preparar las condiciones con las concentraciones iniciales de los reactivos aumentadas un 10% (mínimo vol. 15 mL al transferir la condición de un contenedor en la pantalla del aditivo con el controlador de líquido).</li>
		<li>Asegúrese de que el controlador de líquido está listo para funcionar. Abrir el programa 'Pantalla agregar aditivos' para una sola placa (Introduzca el volumen en depósitos: 'μl 72'). De los avisos, figuras y una punta-sistema (puntas 12 x 1.000 μl necesarias) ayuda con asegurándose de que el robot está listo para funcionar según las selecciones de.
</li>
		<li>Recuperar la pantalla de la incubadora de-20 ° C y retirar inmediatamente el sello de aluminio (utilice el sostenedor de la placa), luego colocar la placa en la cubierta del controlador del líquido. El programa opera de acuerdo con un diseño de retratos (la placa se coloca con la esquina A1 ubicada en la parte delantera izquierda del portador de la). También colocar también el recipiente llenado con la condición. Ejecute el programa.</li>
		<li>Una vez que se han llenado los depósitos de la placa, colocar en el agitador de microplacas y ejecutar el programa. Enjuague el recipiente de condición con desionizada agua y 20% de etanol para su reutilización.</li>
		<li>
Configurar las gotitas en el dispensador nanoliter. En primer lugar, unseal la placa de cristalización (uso el sostenedor de la placa). Entonces, lugar que tira de la placa y la proteína 8-bien en la primera posición del bloque del sostenedor de la tira. La ficha 'Configuración' en el software de control muestra las posiciones reales de cada componente en la cubierta. Carga cada uno de la tira con la muestra de proteína según el tamaño de la gota necesario (tabla 4). Ejecutar el programa para preparar gotas.
</li>
		<li>Al finalizar el programa, retire la placa de la cubierta y sellar inmediatamente (utilizar el sellador de placas, cinta adhesiva ancha de 3 pulgadas). Deseche la tira en el recipiente adecuado.</li>
		<li>Evaluar el tamaño, forma y centrado de las gotitas al microscopio antes de guardarla.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Añadido detección protocolo 2 (creación de gotitas de cristalización en una placa de 96 pocillos cristalización con una pantalla de aditiva reutilizable)
	<ol>
<li>En primer lugar, preparar la pantalla añadida: dejar la correspondiente placa de cultivo celular de 96 pozos congelados se descongele a temperatura ambiente durante 40 minutos. Luego, centrifugar la pantalla añadida a 1.000 x g durante 2 minutos.</li>
		<li>Preparar la condición (vol. min 15 mL al transferir la condición de un contenedor en la pantalla del aditivo con el controlador de líquido).</li>
		<li>Llenar los depósitos de una placa de 96 pocillos cristalización con la condición. En el controlador de líquido, proceder del mismo modo que el protocolo 1, paso 2.2.2, pero entrar en '80 μl' para el volumen en depósitos.</li>
		<li>Configurar las gotitas en el dispensador nanoliter con 3 componentes en la cubierta (la placa que contiene la pantalla añadida, junto con la placa de cristalización y la tira de proteína 8-bien en la primera posición del bloque del sostenedor de la tira, tabla 4).</li>
		<li>Sellar la placa de cultivo celular que contiene la pantalla con una hoja de aluminio y colóquelo en la incubadora de-20 ° C.</li>
		<li>Evaluar el tamaño, forma y centrado de las gotitas al microscopio antes de guardarla.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Por este medio manifestamos un interés comercial conflictivo desde LifeArc comercializa los siguientes elementos: placas 96 - y 48-pozo MRC, el sello MRC de la gota colgante, las pantallas de cristalización MORPHEUS, Pi, ANGSTROM y LMB.

