Name: microcrystallography of protein crystals and in cellulo diffraction
Uploaded: 2017-07-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction at JoVE.com

Die Autoren möchten Chan-Sien Lay für die Bereitstellung von Bildern von gereinigten Mikrokristallen, Daniel Eriksson und Tom Caradoc-Davies für die Unterstützung bei der MX2-Strahllinie des australischen Synchrotron und Kathryn Flanagan und Andrew Fryga aus der FlowCore-Anlage an der Monash University für ihre Unschätzbare Hilfe

Anmerkung: In vivo wurde die Kristallisation in vielen Organismen beschrieben, einschließlich in Bakterien, Hefen, Pflanzen, Insekten und Säugetieren (siehe Referenz 21 ). Die Kristallisation von rekombinanten Proteinen wurde auch im Labor unter Verwendung einer transienten Transfektion von Säugetierzellen und einer Baculovirusinfektion von Insektenzellen erreicht. Das folgende Protokoll wurde unter Verwendung des Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) -Polyhedrin-Gens, das in eine...

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	<li>Tari, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+structural+biology+in+drug+discovery.">The utility of structural biology in drug discovery.</a> Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation.">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), (2014).</li><li>Redecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natively+inhibited+Trypanosoma+brucei+cathepsin+B+structure+determined+by+using+an+X-ray+laser.">Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser.</a> Science. 339 (2013), 227-230 (2013).</li><li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+electron+crystallography+of+protein+microcrystals.">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2, e01345 (2013).</li><li>Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+microcrystallography.">Macromolecular microcrystallography.</a> Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).</li><li>Smith, J. L., Fischetti, R. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+a+photosynthetic+reaction+centre+determined+by+serial+femtosecond+crystallography.">Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li><li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography.">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li><li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micro-patterned+silicon+chip+as+sample+holder+for+macromolecular+crystallography+experiments+with+minimal+background+scattering.">A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering.</a> Sci Rep. 5, 10451 (2015).</li><li>Koopmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+crystallization+opens+new+routes+in+structural+biology.">In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).</li><li>Gallat, F. -. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+crystallography+at+X-ray+free-electron+lasers:+the+next+generation+of+structural+biology.">In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology.</a> Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497 (2014).</li><li>Duszenko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+protein+crystallization+in+combination+with+highly+brilliant+radiation+sources+offers+novel+opportunities+for+the+structural+analysis+of+post-translationally+modified+eukaryotic+proteins.">In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins.</a> Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).</li><li>Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+cellulo+structure+determination+of+a+novel+cypovirus+polyhedrin.">In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin.</a> Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).</li><li>Sawaya, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+crystal+structure+obtained+at+2.9+&#197;+resolution+from+injecting+bacterial+cells+into+an+X-ray+free-electron+laser+beam.">Protein crystal structure obtained at 2.9 &#197; resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).</li><li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Diffraction-Quality+Protein+Crystal+Processed+as+an+Autophagic+Cargo.">A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo.</a> Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).</li><li>Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pipeline+for+structure+determination+of+in+vivo-grown+crystals+using+in+cellulo+diffraction.">A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction.</a> Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).</li><li>Doye, J. 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(85), (2014).</li><li>Berger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MultiBac+Protein+Complex+Production+Platform+at+the+EMBL.">The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li><li>Margine, I., Palese, P., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Functional+Recombinant+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Proteins+from+the+Novel+H7N9+Influenza+Virus+Using+the+Baculovirus+Expression+System.">Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System.</a> J Vis Exp. (81), (2013).</li><li>Khurana, A., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+For+Production+of+Recombinant+mCD1d+Protein+in+Insect+Cells.">A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.</a> J Vis Exp. (10), (2007).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells.">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li><li>Baskaran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+cellulo-derived+structure+of+PAK4+in+complex+with+its+inhibitor+Inka1.">An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1.</a> Nat Comm. 6, 1-11 (2015).</li><li>Armour, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-target+Parallel+Processing+Approach+for+Gene-to-structure+Determination+of+the+Influenza+Polymerase+PB2+Subunit.">Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode.">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).</li><li>Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Cryst D. 67, 235-242 (2011).</li><li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography.">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li><li>Rey, F. 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(115), e54463 (2016).</li><li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MeshAndCollect:+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines.">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).</li><li>Fan, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcineurin+crystals+formed+using+the+baculovirus+expression+system.">In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system.</a> Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).</li><li>Nass, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , (2013).</li></ol>

