Name: automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

MRC-LMB kristallisering anläggningen är vänligt stöds av medicinsk forskning rådet (Storbritannien). Vi tackar medlemmar i LMB för deras stöd: Olga Perisic (PNAC), Tony Warne, Fusinita Van den Ent och Pat Edwards (strukturella studier), Steve Scotcher och de andra medlemmarna i den mekaniska verkstaden, Neil Grant och Jo Westmoreland (visuella hjälpmedel), Paul Hart och Tom Pratt (IT). Vi vill också tacka Steve Elliot (Tecan, UK), Mitchell Stuart och Heather Ringrose (Hamilton Robotics, Storbritannien), Paul Thaw, Robert Lewis och Joby Jenkins (TTP Labtech, UK), Paul Reardon (Swissci AG, Schweiz), George Stephens och Donald Ogg (Alphabiotech, UK), Neil Williams (Markem-Imaje, UK) och Graham Harris (The Cleveland Agency) för teknisk hjälp.

1. två helautomatiserade system (initial screening)
<ol><li>
System 1: förberedelse av 72 96 brunnar kristallisering tallrikar fyllda med screening Kit (LMB pläterar)
	<ol>
<li>Innan du utför proceduren, säkerställa att systemets robotar initieras och deras kontrollerande mjukvaran är öppen. Slå på kylaren tube-kylning transportörens ca 30 minuter innan huvudprogrammet kommer att startas.</li>
		<li>Placera en test platta på motordrivna SBS bärare av plattan sealer. Kör plattan sealer och kontrollera att filmen tillämpas korrekt. Upprepa detta två gånger fler test för att kontrollera att plattan sealer är klar.</li>
		<li>Lägg sedan till 20 L avjoniserat vatten till huvudsakliga behållaren av flytande hanteraren. Koppla bort koppling skär små behållare (20% etanol sköljning lösning) och Anslut skären till huvudsakliga behållaren.</li>
		<li>Ange lämpliga skärmnamn (tabell 1) på bläckstråle skrivare pekskärmen. Sedan, öppna och stänga dörren carousel för att utlösa carousel rotation. Öppna dörren när den första stacken presenterar sig själv.</li>
		<li>Fullt Fyll på första bunten med 22 kristallisering pläterar, var och en med kolumn 1 vänd ut. Ladda fullt de nästa två högarna på samma sätt.</li>
		<li>Ladda de återstående 6 plattorna i de högsta positionerna i fjärde stapeln. Stäng sedan carousel dörren.</li>
		<li>Kontrollera att kylmaskin displayen visar 14 ° C. Försiktigt och upprepade gånger Invertera markerade screening satserna i 1 minut. Öppna frontpanelen på flytande hanteraren.</li>
		<li>Öppna rören och placera dem i den svalkande hållaren enligt 96 brunnar standardlayouten (A1, A2, etc.). Vid placering varje rör i flygbolaget, placera locket på en bricka i samma 96 brunnar layout.</li>
		<li>Dubbelkontrollera röret positioner och se till att alla rör är nivå och bosatte sig i transportören. Stäng sedan frontpanelen.</li>
		<li>I fönstret 'Start' av programvaran flytande handler, Välj 'Kör underhåll' och öppna programmet rodnad. Kör programmet att spola 20% etanol från systemet och att tvätta utsidorna av vätska-dispensering tips.</li>
		<li>När spolning är klar, klicka på 'Avbryt' om du vill återgå till 'Start'. Välj 'Kör en befintlig process' och klicka på 'Starta ditt val'. Öppna programmet 'MRC kit dispensering'. Fyll i '18' för 'Instanser' i konfigurationen skärm och kör programmet.</li>
		<li>Övervaka systemet som de fyra första plattorna är märkt, fylld och förseglade.</li>
		<li>När alla 72 plattor har beretts och sättas tillbaka i karusellen, byta koppling skär från den huvudsakliga behållaren till små behållaren. Kör programmet 'Start flush' (se steg 1.1.10).</li>
		<li>Stäng av kylmaskinen och kassera tomt screening kit rör. Ta försiktigt bort 72 förberedda plåtarna från karusellen. Kassera felaktigt-fyllda eller dåligt tillslutna plattor. Lagra färdiga att använda plattorna vid 10 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
System 2: Konfigurera kristallisering droppar (100 nL protein + 100 nL tillstånd) från ett prov i 20 LMB plattor
	<ol>
<li>Först, se till att systemets robotar är på nliter dispensern initieras med dess öppen programvara och den flytande hanterares metod manager är öppen. Slå på mikrorör-kylning flygbolaget ca 15 minuter innan huvudprogrammet kommer att startas.</li>
		<li>Placera en test platta på motordrivna SBS bärare av plattan sealer. Kör plattan sealer och verifierar att plattan försluts ordentligt. Testa den platta sealer tre gånger.</li>
