Name: microcrystallography of protein crystals and in cellulo diffraction
Uploaded: 2017-07-21T14:00:00
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著者たちは、オーストラリアシンクロトロンのMX2ビームラインでの支援のために精製微結晶、Daniel ErikssonとTom Caradoc-Daviesの写真を提供するChan-Sien Layと、Monash UniversityのFlowCore施設からのKathryn FlanaganとAndrew Fryga貴重な援助。

注： インビボでの結晶化は、細菌、酵母、植物、昆虫および哺乳類を含む多くの生物において報告されている（参考文献21で概説されている）。哺乳動物細胞の一過性トランスフェクションおよび昆虫細胞のバキュロウイルス感染を使用して、組換えタンパク質の結晶化も実験室で達成されている。参考文献22の指示に従って生成されたバキュロウ?...

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	<li>Tari, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+structural+biology+in+drug+discovery.">The utility of structural biology in drug discovery.</a> Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation.">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), (2014).</li><li>Redecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natively+inhibited+Trypanosoma+brucei+cathepsin+B+structure+determined+by+using+an+X-ray+laser.">Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser.</a> Science. 339 (2013), 227-230 (2013).</li><li>Shi, D., Nannenga, B. 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(81), (2013).</li><li>Khurana, A., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+For+Production+of+Recombinant+mCD1d+Protein+in+Insect+Cells.">A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.</a> J Vis Exp. (10), (2007).</li><li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells.">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+calcineurin+crystals+formed+using+the+baculovirus+expression+system.">In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system.</a> Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).</li><li>Nass, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers. , (2013).</li></ol>

このプロトコルは、過去に見過ごされていた非常に小さな結晶の分析を容易にする目的で、微結晶を分析する2つのアプローチを提供する。 微結晶の浄化のための重要なステップ 提示されたプロトコールは、モデル系としてSf9細胞で発現されたボンビクス・モリ CPV1ポリヘドリンを用いて最適化されている。しかしながら、 in vivo微結晶は?...

生物学的高分子の高分解能構造の決定のためのX線結晶学の使用は、過去20年間にわたり安定した進行を経験している。非専門家による研究者によるX線結晶学の益々の取り込みは、ライフサイエンスの多くの分野におけるこのアプローチの民主化を実証している1 。 歴史的に、約10μm以下の寸法を有する結晶は、構造決定のために使用できないとしても、困難であると考えられてきた。世界的なシンクロトロン放射源の専用マイクロフォーカスビームラインの利用可能性と、微結晶を操作するためのツールの開発などの技術的進歩により、X線マイクロ結晶の幅広い利用を妨げてきた多くの障壁が取り除かれました。シリアルX線microcrystallography 2,3及びマイクロ電子回折4ヘクタールの進歩構造決意用マイクロおよびナノ結晶の使用が可能でなく、大きな結晶5、6、7の使用に時々好ましくないだけであることが示されまし。 これらの進歩は、第一のペプチド8及び昆虫ウイルス9、10によって生成される天然の結晶の研究に適用しました。それらは現在、膜タンパク質や大きな複合体などの最も難しい系を含む多様な生物学的巨大分子に使用されています11 。これらの微結晶の分析を容易にするために、それらはメソ 、特に膜タンパク質12およびマイクロ流体チップ13において分析されている。 これらの新規な微結晶化方法の利用可能性は、古典的なインビトロ crystallogenesisに代わるものを提供する構造生物学14、15、16のための新たな経路として結晶体内。残念なことに、 インビボ結晶が産生されても、細胞からの精製中のリガンドの分解または喪失、シンクロトロンビームラインでの結晶の操作および視覚化の困難さ、退屈なX線回折実験などのいくつかの障害が残る。別の結晶はまた、任意の精製工程17、18、19せずに細胞内で直接分析されているように。比較分析はcelluloアプローチにおけるように精製された結晶およびより高い解像度20の収率データの分析よりも効率的であることを示唆しています。 このプロトコルはタンパク質微結晶学の新しい研究者を支援する傾向があった。それは、シンクロトロンビームラインでのX線回折実験のための試料調製および操作に焦点を当てた方法論を提供する。 2つの選択肢が、古典的な微結晶学のための単離された結晶またはフローサイトメトリーによってソーティングされた結晶含有細胞を用いて、セルロ分析で提案されている（ 図1 ）。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="629">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sf9 cells</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SF900-SFM insect medium</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">1L cell culture flask</td>
			<td style="width:127px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Shaking incubator for insect cell culture</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50mL conical tubes</td>
			<td style="width:127px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifuge with swing buckets for 50mL tubes</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sonicator equiped with a 19mm probe</td>
			<td>MSE Soniprep 150&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass slides</td>
			<td style="width:127px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hemacytometer</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Propidium iodide</td>
			<td style="width:127px;">Thermofisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD Influx cell sorter&#160;</td>
			<td style="width:127px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Hampton Heavy atom screens</td>
			<td style="width:127px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:127px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Micromesh</td>
			<td style="width:127px;">Mitigen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">700/25 meshes offer a larger surface. Indexed meshes can be purchased for systematic studies.</td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;width:216px;">Paper wick</td>
			<td style="width:127px;">Mitigen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">The size of the paper wick can be varied for optimal flow. This will largely depend on the nature of the crystals and cryoprotectant used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethylene glycol</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">MX2 microfocus beamline</td>
			<td style="width:127px;">Australian Synchrotron</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">A list of available microfocus beamlines can be found in Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Facets of Protein 
			Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793&#8211;1806, 
			doi:10.1071/CH14455.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microcrystallography of protein crystals and in cellulo diffraction