1 - preparación y uso de pantallas iniciales en las placas
Kits de detección se debe mezclar antes de ser despachado en placas porque luz separación de fase o precipitación ocurre en algunos tubos durante el almacenamiento. Cuando una pantalla se compone de dos kits (tubos de 2 x 48), el primer tubo del segundo juego se coloca en E1 lugar del portador del enfriamiento. Cuando una pantalla se compone de 4 kits (4 x 24 tubos), el primer tubo del segundo juego se coloca en lugar C1, el primer tubo de la tercera equipación se coloca en la posición E1 y el primer tubo del cuarto juego se coloca en la ubicación G1. Al insertar los tubos en su portador de enfriamiento, las tapas se colocan en una bandeja siguiendo el diseño estándar de 96 pocillos de paisaje. Ya que los fabricantes indican números bien encima de las tapas, esto permite contrastar si todos los tubos han sido colocados en el orden correcto. Esto también ayuda a reemplazar las tapas correctas en los tubos cuando un número reducido de placas de relleno.
Almacenamos las placas similares previos a 10 ° C, un compromiso para evitar la congelación y almacenamiento a 4 ° C que pueden causar deterioro de las condiciones y problemas con el lacre. Las placas se almacenan durante varios meses normalmente sin notable condensación sobre la cara interior del sello. Esto es menos cierto para LMB05, LMB06, LMB09 y LMB10 placas como éstos contienen condiciones con concentraciones relativamente altas de reactivos volátiles (tabla 1). Pequeña cantidad de condensación en el lado interno de la Junta reduce la eficiencia de sellado y puede causar contaminación cruzada entre pozos al desprecintar las placas. Para ayudar con la prevención de la condensación durante el enfriamiento inicial, las placas pueden ser transferidas primero desde el carrusel en un picnic aislado refrigerador que se almacena en cuarto frío de 4 ° C durante la noche. El enfriamiento muy lento minimiza el desarrollo de gradientes de temperatura dentro de los pozos cerrados y por lo tanto, reduce la condensación total15. Además, una vez que las placas se almacenan en la incubadora de 10 ° C, una interno personalizada tapa poliestireno de SBS se coloca en la placa en la parte superior de cada pila (no mostrado).
El conjunto de nuestras placas de prellenado puede utilizarse como una gran pantalla inicial contra una muestra de proteína soluble en agua, novela. Como alternativa, menos placas pueden ser seleccionadas para que coincida con los requisitos específicos. Por ejemplo, LMB15 y LMB19 son pantallas especialmente formulados para la membrana proteína muestras26,27, o LMB20 es un formulado con átomos pesados para facilitar la eliminación experimental de datos de difracción28 (véase también : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formulación de las pantallas de cristalización de proteínas de Morfeo</a>).
2. creación de gotas de cristalización
Al usar el sistema 2, proyección kits con importantes cantidades de reactivos volátiles debe ser procesado primero. Esto evita la condensación en la goma de las tapas de la SBS, que afecten el manejo de tapa y sellado de la placa. Una tapa SBS tiene un poco de espacio libre cuando en la parte superior de una placa, que por eso necesitan alinearse inicialmente (ver Protocolo, paso 1.2.6). Los volúmenes muertos de proteína en los pocillos de la placa PCR son relativamente generoso (0,8 μl, ver leyenda del cuadro 2). Tenga en cuenta que igualmente generosos volúmenes muertos se emplean cuando se usa el dispensador nanoliter individualmente con la proteína en tiras de 8 pocillos (tabla 4). Menores volúmenes muertos puede funcionar, sin embargo algunas muestras se adhieren a las puntas, calibración de un robot puede llegar a ser un poco inexacto, la sala puede ser más caliente de lo habitual, etcetera. Llevar a pérdidas de la muestra cubiertas por los generosos volúmenes muertos para consolidar el enfoque.
Novedades más permitió la miniaturización de los experimentos y por lo tanto, el volumen de muestra requerido para la detección de las condiciones de cristalización puede reducirse significativamente mediante la integración de la correspondiente tecnología29,30 . Sin embargo, algunos aspectos de la mayor miniaturización necesitan una cuidadosa consideración, tales como la evaporación de gotitas31 y la manipulación de microcristales32.