		<li>Kör sedan den nliter dispensern för att ställa in 100-nL droppar av provlösningen i en test-plattan. Kolla under ett Mikroskop att dropparna är korrekt. Stäng nliter dispenser programvaran och ta bort remshållaren blocket från däck.</li>
		<li>Nästa, infoga i specialdesignade plåt hållaren (se Representativa resultat: kristallisering enheter utvecklas på LMB) LMB plattan med den högsta relativa mängden flyktiga reagenser i dess villkor (tabell 1). Ta bort den självhäftande filmen från plattan.</li>
		<li>Öppna panelen flytande handler och placera oförseglade plattan på däck, på baksidan av den första skjutbara transportören (glidande bärare kan dras ut för att underlätta åtkomst).</li>
		<li>Täck plåten med en SBS aluminium lock. Kvitta locket mot bakre vänstra hörnet av bäraren genom att tillämpa mild tryck till det motsatta hörnet av locket.</li>
		<li>Unseal, Fyll i de skjutbara bärarna och täcka de återstående 19 plattorna på samma sätt, arbeta från mest till minst volatila förhållanden. När mikrorör-kylning flygbolaget är vid 4 ° C, som indikeras av ett grönt ljus, ta bort omslaget.</li>
		<li>Skär av locket på ett mikrorör med (minst) 440 µL av protein prov (tabell 2). Se till att provet har ingen skum ovan menisken, eftersom detta kommer att störa upptäckande av flytande. Placera röret i Position 1 i mikrorör-kylning transportören.</li>
		<li>Placera en PCR-plattan på flytande handler däck framför plattan-flytta kortet transportören. Stäng sedan frontpanelen.</li>
		<li>Efter lastning däck, se till att nliter dispenser däck framgår av remshållaren blocket och att transportörerna på baksidan 50-µL tip stackarna är fri från aluminium SBS locken.</li>
		<li>I flytande handler ' metod ' administrationsgränssnittet, Välj 'Setup plåtar'. Övervaka initieringen av båda systemen och fyller i parametrarna för kör. Följ riktlinjerna i metoden administrationsgränssnittet (uppmaningarna, siffror och ett tip-ledningssystem som hjälper till med förberedelser).</li>
		<li>Dubbelkolla att alla nödvändiga komponenter är redo, och sedan starta processen.</li>
		<li>Övervaka systemet som nliter dispensern ställer in dropparna i den första plattan och plattan sealer förseglar därefter plattan.</li>
		<li>När alla 20 plattor har beretts med kristallisering droppar och automatiskt tillbaka till skjutbara bärarna, öppna frontpanelen och ta försiktigt bort plattorna. Kontrollera att plattorna förseglas korrekt innan du förvarar dem för kristallisering.</li>
		<li>Ren SBS locken med en 20% etanol lösning innan stapla dem på vänster sida av flytande hanteraren för lagring. Kassera PCR-plattan och mikroröret.</li>
		<li>Stäng av mikrorör-kylning transportören och torka bort kondensen. Lämna en pappershandduk ovanpå den kalla ytan att absorbera ytterligare kondens. Sedan ersätta transportören locket och Stäng frontpanelen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. optimering av villkor
<ol><li>
Spruta-baserade flytande handler: producerar två linjära övertoningar av koncentrationer i reservoarerna kristallisering platta (4-hörn-metoden).
	<ol>
<li>Först, se till att flytande hanteraren är på och initierats med dess öppen programvara.</li>
		<li>På 'Lutning' fliken: öppna programmet krävs, Välj kristallisering platta typen och den avslutande volymen i behållarna (tabell 3). Den avancerade inställningen för 'max sköt vol' bör sänkas från 6000 till 3000 när du använder lösningar som innehåller [isopropanol] > 10% v/v och MPD] > 20% v / v.
</li>
		<li>Förbereda sprutorna. Placera en kolv i varje spruta (spetsiga ändar ner) och sätt på baksidan av sprutor i utsedda spåren under chefen robot. Vrida en spruta medurs för att låsa det på plats (programmet startar endast med alla nödvändiga sprutorna korrekt ansluten).</li>
		<li>Förbereda Dalarna. Ta bort ramen rostfritt stål och infoga Dalarna. 4 positioner till vänster motsvarar 4 hörn A, B, C, D. Växla till 'Ställa upp' flik som visar volymerna av lösningar som krävs i varje spruta (på tabell 3, 0,5 mL dödvolym lades till de volymer som visas). Häll i hörnet lösningar i sina respektive rännor och placera ramen tillbaka på däcket (ramen håller i position med 2 små magneter som ligger på framsidan av däcket). Ett alternativt sätt att gå vidare med det här steget är att hälla lösningarna i Dalarna när de släpps redan på däck.
</li>
		<li>Placera kristallisering plattan på motordrivna SBS bärare.</li>
