Name: microcrystallography of protein crystals and in cellulo diffraction
Uploaded: 2017-07-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يعترفوا بتشان - ساين لاي لتقديم صور من البلورات الصغيرة المنقى ودانيال إريكسون وتوم كارادوك - ديفيز لدعمهم في خط الحزم MX2 للسنكروترون الاسترالي وكاثرين فلاناغان وأندرو فريجا من منشأة فلوكور في جامعة موناش مساعدة لا تقدر بثمن.

ملاحظة: في التبلور الجسم الحي وقد ذكرت في العديد من الكائنات الحية بما في ذلك البكتيريا والخميرة والنباتات والحشرات والثدييات (استعرض في المرجع 21 ). كما تم تحقيق تبلور البروتينات المؤتلف في المختبر باستخدام ترنسفكأيشن عابرة من خلايا الثدييات و...

<ol>
	<li>Tari, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+structural+biology+in+drug+discovery.">The utility of structural biology in drug discovery.</a> Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation.">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), (2014).</li><li>Redecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natively+inhibited+Trypanosoma+brucei+cathepsin+B+structure+determined+by+using+an+X-ray+laser.">Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser.</a> Science. 339 (2013), 227-230 (2013).</li><li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, e01345 (2013).</li><li>Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+microcrystallography.">Macromolecular microcrystallography.</a> Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).</li><li>Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-crystallography+comes+of+age.">Micro-crystallography comes of age.</a> Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).</li><li>Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reflections+on+the+Many+Facets+of+Protein+Microcrystallography.">Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography.</a> Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).</li><li>Nelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+cross-beta+spine+of+amyloid-like+fibrils.">Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils.</a> Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).</li><li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+organization+of+cypovirus+polyhedra.">The molecular organization of cypovirus polyhedra.</a> Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).</li><li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+atomic+structure+of+baculovirus+polyhedra+reveals+the+independent+emergence+of+infectious+crystals+in+DNA+and+RNA+viruses.">The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).</li><li>Johansson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+photosynthetic+reaction+centre+determined+by+serial+femtosecond+crystallography.">Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li><li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography.">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micro-patterned+silicon+chip+as+sample+holder+for+macromolecular+crystallography+experiments+with+minimal+background+scattering.">A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering.</a> Sci Rep. 5, 10451 (2015).</li><li>Koopmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+crystallization+opens+new+routes+in+structural+biology.">In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).</li><li>Gallat, F. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+crystallography+at+X-ray+free-electron+lasers:+the+next+generation+of+structural+biology.">In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology.</a> Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).</li><li>Duszenko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+crystallization+in+combination+with+highly+brilliant+radiation+sources+offers+novel+opportunities+for+the+structural+analysis+of+post-translationally+modified+eukaryotic+proteins.">In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins.</a> Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).</li><li>Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+cellulo+structure+determination+of+a+novel+cypovirus+polyhedrin.">In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin.</a> Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).</li><li>Sawaya, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystal+structure+obtained+at+2.9+&#197;+resolution+from+injecting+bacterial+cells+into+an+X-ray+free-electron+laser+beam.">Protein crystal structure obtained at 2.9 &#197; resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Diffraction-Quality+Protein+Crystal+Processed+as+an+Autophagic+Cargo.">A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo.</a> Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).</li><li>Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pipeline+for+structure+determination+of+in+vivo-grown+crystals+using+in+cellulo+diffraction.">A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction.</a> Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).</li><li>Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystallization+in+vivo.">Protein crystallization in vivo.</a> Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).</li><li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Bombyx+mori+cytoplasmic+polyhedrosis+virus+polyhedrin+in+insect+cells+by+using+a+baculovirus+expression+vector,+and+its+assembly+into+polyhedra.">Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra.</a> J Gen Virol. 74, 99-102 (1993).</li><li>Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+Purification+of+Virus-like+Particles+for+Vaccination.">Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+Production+and+Purification+of+Recombinant+Murine+Kindlin-3+from+Insect+Cells+for+Biophysical+Studies.">Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li><li>Berger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MultiBac+Protein+Complex+Production+Platform+at+the+EMBL.">The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li><li>Margine, I., Palese, P., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Functional+Recombinant+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Proteins+from+the+Novel+H7N9+Influenza+Virus+Using+the+Baculovirus+Expression+System.">Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System.</a> J Vis Exp. (81), (2013).</li><li>Khurana, A., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+For+Production+of+Recombinant+mCD1d+Protein+in+Insect+Cells.">A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.</a> J Vis Exp. (10), (2007).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells.">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Baskaran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+cellulo-derived+structure+of+PAK4+in+complex+with+its+inhibitor+Inka1.">An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1.</a> Nat Comm. 6, 1-11 (2015).</li><li>Armour, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+Parallel+Processing+Approach+for+Gene-to-structure+Determination+of+the+Influenza+Polymerase+PB2+Subunit.">Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode.">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).</li><li>Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iMOSFLM:+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM.">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Cryst D. 67, 271-281 (2011).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Cryst D. 66, 125-132 (2010).</li><li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+treatment+of+negative+intensity+observations.">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Cryst D. 67, 235-242 (2011).</li><li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography.">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li><li>Rey, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virology:+holed+up+in+a+natural+crystal.">Virology: holed up in a natural crystal.</a> Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).</li><li>Sch&#246;nherr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+investigation+of+dynamic+protein+crystallization+in+living+cells.">Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells.</a> Struct Dyn. 2 (4), 041712 (2015).</li><li>Hasegawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+crystallization+of+human+IgG+in+the+endoplasmic+reticulum+of+engineered+Chinese+hamster+ovary+(CHO)+cells.">In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells.</a> J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).</li><li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography.">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> J Vis Exp. (115), e54463 (2016).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeshAndCollect:+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines.">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).</li><li>Fan, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcineurin+crystals+formed+using+the+baculovirus+expression+system.">In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system.</a> Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).</li><li>Nass, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , (2013).</li></ol>

