Name: assessment of sarcoplasmic reticulum calcium reserve and intracellular diastolic calcium removal in isolated ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2017-09-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (no 81100159, Dongwu Lai, 81401147, Juhong Zhang), le médical et santé Science programme de la Province du Zhejiang (no 201646246, Dongwu Lai) et les sciences de la santé et Plan de la technologie de la ville de Hangzhou (no 2013A28, Ding Lin).

toutes les expérimentations animales ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité de l’urbanisme au centre de recherche expérimentale, Académie chinoise des Sciences médicales chinoises et Université de Zhejiang et d’institutionnels animalier.
 1. préparation de la solution <ol><li>préparer toutes les solutions tel que décrit dans le tableau 1.</li></ol>
 2. isolement de gauche ventricule (LV) Cardiomyocytes<...

<ol>
	<li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Ca+(2+)-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat.">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80 (2015).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes.">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li><li>Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+decay+of+Ca2++homeostasis+in+the+development+of+diabetic+cardiomyopathy.">Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy.</a> Cardiovasc Diabetol. 13, 75 (2014).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+diabetic+cardiomyocytes.">Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes.</a> Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).</li><li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy.">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).</li><li>Ferrantini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R4496C+RyR2+mutation+impairs+atrial+and+ventricular+contractility.">R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility.</a> J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).</li><li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects.">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+inhibition+in+heart+failure,+beneficial,+harmful,+or+both.">CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+kinase+inhibitor,+fasudil,+ameliorates+diabetes-induced+cardiac+dysfunction+by+improving+calcium+clearance+and+actin+remodeling.">The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling.</a> J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+Current-Induced+Abnormal+Impulses+in+CaMKII&#948;+Knockout+Mouse+Ventricular+Myocytes.">Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKII&#948; Knockout Mouse Ventricular Myocytes.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+L-type+calcium+current+and+cardiac+function+in+CaMKII{delta}+knockout+mice.">Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice.</a> Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).</li><li>Roussel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoyl-carnitine+increases+RyR2+oxidation+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++leak+in+cardiomyocytes:+Role+of+adenine+nucleotide+translocase.">Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).</li><li>Yaras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+diabetes+on+ryanodine+receptor+Ca2++release+channel+(RyR2)+and+Ca2++homeostasis+in+rat+heart.">Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart.</a> Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Overexpression+of+O-GlcNAcase+Improves+Contractile+Function+in+the+Diabetic+Heart.">Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart.</a> Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).</li></ol>

Le flux de calcium libéré de la SR est la Ca2 + source principale pour la systole au cœur. Dans une certaine mesure, l’amplitude de la SR Ca2 + contenu et fractionnaire Ca2 + libéré de la SR reflètent la SR Ca2 + réserve disponible pour la contraction cardiaque. En revanche, la Ca2 + réserve de SR dépend de la capacité du SR Ca2 + recaptage, Ca2 + fuite de SR et leur équilibre dans l’ensemble de la SR au cours de la diastole<sup c...