		<li>Klicka 'ASPIRERA' och vänta för det här steget ska slutföras (när kolvarna stoppats på väg upp).</li>
		<li>Växla till fliken 'Springa' och kör programmet.</li>
		<li>Vid slutförandet av programmet, gå tillbaka till fliken Inst. och klicka på 'Ta bort': systemet utrensningar sprutorna från överblivna lösningar och sedan lyfter kolvarna hela vägen upp. 'Rensa' kan begäras i stället för 'Ta bort'; Detta lämnar kolvarna vid bottenläget, redo att aspirera mer lösningar med samma sprutorna.
</li>
		<li>Ta bort sprutor genom att vrida dem moturs.</li>
		<li>Kassera sprutor och dalar i lämpliga bin (eller skölj dem med avjoniserat vatten och sedan 20% v/v etanol lösning för återanvändning).</li>
		<li>Försegla plattan och placera den på mikroplattan mixern för 3 min vid 1000 rpm eller 10 min när högviskösa lösningar blandas. Plattan är redo för att ställa in kristallisering vattendroppar på nliter dispensern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tillsatsen screening protokoll 1 (Konfigurera kristallisering droppar i en 96 brunnar kristallisering tallrik förfylld med additiv skärmen)
	<ol>
<li>Först förbereda villkoret med inledande koncentrationer av reagenser ökade med 10% (min. vol. 15 mL när du överför villkora från en behållare på additiv skärmen med flytande handler).</li>
		<li>Se till att flytande hundföraren är driftklar. Öppna programmet 'Lägg till skärm till tillsatser' för en enda skylt (ange volym i reservoarer: '72 µL'). Meddelanden, siffror och en tip-management system (12 x 1000 µL tips krävs) hjälp med att se roboten är redo att fungera enligt val.
</li>
		<li>Hämta additiv skärmen från-20 ° C inkubatorn och bort dess aluminium förseglar omedelbart (Använd hållaren plattan), sedan placera plattan på däcket på den flytande hanteraren. Programmet fungerar enligt en stående layout (skylten är placerad med A1-hörnet ligger i den främre vänstern delen av transportören). Också placera också behållaren fylld med villkoret. Kör programmet.</li>
		<li>När behållarna i plattan har fyllts, placera den på mikroplattan shaker och köra programmet. Skölj behållaren på skick med avjoniserat vatten och 20% etanol för återanvändning.</li>
		<li>
Ställa in droppar på nliter dispensern. Först unseal kristallisering plattan (Använd hållaren plattan). Och placera sedan plattan och proteinet 8-väl remsa i första positionen i remshållaren blocket. Fliken 'Setup' på kontrollerande programvara visar den faktiska placeringen av varje komponent på däck. Fyll varje brunn av remsan med protein prov enligt den droppe storlek som krävs (tabell 4). Kör programmet att förbereda droppar.
</li>
		<li>Vid slutförandet av programmet, avlägsna plattan från däck och försegla den omedelbart (använda plattan sealer, 3-tums bred tejp). Kassera remsan i den lämpliga bin.</li>
		<li>Bedöma storleken, form och centrering av droppar under mikroskopet före lagring.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tillsatsen screening protokoll 2 (Konfigurera kristallisering droppar i en 96 brunnar kristallisering tallrik med en re-usable additiv skärm)
	<ol>
<li>Först förbereda additiv skärmen: lämna motsvarande frysta 96 brunnar cell kultur plattan Tina i rumstemperatur i 40 min. Sedan Centrifugera additiv skärmen vid 1 000 x g i 2 min.</li>
		<li>Förbereda villkoret (min. vol. 15 mL när du överför villkora från en behållare på additiv skärmen med flytande handler).</li>
		<li>Fyll behållarna 96 brunnar kristallisering platta med villkoret. På vätska-hanteraren, fortsätt på samma sätt som protokoll 1, steg 2.2.2, men ange '80 µL' för volymen i reservoarer.</li>
		<li>Ställa in droppar på nliter dispensern med 3 komponenter på däck (plattan som innehåller tillsatsen skärmen, tillsammans med kristallisering plattan och 8-väl protein remsan i första positionen i remshållaren blocket, tabell 4).</li>
		<li>Försegla cell kultur plattan som innehåller skärmen med en aluminiumplåt och placera den tillbaka i-20 ° C inkubatorn.</li>
		<li>Bedöma storleken, form och centrering av droppar under mikroskopet före lagring.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Vi intygar härmed ett motstridiga kommersiella intresse eftersom LifeArc kommersialiserar följande: 96 - och 48-brunnen MRC plattor, MRC hängande droppe tätningen, MORPHEUS, Pi, ÅNGSTRÖM och LMB kristallisering skärmarna.