ويوفر هذا البروتوكول نهجين لتحليل البلورات الصغيرة بهدف تسهيل تحليل بلورات صغيرة جدا التي كان يمكن التغاضي عنها في الماضي. خطوات حاسمة لتنقية ميكروكريستال وقد تم تحسين البروتوكول المقدم باستخدام بومبيكس موري ...

وقد شهد استخدام بلورات الأشعة السينية لتحديد هياكل عالية الدقة من الجزيئات البيولوجية تقدما مطردا على مدى العقدين الماضيين. إن الإقبال المتزايد على التصوير البلوري بالأشعة السينية من قبل الباحثين غير الخبراء يمثل نموذجا ديموقراطيا لهذا النهج في العديد من مجالات علوم الحياة 1 . تاريخيا، بلورات مع أبعاد أدناه ~ 10 ميكرون وقد اعتبرت صعبة، إن لم يكن غير صالحة للاستعمال، لتحديد هيكل. وقد أدى ازدياد توافر مصادر الإشعاع السنكروتروني المكروية المتناهية الصغر في جميع أنحاء العالم، والتقدم التكنولوجي، مثل تطوير الأدوات لمعالجة الجراثيم الصغيرة، إلى إزالة الكثير من هذه الحواجز التي أعاقت الاستخدام الواسع النطاق للجرافيك البلوري بالأشعة السينية. التقدم في المسلسل الأشعة السينية ميكروفولستالوريوغرافي 2 ، 3 والحيود الإلكترون الجزئي 4 هكتارتبين أن استخدام البلورات الصغرى والبلورات النانوية لتحديد الهيكل ليس ممكنا فحسب بل أيضا يفضل أحيانا استخدام بلورات كبيرة 5 و 6 و 7 . وقد تم تطبيق هذه التطورات لأول مرة لدراسة الببتيدات 8 والبلورات الطبيعية التي تنتجها فيروسات الحشرات 9 ، 10 . وهي تستخدم الآن لمجموعة متنوعة من الجزيئات البيولوجية بما في ذلك النظم الأكثر صعوبة مثل البروتينات الغشاء والمجمعات الكبيرة 11 . لتسهيل تحليل هذه البلورات الصغيرة، وقد تم تحليلها في ميسو ، وخاصة البروتينات الغشاء 12 وفي رقائق ميكروفلويديكش 13 . توافر هذه المنهجيات الجريزوفولفوغرافيا الجديدة أثارت إمكانية استخدام فيفيفو تبلور كطريق جديد لبيولوجيا الهيكلية 14 ، 15 ، 16 تقدم بديلا عن البلورية الكلاسيكية في المختبر البلورية. لسوء الحظ، حتى عندما تكون في بلورات الجسم الحي يمكن أن تنتج، لا تزال هناك العديد من العقبات مثل تدهور أو فقدان بروابط خلال التنقية من الخلايا، وصعوبة في التلاعب والتصور من بلورات في خط شعاعي السنكروترون والتجارب حيود الأشعة السينية مملة. كما تم تحليل بلورات بديلة مباشرة داخل الخلية دون أي خطوة تنقية 17 ، 18 ، 19 . ويشير تحليل مقارن إلى أن مثل هذه المقاربات في السليلو قد تكون أكثر كفاءة من تحليل البلورات المنقاة وبيانات الغلة ذات الدقة العالية 20 . هذا البروتوكول فيتميل إلى مساعدة الباحثين الجدد على الجريزوفولفوغرافيا البروتين. ويوفر المنهجيات التي تركز على إعداد العينات والتلاعب للتجارب حيود الأشعة السينية في شعاع السنكروترون. ويقترح خياران باستخدام بلورات معزولة عن الجريزوفولفوغرافيا الكلاسيكية أو الخلايا المحتوية على الكريستال مرتبة حسب التدفق الخلوي لفي تحليل السليلو ( الشكل 1 ).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="629">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sf9 cells</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SF900-SFM insect medium</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1L cell culture flask</td>
			<td style="width:127px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Shaking incubator for insect cell culture</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50mL conical tubes</td>
			<td style="width:127px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sonicator equiped with a 19mm probe</td>
			<td>MSE Soniprep 150&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass slides</td>
			<td style="width:127px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:127px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD Influx cell sorter&#160;</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hampton Heavy atom screens</td>
			<td style="width:127px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Micromesh</td>
			<td style="width:127px;">Mitigen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Paper wick</td>
			<td style="width:127px;">Mitigen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">MX2 microfocus beamline</td>
			<td style="width:127px;">Australian Synchrotron</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein 
			Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793&#8211;1806, 
			doi:10.1071/CH14455.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystallography of protein crystals and in cellulo diffraction