Calcium intracellulaire ([Ca2 +]i) recyclage joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes1. Comme nous le savons, la calcium Ca2 + libération induite initie l’excitation-contraction de couplage, qui traduisent le signal électrique à la contraction. Dépolarisation de la membrane active le sarcolemme Ca L-type canaux2 + , qui induisent la Ca2 + libèrent de SR dans le cytoplasme par l’intermédiaire de récepteurs de la ryanodine (RyR2) de 2. Les transitoires élevées cytoplasmique Ca2 + initie la contraction des myofibrilles. Au cours de la diastole, cytoplasmique Ca2 + est reuptaken dans la SR au moyen de la SR Ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) et pompé hors du cardiomyocyte via la Na+-Ca2 + échangeur (NCX)2. Ce processus conduit à la contraction-relaxation recyclage dans le cardiomyocyte.
Le SR cardiaque est un réseau de membrane intracellulaire qui entoure la machinerie contractile. Il sert un Ca2 + réservoir pour contraction et il réabsorbe intracellulaire Ca2 + lors du relâchement. La SR Ca2 + réserve disponible pour bat est déterminée pour la contractilité cardiaque. Pendant ce temps, la suppression du Ca intracellulaire2 + est critique pour la diastole cardiaque. Sous certaines conditions physiopathologiques, comme le diabète et une insuffisance cardiaque, ayant une déficience Ca2 + dégagement et déprimé SR Ca2 + magasin dans les cardiomyocytes peut être impliqué dans le processus de la dysfonction cardiaque2,3 ,4.
Pour mesurer la libération de SR Ca2 + et diastolique Ca2 + enlèvement dans les cardiomyocytes, il y a deux approches couramment : l’intégrité du NCX courant issu des patch clamp5,6et l’autorité de certification induit par la caféine 2 + pulse issu deCa 2 + fluorescence d’imagerie7,8,9. La première approche repose sur le fait que le Ca2 + libéré de la SR est largement pompé hors de la cellule par NCX. Toutefois, cette approche est limitée par son exigence d’équipements de pointe et l’exploitation habile. Dans la présente étude, nous décrivons une approche pratique pour évaluer le SR Ca2 + réserve et Ca2 + enlèvement dans les myocytes en mesurant un induit par la caféine Ca2 + pulse basé sur un Ca2 + fluorescence système d’imagerie. En bref, fluorescence intracellulaire de Ca2 + est indiqué par Fura-2. Par interconnexion du système de perfusion et un système de stimulation, nous présentons un programme pour passer la perfusion et le rythme de système automatiquement. 10 mM de caféine a été employé pour induire rapidement la libération totale de Ca2 + dans le SR. Les constantes de temps de décroissance exponentielle (Tau) des transitoires de calcium et des légumineuses de calcium induit par la caféine proviennent de la courbe exponentielle mono, qui reflètent la contribution de SERCA et NCX diastolique Ca2 + retrait en conséquence.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>E31K43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>I02T070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>G22u018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPEs</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLBM 7880V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10189341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10154048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10144B17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>F21S033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>C31U038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10149849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J5407a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLBM6826V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>45k16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>735094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caffeine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX 71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Langendorff system</td>
			<td>Beijing Syutime Technology Co</td>
			<td>PlexiThermo-S-LANGC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Marchauser</td>
			<td>MM33 links</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>FHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controlled Gravity Perfusion System</td>
			<td>ALA</td>
			<td>VC 3-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>valve commander software</td>
			<td>ALA</td>
			<td>VC 3 1.0.1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision flow regulator</td>
			<td>Delta Med</td>
			<td>3204315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>04-08-[360]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron Removable Tip</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>360um i.d.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>Hyperswitch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording software</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>IonWizard 6.2.59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MyoPacer EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-dawley rats</td>
			<td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.</td>
			<td>SCXK 2016-01-007436</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of sarcoplasmic reticulum calcium reserve and intracellular diastolic calcium removal in isolated ventricular cardiomyocytes

Recyclage de calcium intracellulaire joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes. Réticulum sarcoplasmique cardiaque (SR) sert d’un Ca2 + réservoir de contraction, qui reuptakes intracellulaire Ca2 + lors du relâchement. La SR Ca2 + réserve disponible pour bat est déterminée pour la contractilité cardiaque, et la suppression du Ca intracellulaire2 + est critique pour la fonction cardiaque diastolique. Dans certaines conditions physiopathologiques, comme le diabète et l’insuffisance cardiaque, le dégagement de calcium ayant une déficience et SR Ca2 + store dans les cardiomyocytes peuvent être impliqués dans la progression du dysfonctionnement cardiaque. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer SRCa2 + réserve et diastolique Ca2 + suppression. En bref, un cardiomyocyte unique a été isolée par voie enzymatique, et la fluorescence2 + Ca intracellulaire indiquée par Fura-2 a été enregistrée par un système d’imagerie calcique. Pour utiliser une caféine pour induire la libération totale de SR Ca2 + , nous prédéfinir un assorties de perfusion automatique interconnexion la stimulation et le système de perfusion. Ensuite, l’ajustement de la courbe exponentielle mono a été utilisé pour analyser les constantes de temps de désintégration des transitoires de calcium et des légumineuses de calcium induit par la caféine. En conséquence, la contribution de la SR Ca2 +-ATPase (SERCA) et Na+-Ca2 + échangeur (NCX) à l’élimination du calcium diastolique a été évaluée.

Ici, nous illustrons la streptozotocine (STZ) - induced rats diabétiques (DM) et appariés selon l’âge Sprague - Dawley (SD) les rats par exemple. des rats SD mâles âgés de 8 semaines (200 ± 20 g) a reçu une injection intrapéritonéale de STZ (70 mg/kg, ip) pour le tampon de groupe ou citrate de DM pour le groupe témoin. Une semaine après l’administration de STZ, rats avec glycémie &#62; 16,7 mmol/L ont été considérés comme diabétique. Après 8 semaines, les myocytes L...

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Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Recyclage de calcium intracellulaire joue un rôle essentiel dans la régulation de la fonction systolique et diastolique dans les cardiomyocytes. Nous décrivons ici un protocole pour évaluer le réticulum sarcoplasmique Ca2 + réserve et fonction de suppression de calcium diastolique dans les cardiomyocytes en un système d’imagerie de calcium.

Évaluation de réticulum sarcoplasmique Calcium réserve et intracellulaires de Calcium diastolique enlèvement dans les Cardiomyocytes ventriculaires isolées

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

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