1 - förberedelse och användning av inledande skärmar lagras i plattor
Screening kit ska blandas före som distribueras i plattor eftersom ljus nederbörd eller fas separation uppstår i vissa rör under lagring. När en skärm består av två Kit (2 x 48 rör), placeras det första röret av andra satsen i läge E1 av kyla transportören. När en skärm består av 4 Kit (4 x 24 rör), det första röret av andra satsen placeras i läge C1, det första röret av tredje satsen placeras i läge E1 och det första röret av fjärde satsen placeras i läge G1. Medan du för in rören i deras kyla bäraren, placeras lock på en bricka efter standard 96 brunnar liggande layout. Eftersom väl nummer anges ovanpå locken av tillverkarna, möjliggör detta dubbelkontroller om alla rör har placerats i rätt ordning. Detta bidrar också till att ersätta rätta locken på rören när du fyller ett minskat antal plattor.
Vi lagrar förfylld plattorna vid 10 ° C, en kompromiss för att undvika frysning och lagring vid 4 ° C som kan orsaka försämring av villkor och problem med tätning. Plattorna är lagrade för upp till flera månader med normalt ingen märkbar kondens på insidan av tätningen. Detta är mindre sant för LMB05, LMB06, LMB09 och LMB10 plåtar eftersom dessa villkor med relativt höga koncentrationer av flyktiga reagenser (tabell 1). Liten mängd kondens på insidan av tätningen minskar tätning effektivitet och kan orsaka korskontamination mellan brunnarna samtidigt öppna plattorna. För att hjälpa till med att förhindra kondens under inledande nedkylning, överföras plåtar först från karusellen i en isolerad picknick svalare som lagras i ett kallt rum 4 ° C över natten. Mycket långsam kylning minimerar utvecklingen av temperaturskillnader inom de slutna brunnarna och därmed minskar kondens övergripande15. Dessutom när plattorna lagras i 10 ° C inkubator, placeras en egen anpassad SBS polystyren locket på plattan längst upp i varje stack (visas inte).
Våra förfylld tallrikar hela uppsättningen kan användas som en stor inledande skärm mot en roman, vattenlösliga, protein provet. Alternativt kan färre plattor väljas för att matcha särskilda krav. Till exempel LMB15 och LMB19 är skärmar som särskilt utformats för membran protein prover26,27, eller LMB20 är en skärm som formulerat med tung-atomer att underlätta experimentella utfasningen av diffraktion data28 (se även : <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formulering MORPHEUS protein kristallisering skärmar</a>).
2. ställa in kristallisering droppar
När du använder systemet 2, bör screening kit med betydande mängder flyktiga reagenser behandlas först. Detta undviker kondens bildas på gummit av SBS locken, som skulle kunna påverka locket hantering och plattan tätning. En SBS locket har lite av clearance när högst upp på en tallrik, vilket är varför de behöver anpassas initialt (se protokoll, steg 1.2.6). De protein döda volymerna i brunnarna av PCR-plattan är relativt generösa (0.8 µL, se legenden om tabell 2). Observera att lika generösa döda volymer är anställda när du använder nliter dispensern individuellt med protein i 8-väl remsor (tabell 4). Mindre döda volymer kan fungera, men vissa prover följa tipsen, kalibrering av en robot kan bli något missvisande, rummet kan vara varmare än vanligt, etc. Alla leda till provet förluster omfattas av de generösa döda volymerna för att konsolidera metoden.
Senaste utvecklingen aktiverat ytterligare miniatyrisering av experiment och därmed provmängden krävs för screening kristallisering villkor kan minskas betydligt genom att integrera de motsvarande teknik29,30 . Vissa aspekter av ytterligare miniatyrisering måste emellertid noggrant övervägande, såsom avdunstning av droppar31 och manipulering av mikrokristaller32.
Centrifugering av plattan (2 000 rpm, 1 min) kunde slutligen integreras som en rutinmässig sista steg när du konfigurerar kristallisering droppar (i sfäriska övre-brunnar). En mer enhetlig storlek och form av droppar som följd av centrifugering kan minska reproducerbarhet frågor33,34. Visst, centrerad droppar lättar senare bedömning av experiment med Mikroskop som krävs brännvidden blir liknande över hela plattan.
3. fördelarna med metoden 4-hörn
Den viktigaste fördelen med metoden 4-hörn är dess enkelhet, vilket minimerar fel och underlättar enkel automatiserad protokoll. Exempelvis kommer de 4 hörn lösningarna alltid placeras på däck på en flytande hanterare följer samma layout. Dessutom är alla program baserade på fasta utväxlingar mellan lösningarna (figur 3 c). Manuell beredning av 4 hörn lösningar föredras automatiserad hantering av lösningar vid höga koncentrationer som kan vara mycket trögflytande. Relativt snabb och noggrann aspiration/utlämning går då på de flesta typer av flytande hanterare med minimikrav för optimering av flytande klasser. Hörnet lösningar kan dock fortfarande för trögflytande för en robot med en vätska-system att fungera effektivt. Det är därför vi valt en flytande hanterare med positiv förskjutning (figur 3B).
Förutom de 2 linjära Övertoningarna koncentrationer, kan en tredje komponent (dvs, en uppsättning buffertar/tillsatser) provas vid en konstant koncentration på ett bekvämt sätt. För detta är en relativt stor volym av en grundläggande uppsättning hörnet lösningar på en passande högre koncentration, exklusive komponenten att varieras, beredd först. Sedan läggs lager lösningar inklusive denna komponent för att justera de slutliga koncentrationerna. Exempelvis är 50 mL av en uppsättning 4 hörn lösningar beredda på 10% högre koncentrationer än från början. Detta core set är sedan uppdelad i 5 mindre underdatauppsättningar 4. Slutligen läggs 10% av olika buffert-pH-lösningar till varje delmängd.
4. format och typer av additiv skärmar
Skärmarna är normalt lagras vid-20 ° C (figur 4) eftersom de inte används regelbundet och innehåller flyktiga/instabila föreningar. Användning av en fryst additiv skärm som lagras i ett djupt väl (1 mL i brunnar) måste planeras tidigt eftersom det tar 12-24 hr för alla additiv lösningar till Tina helt i rumstemperatur. Dessutom en mängd användare dela samma additiv skärm, vilket kan orsaka problem med förorening. Slutligen, höjden av djupt väl block gör dem olämpliga för de flesta nliter automater. Som en praktisk lösning att kringgå dessa frågor, ska skärmen överföras från djupt väl blocket till låg profil plattor (figur 4).
Additiv skärmar som omfattar ett brett utbud av enda reagens (med enstaka koncentrationer) har historiskt sett varit mycket populära35,36. Dock har andra typer av additiv skärmar utvecklats som integrerar blandningar av tillsatser37 eller ett minskat antal enda tillsatser finns i olika koncentrationer38. Slutligen, en kompletterande strategi är att undersöka effekten av tillsatser på proverna före kristallisering39,40.
5. ytterligare överväganden
God praxis: De flesta skärmar innehåller skadliga eller ens giftiga ämnen och därmed adekvat personskydd ska vara anställd under protokoll. Lika, rörliga delar av robotar kan leda till skador, särskilt när du försöker manuellt störa medan ett program körs (även om de flesta robotarna har nödstopp-knappen/system). På grund av de tekniska komplexitet inblandade, regelbunden kontroll av robotar, skärmar och program med tidigare kännetecknas prover är viktiga för ihållande hög reproducerbarhet.
Genomströmning: Som en fingervisning mellan 4000 till 8.000 LMB produceras plattor årligen med system 1 (och därefter anställd av användare för inledande screening). Det är inte anpassade till lager en stor mängd förfylld plattorna vid 10 ° C när den beräknade omsättningen är mycket lägre, som efter 4-5 månader, vissa villkor börjar försämras och avdunsta. Olika förhållningssätt till automation protokoll har genomförts för små - till medelstora laboratorier41.
Lagra och bedöma experiment: Efter beredning droppar, lagras pläterar på låg-vibration hyllor i ett rum på 4 eller 18 ° C med hårt kontrollerad temperatur (+/-0,5 ° C maximal avvikelse). Experiment är bedömd med kallt ljus källa Mikroskop. Olika automatiserade bildsystem är kommersiellt tillgängliga, men man bör noga överväga alla aspekter: den hastighet som krävs för att skanna en tallrik blir tillräckligt hög genomströmning? Kommer föremål än kristaller störa autofokus? Blir den resulterande kvaliteten på bilder tillräckligt att upptäcka mycket små kristaller (särskilt runt kanten av droppar)? 42 , 43 , 44
Jämförelse av kristallisering villkor: Efter noggranna utredningar om naturen från början-erhållande kristaller, kan man analysera trender och likheter över förhållanden med hjälp av <a href="http://fms-3.lmb.internal/screens2/search.html">LMB skärmen databas</a> eller C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Webbverktyg</a>45.