Por último, centrifugación de la placa (2.000 rpm, 1 minuto) podría integrarse como paso final rutina al configurar gotitas de cristalización (en los pozos de superior esféricas). Un tamaño y forma de las gotas resultantes de centrifugación más consistente pueden reducir problemas de reproducibilidad33,34. Sin duda, gotas centradas facilitará la posterior evaluación de experimentos utilizando un microscopio como la longitud focal necesaria será similar en toda la placa.
3. ventajas del método 4-esquina
La ventaja más significativa del método 4-esquina es su simplicidad, que minimiza los errores y facilita sencillos protocolos automatizados. Por ejemplo, las soluciones de 4 esquina siempre se colocará en la cubierta de un líquido controlador siguiendo el mismo diseño. Además, todos los programas se basan en relaciones fijas entre las soluciones (figura 3). Preparación manual de las soluciones de 4 esquina se prefiere al manejo automatizado de soluciones en las altas concentraciones que pueden ser altamente viscosas. Entonces es posible en la mayoría de los tipos de controladores de líquido con requisitos mínimos para la optimización de las clases de líquido relativamente rápido y preciso de aspiración/dispensación. Sin embargo, algunas soluciones de esquina pueden todavía ser demasiado viscosos para un robot con un sistema de líquido para funcionar eficientemente. Por esta razón, optamos por un controlador líquido con desplazamiento positivo (figura 3B).
Además de los 2 lineales gradientes de concentraciones, un tercer componente (es decir, un conjunto de buffers/aditivos) puede analizarse en una concentración constante de una manera conveniente. Para esto, un volumen relativamente grande de un conjunto básico de soluciones de esquina en una concentración más alta convenientemente, excluyendo el componente a ser variada, se prepara en primer lugar. Luego, soluciones incluyendo este componente se añade para ajustar las concentraciones finales. Por ejemplo, se preparan 50 mL de un conjunto de soluciones de esquina 4 en concentraciones más altas de 10% que inicialmente. Este conjunto básico es entonces dividida en 5 subconjuntos más pequeños de 4. Por último, 10% en volumen de soluciones de diferentes pH de buffer se agrega a cada subconjunto.
4. formatos y tipos de pantallas de aditivos
Las pantallas normalmente se almacenan a-20 ° C (figura 4), puesto que no se utilizan regularmente y contienen compuestos volátiles/inestable. El uso de una pantalla aditivo congelado en un bloque de pozo profundo (1 mL en los pozos) debe planificarse temprano porque tarda 12-24 horas para todas las soluciones aditivas se descongele completamente a temperatura ambiente. También, una multitud de usuarios compartir la misma pantalla aditiva, puede provocar problemas con la contaminación cruzada. Finalmente, la altura de pozos profundos bloques hace inadecuado para la mayoría nanoliter dispensadores. Como una solución conveniente para eludir estos problemas, la pantalla debe ser transferida desde el bloque de pozo profundo a las placas de bajo perfil (figura 4).
Históricamente, aditivas pantallas que incluyen una amplia variedad de reactivos individuales (con concentraciones individuales) han sido muy populares35,36. Sin embargo, han desarrollado otros tipos de pantallas de aditivos que integran la mezcla de aditivos37 o un número reducido de aditivos individuales en diferentes concentraciones38. Por último, un enfoque complementario es investigar el efecto de aditivos sobre las muestras antes de la cristalización39,40.
5. más consideraciones
Buenas prácticas: Mayoría de las pantallas contiene sustancias dañinas o incluso tóxicas y por lo tanto debe emplearse protección personal adecuada durante los protocolos. Igualmente, las piezas de los robots móviles pueden conducir a lesiones, sobre todo cuando se trata de interferir manualmente mientras está ejecutando un programa (aunque la mayoría de los robots tienen sistema/botón de parada de emergencia). Debido a las complejidades técnicas involucradas, regulares control de robots, pantallas y programas con caracterizado previamente muestras de prueba son importantes para el sostenido alto nivel de reproducibilidad.