Dieses Protokoll bietet zwei Ansätze zur Analyse von Mikrokristallen mit dem Ziel, die Analyse von sehr kleinen Kristallen zu erleichtern, die in der Vergangenheit übersehen worden wären. Kritische Schritte zur Mikrokristallreinigung Das dargestellte Protokoll wurde mit Bombyx mori CPV1 Polyhedrin optimiert, das in Sf9-Zellen als Modellsystem exprimiert wird. In vivo zeigen Mikrokristalle jedoch eine große Variabilität des mechanischen Widerstan...

Die Verwendung der Röntgenkristallographie zur Bestimmung hochauflösender Strukturen biologischer Makromoleküle hat in den letzten zwei Jahrzehnten einen stetigen Fortschritt erfahren. Die zunehmende Aufnahme der Röntgenkristallographie durch nicht-erfahrene Forscher veranschaulicht die Demokratisierung dieses Ansatzes in vielen Bereichen der Biowissenschaften 1 . Historisch gesehen wurden Kristalle mit Abmessungen unter ~ 10 μm als anspruchsvoll, wenn nicht unbrauchbar, für die Strukturbestimmung betrachtet. Die zunehmende Verfügbarkeit von dedizierten Mikrofokus-Strahllinien bei Synchrotronstrahlungsquellen weltweit und technologischen Fortschritten, wie die Entwicklung von Werkzeugen zur Manipulation von Mikrokristallen, hat viel von diesen Barrieren entfernt, die den breiten Einsatz der Röntgenmikrokristallographie vereiteln. Fortschritte in der seriellen Röntgenmikrokristallographie 2 , 3 und Mikroelektronenbeugung 4 haDass die Verwendung von Mikro- und Nanokristallen zur Strukturbestimmung nicht nur möglich ist, sondern auch manchmal der Verwendung von großen Kristallen 5 , 6 , 7 bevorzugt ist. Diese Fortschritte wurden zuerst auf die Untersuchung von Peptiden 8 und natürlichen Kristallen angewendet, die von Insektenviren 9 , 10 produziert wurden . Sie werden nun für ein breites Spektrum biologischer Makromoleküle eingesetzt, darunter die schwierigsten Systeme wie Membranproteine ​​und Großkomplexe 11 . Um die Analyse dieser Mikrokristalle zu erleichtern, wurden sie in Meso , insbesondere Membranproteinen 12 und in Mikrofluidik-Chips 13, analysiert. Die Verfügbarkeit dieser neuartigen Mikrokristallographie-Methoden hat die Möglichkeit der Verwendung inVivo-Kristallisation als neuer Weg für die Strukturbiologie 14 , 15 , 16, die eine Alternative zur klassischen in vitro- Kristallogenese bietet. Unglücklicherweise, auch wenn in vivo Kristalle produziert werden können, bleiben mehrere Hindernisse wie der Abbau oder Verlust von Liganden während der Reinigung aus Zellen, Schwierigkeiten bei der Manipulation und Visualisierung der Kristalle an der Synchrotron-Strahllinie und langwierigen Röntgenbeugungsexperimenten. Als Alternative wurden auch Kristalle direkt innerhalb der Zelle ohne Reinigungsschritt 17 , 18 , 19 analysiert. Eine vergleichende Analyse deutet darauf hin, dass solche in Cellulo- Ansätze effizienter sein können als die Analyse von gereinigten Kristallen und Ertragsdaten höherer Auflösung 20 . Dieses Protokoll ist inNeigten dazu, Forschern neu zu helfen, die Protein-Mikrokristallographie neu zu machen. Es bietet Methoden zur Fokussierung auf Probenvorbereitung und Manipulation für Röntgenbeugungsexperimente an einer Synchrotron-Strahllinie. Es werden zwei Möglichkeiten vorgeschlagen, isolierte Kristalle für klassische Mikrokristallographie oder kristallhaltige Zellen zu verwenden, die nach Durchflusszytometrie für die Celluloanalyse sortiert sind ( Abbildung 1 ).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="629">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sf9 cells</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SF900-SFM insect medium</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1L cell culture flask</td>
			<td style="width:127px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Shaking incubator for insect cell culture</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50mL conical tubes</td>
			<td style="width:127px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sonicator equiped with a 19mm probe</td>
			<td>MSE Soniprep 150&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass slides</td>
			<td style="width:127px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:127px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD Influx cell sorter&#160;</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hampton Heavy atom screens</td>
			<td style="width:127px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Micromesh</td>
			<td style="width:127px;">Mitigen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Paper wick</td>
			<td style="width:127px;">Mitigen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">MX2 microfocus beamline</td>
			<td style="width:127px;">Australian Synchrotron</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein 
			Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793&#8211;1806, 
			doi:10.1071/CH14455.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystallography of protein crystals and in cellulo diffraction