Röntgenkristallografi är omfattande tillämpas att vidareutveckla vår förståelse av mekanismerna för biologiska och sjukdom på atomär nivå och därefter hjälpa rationellt förhållningssätt till drug discovery1. För detta, renat och koncentrerad (2-50 mg/mL) makromolekylära prover av protein, DNA, RNA, andra ligander och deras komplex är trialed för deras benägenhet att bilda beställde tredimensionellt galler genom kristallisering2,3 ,4. När hög kvalitet kristaller erhålls som gravering röntgen, kan kristallstrukturen lösas på nära atomär upplösning5,6. Är avgörande förutsättningar för att kristallisera roman prov kan inte förutsägas och utbytet av hög kvalitet kristaller är oftast mycket låg. En underliggande orsak är att många prover av intresse har utmanande biokemiska egenskaper, som gör dem instabila på motsvarande tidsskalan för kristallisering (vanligtvis några dagar). Slutligen, processen förvärras av den tid som krävs för att producera prov och prov varianter, och för att optimera deras rening och kristallisering7,8.
En kristallisering skick är en lösning med en fällningsmedel som minskar provets löslighet och villkor innehåller ofta även buffertar och tillsatser. Hundratals sådana reagenser är väl lämpade för att ändra parametrarna för kristallisering experimenten eftersom de har låg benägenhet att störa prov integritet (t.ex. protein eller nukleinsyra utspelar sig). Även testning miljontals kombinationer av kristallisering reagenser inte är genomförbart, är testa flera till många screening kit - formulerad med olika strategier9,10 - möjligt med miniaturized prövningar och automatiserade protokoll. I detta perspektiv är mest mottaglig tekniken förmodligen ånga diffusion med 100-200 nL droppar sitter på en liten väl över en reservoar som innehåller villkoret kristallisering (25-250 µL), genomförs i specialiserade kristallisering plattor11 , 12. protein provet och skick kombineras ofta i förhållandet 1:1 för en total volym på 200 nL när du ställer in droppar i övre-brunnarna. Robotic nliter protein kristallisation kan genomföras med alternativa tekniker och tallrikar som under olja batch13 och Lipidic Cubic fas14 (senast en tillämpas specifikt till trans-membranproteiner som är Mycket dåligt lösligt i vatten).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">Kristallisering anläggningen i MRC-LMB</a> startades i början av 2000 talet och en tidig Sammanfattning av vår automatiserade protokoll presenterades 200515. En historisk introduktion till protein kristallisering presenterades och också en översikt av fördelarna med robotic nliter närma sig (då en ny metod för rutinmässig experiment). Sedan makromolekylära kristallisering är i huvudsak en stokastisk process med mycket liten eller ingen användbar förhandsinformation, anställa en bred mängd (lämplig) initialt villkorar öka avkastningen av kvalitet diffraktion kristaller16. Förutom, en ofta förbisedd fördel av en stor inledande skärm är att avsevärt minska behovet för optimering av prover och kristaller i många fall. Naturligtvis kan man fortfarande behöver fortsätta med optimering av vissa ursprungliga villkoren senare. Vanligtvis undersöks systematiskt då koncentrationen av reagenser och pH. Mer reagenser kan också införas i den optimerade villkoren att ytterligare ändra parametrarna för kristallisering. Visst, en bör försök kristallisering med ett urval nylagade, därav de motsvarande protokoll måste vara enkel och tillgänglig som helst.
Här två helautomatiska system som utformats på MRC-LMB (system 1 och 2) och de motsvarande protokoll beskrivs fullt. Den huvudsakliga tillämpningen av dessa två system är initial screening av vapor diffusion i sitter droppe kristallisering plattor. System 1 integrerar en flytande hanterare, en automatiserad karusell till lager plattor, en bläckstråleskrivare för plattan märkning och en vidhäftande plattan sealer. På systemet 1, 72 96 brunnar fylls med kommersiellt tillgängliga screening Kit (80 µL av villkorar överfört till reservoaren från en start volym av 10 mL provrör), märkt och förseglade. Pläterar lagras sedan i en 10 ° C inkubator där de är tillgängliga för användare när som helst (som inledande skärmar kallas 'LMB plåtar').
System 2 integrerar en flytande hanterare, en nliter dispenser och en vidhäftande plattan sealer. På systemet 2, sitter droppar (100-1000 nL) för ånga diffusion experiment produceras genom att kombinera villkor och provet i övre-brunnarna av 20 48 eller 96-brunnar förfylld med villkor. Detta innebär 1.920 inledande screening villkor trialed när du använder 20 LMB plattor på systemet 2.
Robotar används också individuellt för optimering av valda villkor och motsvarande halvautomatisk protokollen beskrivs också. Den 4-hörn metod17 används rutinmässigt att producera optimering skärmar. Motsvarande protokollet först kräver manuell beredning av 4 lösningar ('A, B, C, och D'). Två linjära övertoningar koncentrationer (för två huvudsakliga kristallisering agenter) genereras sedan automatiskt direkt i reservoarerna kristallisering platta. För detta doserar en spruta-baserade flytande hanterare 4 hörn lösningar på olika nyckeltal.
För att ytterligare optimera ett tillstånd, kan man använda tillsatsen skärmar som potentiellt ökar egenskaper resulterande kristaller18. Det finns två metoder för additiv screening: ett protokoll som börjar med tillsatser dispenseras i behållarna i kristallisering tallrikar innan du ställer in droppar (protokoll 1) och ett annat protokoll där skärmen additiv dispenserats direkt på droppar (protokoll 2).
Annan användbar utveckling som inleddes vid MRC-LMB att underlätta automatiserade makromolekylära kristallisering, presenteras också. I huvudsak minimerar kristallisering tallrikar och tillhörande enheter såsom en stapelbar samhället av Biomolecular Screening (SBS) lock som avdunstning av villkor vid användning av systemet 2.
För korthetens förutsätts det att användare är bekanta med grundläggande funktioner och skötsel av nliter fördelaren, bläckstråleskrivare och vidhäftande plattan sealer. Om inte annat anges, plattor på däck på robotarna är placerade så att väl A1 ('A1-hörnet') är mot baksidan vänstra hörnet av en tallrik-bärare.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Robots</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Freedom EVO&#174;</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microlab&#174; STAR&#8482;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE&#8482; technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mosquito&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dragonfly&#174;</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive plate sealer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Inkjet printer 9232</td>
			<td>Markem-Imaje</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Integrated to System 1. Touchscreen interface.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystallization screens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-110</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen 2&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-112</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009530</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Classic 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009531</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Ammonium Sulfate</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-211</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG/LiCl</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-217</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Quick Screen&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-221</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; Sodium Chloride</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-219</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; PEG 6000</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-213</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Grid Screen&#8482; MPD</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-215</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemFac&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-114</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PEG/Ion&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-126</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Natrix&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-116</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Crystal Screen Lite&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Custom Lite screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >n/a</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 1</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009536</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Wizard&#8482; Cryo 2</td>