وقد أتاح ظهور خطوط ميكروفوكوس عالية الجودة في العديد من مرافق السنكروترون التحليل الروتيني للبلورات أصغر من 10 ميكرون في أكبر بعد لها، والتي كانت تمثل تحديا. نقدم اثنين من سير العمل البديلة لتحديد هيكل البروتينات الكريستالات بواسطة البلورات بالأشعة السينية مع التركيز بشكل خاص على بلورات نمت في الجسم الحي . يتم استخراج الجريزوفولفات إما من الخلايا عن طريق سونيكاتيون وتنقيته بواسطة الطرد المركزي التفاضلي، أو تحليلها في السليلو بعد فرز الخلايا عن طريق التدفق الخلوي للخلايا التي تحتوي على الكريستال. اختياريا، بلورات نقية أو الخلايا المحتوية على الكريستال غارقة في حلول ذرة ثقيلة للمرحلة التجريبية. ثم يتم إعداد هذه العينات لتجربة الانعراج بطريقة مماثلة من خلال تطبيق على دعم ميكروميش والتبريد فلاش في النيتروجين السائل. نحن تصف بإيجاز ومقارنة التجارب حيود المسلسل من البلورات الصغيرة معزولة والكريستال،التي تحتوي على خلايا باستخدام شعاع ميكروفوكوس سينكروترون لانتاج مجموعات البيانات مناسبة للمرحلة، وبناء نموذج والصقل. وتتمثل هذه سير العمل مع بلورات من بومبيكس موري سيبوفيروس 1 (BmCPV1) بوليهدرين تنتجها عدوى الخلايا الحشرية مع فيروس باكولوف المؤتلف. في هذه الدراسة الحالة، في تحليل السليلو هو أكثر كفاءة من تحليل البلورات المنقى وتنتج بنية في ~ 8 أيام من التعبير إلى صقل.

يتم عرض لمحة عامة عن كل من الطرق البديلة لتحديد هيكل باستخدام في ميكروفروستالس الجسم الحي ( الشكل 1 ). بوليهيدرا يمكن بسهولة تنقيته سونيكاتيون والطرد المركزي. نظرا لكثافتها، فإنها تشكل طبقة في الجزء السفلي من الأنبوب تحت طب?...

Watch this Scientific Journal Video about Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction at JoVE.com

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

يتم تقديم بروتوكول لعلم البلورات بالأشعة السينية باستخدام الجريزوفريستالز البروتين. يتم مقارنة مثالين تحليل في الجريزوفريستالز الجسم الحي -grown بعد تنقية أو في السليلو .

الجريزوفولفوغرافيا من بلورات البروتين و<em&gt; في سيليولو</em&gt; الانعراج

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

تنامي البلورات البروتينية مع أبعاد متميزة باستخدام الآلي تبلور مقرونا في الموقع الحيوي تشتت الضوء

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

قياس وتفسير معدلات استهلاك الأوكسجين كلياً يطير رئيس قطاعات

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

توصيف مستقلة تماما وجمع البيانات من بلورات جزيئات البيولوجية

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

تطبيق قياس التداخل الحيوي (BLI) لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين في النسخ

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

إنشاء أنظمه تحديد البروتين المستحثة كيميائيا للغاية بواسطة الاختيار المتدرج لمكتبه الأجسام المضادة أحاديه المجال التوافقية

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

اشتقاق بلورات البروتين مع I3C باستخدام عشوائي Microseed مصفوفة الفرز

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

تحسين نمو بلورات الإندوثيابسين لتجارب علم البلورات التسلسلي

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

حيود الإلكترون الجهورالوفولفي للجزيئات الصغيرة

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...