Das Aufkommen von hochwertigen Mikrofokus-Strahllinien bei vielen Synchrotronanlagen ermöglichte die Routineanalyse von Kristallen kleiner als 10 μm in ihrer größten Dimension, die eine Herausforderung darstellte. Wir stellen zwei alternative Arbeitsabläufe für die Strukturbestimmung von Proteinmikrokristallen durch Röntgenkristallographie mit besonderem Fokus auf in vivo gewachsene Kristalle dar. Die Mikrokristalle werden entweder durch Ultraschallbehandlung aus Zellen extrahiert und durch Differentialzentrifugation gereinigt oder in Cellulo nach Zellsortierung durch Durchflusszytometrie von kristallhaltigen Zellen analysiert. Gegebenenfalls werden gereinigte Kristalle oder kristallhaltige Zellen in schweren Atomlösungen für die experimentelle Phasierung eingeweicht. Diese Proben werden dann auf Beugungsexperimente in ähnlicher Weise durch Aufbringen auf einen Mikromesh-Träger und Blitzkühlung in flüssigem Stickstoff vorbereitet. Wir beschreiben und vergleichen serielle Beugungsexperimente von isolierten Mikrokristallen und Kristall-Enthaltende Zellen, die eine Mikrofokus-Synchrotron-Strahllinie verwenden, um Datensätze zu erzeugen, die für Phasing, Modellbau und Verfeinerung geeignet sind. Diese Arbeitsabläufe werden beispielhaft mit Kristallen des Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) Polyhedrins, das durch Infektion von Insektenzellen mit einem rekombinanten Baculovirus produziert wird, veranschaulicht. In diesem Fall Studie, in der Cellulo- Analyse ist effizienter als die Analyse der gereinigten Kristalle und liefert eine Struktur in ~ 8 Tage von Expression zu Verfeinerung.

Eine Übersicht über beide alternativen Methoden zur Strukturbestimmung mit in vivo Mikrokristallen wird dargestellt ( Abbildung 1 ). Polyeder kann leicht durch Beschallung und Zentrifugation gereinigt werden. Aufgrund ihrer Dichte bilden sie eine Schicht am Boden des Rohres unter einer Trennschicht, die durch Pipettieren entfernt werden kann ( Abbildung 3a und 3b ). Die Probe wird dann mehreren Runden...

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Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Ein Protokoll wird für die Röntgenkristallographie unter Verwendung von Proteinmikrokristallen vorgestellt. Zwei Beispiele, die in vivo- gewachsenen Mikrokristallen nach der Reinigung oder in Cellulo analysieren, werden verglichen.

Mikrokristallographie von Proteinkristallen und<em&gt; In Cellulo</em&gt; Beugung

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Wachsende Proteinkristallen mit unterschiedlichen Abmessungen mit automatisierten Kristallisation gepaart mit In Situ dynamische Lichtstreuung

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Forschung

Biochemie

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Messung und Interpretation von Sauerstoff-Verbrauch im ganzen fliegen Kopf Segmente

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Völlig autonom Charakterisierung und Datenerfassung aus Kristallen von biologischen Makromolekülen

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Anwendung der Biolayer-Interferometrie (BLI) zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen bei der Transkription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

Ableitung von Proteinkristallen mit I3C mit Random Microseed Matrix Screening

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

Optimierung des Wachstums von Endothiapepsin-Kristallen für serielle Kristallographie-Experimente

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

Mikrokristall-Elektronenbeugung kleiner Moleküle

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...