			<td >Rigaku</td>
			<td >1009537</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS1</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-101L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS2</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-102L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS3</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-103L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS4</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-104L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS5</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-105L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS6</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-106L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS7</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-107L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS8</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-108L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS9</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-109L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JBS10</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-110L</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 1 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 4.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 5.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 6.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 7.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Clear Strategy&#8482; Screen 2 pH 8.5</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-16LMB</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Index&#8482;</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-144</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 1</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-107</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >SaltRX&#8482; 2</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-109</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemStar&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-21</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MemSys&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-25</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >JCSG-plus&#8482; Suite</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >130720</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-46</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi minimal screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-127</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pi-PEG screen</td>
			<td >JenaBioScience</td>
			<td >CS-128</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; II screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-91</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LMB crystallization screen&#8482;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-98</td>
			<td>Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Additive screens</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HT additive screen</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR2-138</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td >MD1-93-500</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (500 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100</td>
			<td >Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MORPHEUS&#174; additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-93</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped wells (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ANGSTROM additive screen&#8482;&#160;</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-100-FX</td>
			<td >Frozen in 96-well cell culture Costar&#174; plate with V-shaped well (100 &#181;L per well).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >HIPPOCRATES additive screen</td>
			<td >Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>n/a</td>
			<td >48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS&#174; III).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Other consumables</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96-well MRC 2-drop plate</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MRC 96T-UVP</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >48-well MRC 1-drop plate&#160; (&#39;MAXI plate&#39;)</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >MMX01-UVP&#160;</td>
			<td >Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200&#160; &#181;L. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 &#181;L. UV transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >MRC hanging drop seal</td>
			<td >Swissci</td>
			<td >n/a</td>
			<td >Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive sealing tape</td>
			<td >Hampton Research</td>
			<td >HR4-50</td>
			<td >3-inch wide Duck&#174; HD Clear&#8482; for sealer and manual sealing.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adhesive aluminium sheet</td>
			<td >Beckman Coulter</td>
			<td >538619</td>
			<td >Used to reseal additive screens.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ink cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>9651</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Solvent cartridge</td>
			<td >Markem-Imaje</td>
			<td>8652</td>
			<td >System 1 (inkjet printer).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 &#181;L tips&#160;</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>235947</td>
			<td >System 2 (STAR&#8482; liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE&#8482; tips in disposable stacks.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Reagent container</td>
			<td >Hamilton</td>
			<td>194052</td>
			<td >Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols.&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR plate</td>
			<td >Thermo Scientific&#8482;</td>
			<td >AB-2150</td>
			<td >System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito&#174;). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >microsyringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03020</td>
			<td >Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito&#174; nanoliter dispenser (9mm spacing).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >strip-holder block</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >3019-05013</td>
			<td >SSB device for the Mosquito&#174; strips, aka &#39;4-way Reagent Holder&#39;.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >2 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03110</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 &#181;L 8-well strip</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-03100</td>
			<td >Contains protein on the deck of the Mosquito&#174;. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >5 mL syringes</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07100</td>
			<td >Syringe body and piston for the Dragonfly&#174; liquid handler. Pack of 100.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Troughs/Reservoirs</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td >4150-07103</td>
			<td >Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly&#174;. Pack of 50.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Orbital microplate shaker</td>
			<td>CamLab Limited</td>
			<td>n/a</td>
			<td >Variomag&#174; for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Microplate mixer</td>
			<td >TTP Labtech</td>
			<td>3121-01015</td>
			<td>MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated protocols for macromolecular crystallization at the mrc laboratory of molecular biology