多くのシンクロトロン施設で高品質のマイクロフォーカスビームラインが出現したことにより、最大の次元で10μm以下の結晶の日常的な解析が可能になりました。本発明者らは、X線結晶学によるタンパク質微結晶の構造決定のための2つの代替のワークフローを提示し、特にin vivoで成長した結晶に焦点を当てる。微結晶は、超音波処理によって細胞から抽出され、微分遠心分離によって精製されるか、または結晶含有細胞のフローサイトメトリーによる細胞選別の後、セルロで分析される。場合によっては、精製された結晶または結晶含有セルを、実験段階的な調整のために重原子溶液に浸漬する。これらの試料は、マイクロメッシュ支持体上に塗布し、液体窒素中でフラッシュ冷却することにより同様の方法で回折実験用に調製する。我々は、単離された微結晶および結晶質結晶の連続回折実験を簡単に説明し、モデル構築および精密化に適したデータセットを生成するためにマイクロフォーカスシンクロトロンビームラインを使用している。 これらのワークフローは、昆虫細胞に組換えバキュロウイルスを感染させることによって産生されるBombyx mori cypovirus 1（BmCPV1）ポリヘドリンの結晶で例示される。このケーススタディでは、セルロ分析では精製された結晶の分析よりも効率的であり、発現から精製まで約8日間で構造が得られます。

生体内微結晶を用いた構造決定のための代替方法の両方の概要が示されている（ 図1 ）。多面体は、超音波処理および遠心分離によって容易に精製することができる。密度のため、ピペットで取り除くことができる破片の層の下のチューブの底に層を形成する（ 図3aおよび3b ）。次いで、サンプ?...

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Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

タンパク質微結晶を用いたX線結晶解析のためのプロトコールが提示されている。精製後又はcelluloにおける微結晶-grown インビボで分析する2つの例が比較されます。

タンパク質結晶の微結晶化および<em&gt;セルロで</em&gt;回折

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

タンパク質結晶の成長を使用して異なる寸法自動結晶化その場の動的光散乱と相まって

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

測定と酸素消費量全体の解釈飛ぶ頭セグメント

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

完全自律型の特性と生体高分子の結晶からのデータ収集

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

転写におけるタンパク質とタンパク質の相互作用を研究するための生体層干渉計(BLI)の応用

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

組み合わせ単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的ファージ選択による高特異的化学的誘起タンパク質二量体化システムの作成

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Derivatization of Protein Crystals with I3C using Random Microseed Matrix Screening

ランダムマイクロシードマトリックススクリーニングによるI3Cによるタンパク質結晶の誘導体化

Protein structure elucidation using X-ray crystallography requires both high quality diffracting crystals and computational solution of the diffraction ...

Optimizing the Growth of Endothiapepsin Crystals for Serial Crystallography Experiments

連続結晶構造解析実験のためのエンドチアペプシン結晶の成長の最適化

Here, a protocol is presented to facilitate the creation of large volumes (&#62; 100 &#181;L) of micro-crystalline slurries suitable for serial ...

Microcrystal Electron Diffraction of Small Molecules

低分子の微小結晶電子回折

A detailed protocol for preparing small molecule samples for microcrystal electron diffraction (MicroED) experiments is described. MicroED has been ...