Rendimiento: Como indicación, entre 4.000 a 8.000 LMB placas se producen anualmente con el sistema 1 (y posteriormente empleado por los usuarios para la investigación inicial). No se adapta a la acción una gran cantidad de placas similares previos a 10 ° C cuando el volumen de ventas esperado es mucho menor, como después de 4-5 meses, algunas condiciones comenzará a deteriorarse y se evaporan. Se han implementado diferentes enfoques para protocolos de automatización para laboratorios de tamaño pequeño a mediano41.
Almacenamiento y evaluación de experimentos: Después de preparar las gotitas, las placas se almacenan en estantes de baja vibración en una habitación a 4 o 18 ° C con temperatura bien controlada (+-0.5 ° C de desviación máxima). Experimentos se evaluaron mediante microscopios de fuente de luz fría. ¿Diversos sistemas de proyección de imagen automatizados están comercialmente disponibles, sin embargo uno debe considerar cuidadosamente todos los aspectos: la velocidad necesaria para analizar un plato será suficiente para alto rendimiento? ¿Objetos que no sean cristales interferirá en enfoque automático? ¿Será suficiente con puntos muy pequeños cristales (especialmente alrededor del borde de las gotitas) la calidad resultante de las imágenes? 42 , 43 , 44
Comparación de las condiciones de cristalización: Después de cuidadosa investigación acerca de la naturaleza de los cristales obtenidos inicialmente, uno puede analizar tendencias y similitudes a través de condiciones utilizando la <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">base de datos de pantalla LMB</a> o el C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Herramienta Web</a>45.

Cristalografía de rayos x se aplica extensivamente para avanzar nuestra comprensión de los mecanismos biológicos y enfermedad a nivel atómico y posteriormente ayudar a enfoques racionales de drogas discovery1. Para ello, purificado y concentrado (2-50 mg/mL) muestras macromoleculares de proteínas, ADN, ARN, otros ligandos y sus complejos son probadas por su propensión a formar ordenó enrejados tridimensionales a través Cristalización2,3 ,4. Cuando cristales de alta calidad se obtienen que difractan los rayos x, la estructura cristalina puede resolverse en cerca de5,de resolución atómica6. Fundamentalmente, las condiciones para cristalizar una muestra novedosa no pueden ser predichas y la producción de cristales de alta calidad es generalmente muy baja. Una razón subyacente es que muchas muestras de interés tienen propiedades bioquímicas desafiantes, que los hacen inestables en el plazo correspondiente para la cristalización (por lo general unos pocos días). Finalmente, el proceso se complica por el tiempo necesario para producir las muestras y las variantes de la muestra y para optimizar su purificación y cristalización de7,8.
Una condición de la cristalización es una solución con un precipitado que reduce la solubilidad de la muestra y las condiciones a menudo también contienen los amortiguadores y los aditivos. Cientos de estos reactivos se adaptan bien para modificar los parámetros de los experimentos de cristalización ya que tienen baja propensión a interferir con la integridad de la muestra (como proteínas o ácidos nucleicos despliega). Mientras que prueba millones de combinaciones de reactivos de cristalización no es factible, prueba varios a muchos kits de detección - formulados con diferentes estrategias9,10 - es posible con ensayos miniaturizados y protocolos automatizados. En esta perspectiva, la técnica más favorable es probablemente la difusión de vapor con 100-200 gotas de nL sentado en un pozo pequeño encima de un depósito que contiene la condición de la cristalización (25-250 μL), implementada en cristalización especializada placas11 , 12. la proteína muestra y condición son a menudo combinados en una proporción de 1:1 para un volumen total de 200 nL al configurar las gotitas en los pozos de la parte superior. Cristalización de proteínas nanoliter robótica puede implementarse con técnicas alternativas y las placas de la fase cúbica lipídica14 (el último de ellos se aplica específicamente a las proteínas de membrana trans-que son como el debajo-aceite lote13 muy poco solubles en agua).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">La facilidad de cristalización en el MRC-LMB</a> se inició en la década de 2000 y se presentó un resumen temprano de nuestros protocolos automatizados en 200515. Se presentó una introducción histórica a la cristalización de proteínas y también un resumen de las ventajas de la robótica nanoliter acercarse (entonces un nuevo enfoque a la experimentación de rutina). Desde cristalización macromolecular es esencialmente un proceso estocástico con muy poca o ninguna previa información, empleando una amplia variedad de condiciones iniciales (convenientes) aumentar el rendimiento de calidad difracción cristales16. Además, una ventaja a menudo pasado por alto de una gran pantalla inicial es reducir significativamente la necesidad de optimización de las muestras y los cristales en muchos casos. Por supuesto, uno puede todavía necesita continuar con la optimización de algunas condiciones iniciales más adelante. Normalmente, la concentración de los reactivos y el pH entonces se investigan sistemáticamente. Más reactivos también pueden introducirse en la condición optimizada para modificar más parámetros de cristalización. Por cierto, uno debería tratar de cristalización con una muestra recién preparada, por lo tanto los protocolos correspondientes deben ser sencilla y disponible cualquier momento.