När hög kvalitet kristaller erhålls som gravering röntgen, kan kristallstrukturen lösas på nära atomär upplösning. Villkoren för att kristallisera proteiner, DNAs, RNAs och deras komplex kan dock inte vara förutspådde. Anställa en bred mängd villkor är ett sätt att öka avkastningen av kvalitet diffraktion kristaller. Två helt automatiserade system har utvecklats på den MRC laboratorium för molekylärbiologi (Cambridge, England, MRC-LMB) som underlättar kristalliseringen screening mot 1.920 initialt villkorar av vapor diffusion i nliter droppar. Halvautomatisk protokoll har också utvecklats för att optimera villkor genom att ändra koncentrationerna av reagenser, pH, eller genom att införa tillsatser som potentiellt ökar egenskaper av de resulterande kristallerna. Alla motsvarande protokoll kommer att beskrivas i detalj och diskuterade kort. Sammantaget möjliggör de bekväm och mycket effektiv makromolekylära kristallisering i en fleranvändar-anläggning, samtidigt som den ger användarna kontroll över viktiga parametrar av sina experiment.

Watch this Scientific Journal Video about Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology at JoVE.com

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Automatiserade system och protokoll för rutinmässig beredning av ett stort antal skärmar och nliter kristallisering droppar för ånga diffusion experiment beskrivs och diskuteras.