Aquí, dos totalmente automatizado sistemas diseñados en el MRC-LMB (sistemas 1 y 2) y los correspondientes protocolos describen detalladamente. La principal aplicación de estos dos sistemas es inicial por difusión de vapor en gota cristalización placas se sentaba. Sistema 1 integra un controlador de líquido, un carrusel automático para chapa, una impresora de inyección de tinta para el etiquetado de la placa y un sellador de placa adhesiva. En el sistema 1, 72 placas de 96 pocillos llenadas con kits de detección disponibles comercialmente (80 μl de condición transferida al depósito de un volumen inicial de 10 mL en tubos de ensayo), etiquetadas y selladas. Las placas se almacenan entonces en una incubadora de 10 ° C donde están disponibles para los usuarios en cualquier momento (como pantallas iniciales llamadas 'Placas de LMB').
Sistema 2 integra un controlador de líquido, un dispensador de nanoliter y un sellador de placa adhesiva. En el sistema 2, sentado gotas (100-1.000 nL) para experimentos de difusión de vapor se producen mediante la combinación de condiciones y la muestra en los pocillos de superior de 20 placas de 48 o 96 pocillos previamente llena de condiciones. Esto significa 1.920 condiciones de proyección inicial exitosa cuando se utilizan 20 placas LMB en el sistema 2.
Robots también se utilizan individualmente para la optimización de las condiciones, y también se describen los protocolos semi-automatizados correspondientes. El método 4-esquina17 se emplea habitualmente para producir pantallas de optimización. El protocolo correspondiente requiere primero la preparación manual de 4 soluciones ('A, B, C y D'). Dos gradientes lineales de concentraciones (para dos agentes de la cristalización principal) entonces automáticamente se generan directamente en los depósitos de una placa de cristalización. Para esto, un manejador de líquido basado en jeringa distribuye las soluciones de 4 esquina en diferentes proporciones.
Para optimizar aún más la condición, uno puede emplear pantallas aditivos potencialmente mejorar las propiedades de los cristales resultantes18. Existen dos enfoques para tamizaje aditivo: un protocolo a partir de aditivos que distribuye en los depósitos de placas de cristalización antes de configurar las gotitas (protocolo 1) y otro protocolo donde se distribuye la pantalla añadida directamente a las gotitas (protocolo 2).
Otros desarrollos útiles que se iniciaron en el MRC-LMB para facilitar la cristalización macromolecular automatizado, también se presentan. Esencialmente, cristalización placas y dispositivos asociados como un apilable sociedad de Biomolecular de detección (SBS) tapa reduce al mínimo la evaporación de las condiciones al usar el sistema 2.