Automatiserad protokoll för makromolekylära kristallisering på MRC laboratoriet för molekylär biologi

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Växande proteinkristaller med olika dimensioner med automatiserad kristallisering tillsammans med In Situ det dynamiska ljusspridning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

Singel-steg rening av makromolekylära komplex använder RNA som bifogas Biotin och en foto-cleavable länkare

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Karakterisering på molekylär nivå med hjälp av robusta biokemiska metoder för ett nytt Kinas protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Strategic Screening and Characterization of the Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex for Successful Crystallization

Strategisk screening och karakterisering av Visual GPCR-mini-G Protein Signaling Complex för framgångsrik kristallisering

The key to determining crystal structures of membrane protein complexes is the quality of the sample prior to crystallization. In particular, the choice ...

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Spotvariation Fluorescenskorrelationsspektroskopi för analys av molekylär diffusion vid plasmamembranet i levande celler

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

PCR Mutagenesis, Cloning, Expression, Fast Protein Purification Protocols and Crystallization of the Wild Type and Mutant Forms of Tryptophan Synthase

PCR Mutagenesis, Kloning, Uttryck, Snabba protein rening protokoll och kristallisering av den vilda typen och mutanta former av tryptofan syntas

Structural studies with tryptophan synthase (TS) bienzyme complex (&#945;2&#946;2 TS) from Salmonella typhimurium have been performed to better understand ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Seriell datainsamling med fast mål vid Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Arbetsflöde och verktyg för kristallografisk fragmentscreening på Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...