Por brevedad, se supone que los usuarios están familiarizados con las funciones básicas y mantenimiento de dispensador nanoliter, la impresora de inyección de tinta y el sellador de placa adhesiva. A menos que se indique lo contrario, se colocan las placas en la cubierta de los robots que el pocillo A1 ('A1-esquina') es la esquina trasera izquierda de un portador de la placa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Robots</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freedom EVO&#174;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microlab&#174; STAR&#8482;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&#8482; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mosquito&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dragonfly&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive plate sealer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inkjet printer 9232</td>
			<td>Markem-Imaje</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystallization screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-110</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen 2&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-112</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009530</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009531</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Ammonium Sulfate</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-211</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG/LiCl</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-217</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick Screen&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-221</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Sodium Chloride</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-219</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG 6000</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-213</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; MPD</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-215</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemFac&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-114</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PEG/Ion&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-126</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Natrix&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-116</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen Lite&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Lite screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009536</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009537</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS1</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-101L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS2</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-102L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS3</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-103L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS4</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-104L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS5</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-105L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS6</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-106L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS7</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-107L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS8</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-108L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS9</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-109L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS10</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-110L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Index&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-144</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-107</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 2</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-109</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemStar&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-21</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemSys&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-25</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JCSG-plus&#8482; Suite</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >130720</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-46</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi minimal screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-127</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi-PEG screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; II screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-91</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LMB crystallization screen&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-98</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Additive screens</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT additive screen</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-138</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-93-500</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (500 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-93</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped wells (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100-FX</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped well (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HIPPOCRATES additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>n/a</td>
			<td >48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS&#174; III).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Other consumables</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well MRC 2-drop plate</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MRC 96T-UVP</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >48-well MRC 1-drop plate&#160; (&#39;MAXI plate&#39;)</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MMX01-UVP&#160;</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 &#181;L. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MRC hanging drop seal</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive sealing tape</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR4-50</td>
			<td >3-inch wide Duck&#174; HD Clear&#8482; for sealer and manual sealing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive aluminium sheet</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >538619</td>
			<td >Used to reseal additive screens.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ink cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>9651</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Solvent cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>8652</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L tips&#160;</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>235947</td>
			<td >System 2 (STAR&#8482; liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE&#8482; tips in disposable stacks.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent container</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>194052</td>
			<td >Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate</td>
			<td >Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td >AB-2150</td>
			<td >System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito&#174;). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microsyringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03020</td>
			<td >Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito&#174; nanoliter dispenser (9mm spacing).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >strip-holder block</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >3019-05013</td>
			<td >SSB device for the Mosquito&#174; strips, aka &#39;4-way Reagent Holder&#39;.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03110</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03100</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL syringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07100</td>
			<td >Syringe body and piston for the Dragonfly&#174; liquid handler. Pack of 100.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Troughs/Reservoirs</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07103</td>
			<td >Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly&#174;. Pack of 50.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital microplate shaker</td>
			<td>CamLab Limited</td>
			<td>n/a</td>
			<td >Variomag&#174; for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate mixer</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>3121-01015</td>
			<td>MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology

Cuando cristales de alta calidad se obtienen que difractan los rayos x, la estructura cristalina puede ser resuelto en cerca de resolución atómica. Las condiciones para cristalizar proteínas, ADN, ARN y sus complejos sin embargo no pueden ser predicho. Empleando una amplia variedad de condiciones es una forma de aumentar la producción de cristales de difracción la calidad. Dos sistemas totalmente automatizados se han desarrollado en el MRC laboratorio de Biología Molecular (Cambridge, Inglaterra, MRC-LMB) que facilitan la proyección de cristalización contra 1.920 condiciones iniciales por la difusión del vapor en gotas nanoliter. Protocolos semi-automatizados también se han desarrollado para optimizar las condiciones cambiando las concentraciones de los reactivos, el pH, o mediante la introducción de aditivos potencialmente mejorar propiedades de los cristales resultantes. Todos los protocolos correspondientes se describen en detalle y discute brevemente. Tomados en conjunto, permiten la cristalización macromolecular conveniente y altamente eficiente en una instalación de multiusuario, mientras que a los usuarios control sobre parámetros clave de sus experimentos.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Sistemas automatizados y protocolos para la preparación rutinaria de un gran número de pantallas y nanoliter gotitas de cristalización para los experimentos de difusión de vapor se describen y discuten.

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