Name: assessment of sarcoplasmic reticulum calcium reserve and intracellular diastolic calcium removal in isolated ventricular cardiomyocytes
Uploaded: 2017-09-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Nacional de ciências naturais da China (n. º 81100159, Dongwu Lai; 81401147, Juhong Zhang), a medicina e saúde ciência programa da província de Zhejiang (n. º 201646246, Dongwu Lai) e a ciência de saúde e Plano de tecnologia da cidade de Hangzhou (n. º 2013A28, Ding Lin).

todas as experiências em animais foram realizadas em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comité de uso no centro de pesquisa Experimental, China Academy de chinês ciências médicas e Universidade de Zhejiang e institucional Cuidado Animal.
 1. preparação da solução <ol><li>preparar todas as soluções, conforme descrito na tabela 1.</li></ol>
 2. isolamento de esquerda Ventricular (LV) Cardiomyocytes Nota:...

<ol>
	<li>Capel, R. A., Terrar, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+Ca+(2+)-dependent+mechanisms+for+the+initiation+of+the+heartbeat.">The importance of Ca (2+)-dependent mechanisms for the initiation of the heartbeat.</a> Front Physiol. 6, 80 (2015).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes.">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li><li>Zhao, S. M., Wang, Y. L., Guo, C. Y., Chen, J. L., Wu, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+decay+of+Ca2++homeostasis+in+the+development+of+diabetic+cardiomyopathy.">Progressive decay of Ca2+ homeostasis in the development of diabetic cardiomyopathy.</a> Cardiovasc Diabetol. 13, 75 (2014).</li><li>Pereira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling+in+diabetic+cardiomyocytes.">Calcium signaling in diabetic cardiomyocytes.</a> Cell calcium. 56 (5), 372-380 (2014).</li><li>Coppini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Late+sodium+current+inhibition+reverses+electromechanical+dysfunction+in+human+hypertrophic+cardiomyopathy.">Late sodium current inhibition reverses electromechanical dysfunction in human hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 127 (5), 575-584 (2013).</li><li>Ferrantini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R4496C+RyR2+mutation+impairs+atrial+and+ventricular+contractility.">R4496C RyR2 mutation impairs atrial and ventricular contractility.</a> J Gen Physiol. 147 (1), 39-52 (2016).</li><li>Li, L., Chu, G., Kranias, E. G., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+myocyte+calcium+transport+in+phospholamban+knockout+mouse+relaxation+and+endogenous+CaMKII+effects.">Cardiac myocyte calcium transport in phospholamban knockout mouse relaxation and endogenous CaMKII effects.</a> Am J Physiol. 274, H1335-H1347 (1998).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaMKII+inhibition+in+heart+failure,+beneficial,+harmful,+or+both.">CaMKII inhibition in heart failure, beneficial, harmful, or both.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302, H1454-H1465 (2012).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+kinase+inhibitor,+fasudil,+ameliorates+diabetes-induced+cardiac+dysfunction+by+improving+calcium+clearance+and+actin+remodeling.">The Rho kinase inhibitor, fasudil, ameliorates diabetes-induced cardiac dysfunction by improving calcium clearance and actin remodeling.</a> J Mol Med (Berl). 95 (2), 155-165 (2017).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stretch+Current-Induced+Abnormal+Impulses+in+CaMKII&#948;+Knockout+Mouse+Ventricular+Myocytes.">Stretch Current-Induced Abnormal Impulses in CaMKII&#948; Knockout Mouse Ventricular Myocytes.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 24 (4), 457-463 (2013).</li><li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+L-type+calcium+current+and+cardiac+function+in+CaMKII{delta}+knockout+mice.">Alterations of L-type calcium current and cardiac function in CaMKII{delta} knockout mice.</a> Circ Res. 107 (3), 398-407 (2010).</li><li>Roussel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoyl-carnitine+increases+RyR2+oxidation+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++leak+in+cardiomyocytes:+Role+of+adenine+nucleotide+translocase.">Palmitoyl-carnitine increases RyR2 oxidation and sarcoplasmic reticulum Ca2+ leak in cardiomyocytes: Role of adenine nucleotide translocase.</a> Biochim Biophys Acta. 1852 (5), 749-758 (2015).</li><li>Yaras, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+diabetes+on+ryanodine+receptor+Ca2++release+channel+(RyR2)+and+Ca2++homeostasis+in+rat+heart.">Effects of diabetes on ryanodine receptor Ca2+ release channel (RyR2) and Ca2+ homeostasis in rat heart.</a> Diabetes. 54 (11), 3082-3088 (2005).</li><li>Hu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus-Mediated+Overexpression+of+O-GlcNAcase+Improves+Contractile+Function+in+the+Diabetic+Heart.">Adenovirus-Mediated Overexpression of O-GlcNAcase Improves Contractile Function in the Diabetic Heart.</a> Circ Res. 96 (9), 1006-1013 (2005).</li></ol>

Fluxo de cálcio libertado o SR é a principal fonte de Ca2 + para sístole no coração. Em certa medida, a amplitude do SR Ca2 + conteúdo e o fracionário Ca2 + libertado o SR refletir SR Ca2 + reserva disponível para a contração cardíaca. Por outro lado, a Ca2 + reserva de SR depende da capacidade de recaptação de SR Ca2 + , Ca2 + vazamento de SR e seu equilíbrio através do SR durante a diástole12,...

Cálcio intracelular ([Ca2 +]eu) reciclagem desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes1. Como sabemos, induzida por cálcio Ca2 + versão inicia o acoplamento, excitação-contração que traduzir o sinal elétrico para a contração. Despolarização da membrana ativa mecanismos L-tipo Ca2 + canais, que induzem Ca2 + lançamento do SR para o citoplasma via receptores ryanodine 2 (RyR2). Os transientes elevados citoplasmática Ca2 + inicia a contração das miofibrilas. Durante a diástole, citoplasmática Ca2 + é reuptaken para o SR mediante o SR Ca2 +-ATPase 2 (SERCA2) e bombeado fora os casos atravésdo nd+-Ca 2 + trocador (NCX)2. Este processo leva a reciclagem nos casos de contração-relaxamento.
O SR cardíaca é uma rede intracelular da membrana que rodeia a maquinaria contrátil. Ele serve como um reservatório de Ca2 + para a contração, e ele reabsorve intracelular Ca2 + durante o relaxamento. A SR Ca2 + reserva disponível para batidas é determinante para a contratilidade cardíaca. Entretanto, a remoção do intracelular Ca2 + é crítica para a diástole cardíaca. Sob algumas condições fisiopatológicas, loja em cardiomyocytes como diabetes e insuficiência cardíaca, prejudicada Ca2 + desembaraço e deprimido SR Ca2 + pode estar envolvida no processo de disfunção cardíaca2,3 ,4.
Para medir o SR Ca2 + liberação e diastólica Ca2 + remoção em cardiomyocytes, existem duas abordagens amplamente utilizadas: a integridade da corrente NCX baseado no remendo-braçadeira5,6e o Ca induzida por cafeína 2 + pulso baseado no Ca2 + fluorescência de imagem7,8,9. A primeira abordagem depende do fato de que o Ca2 + libertado o SR é largamente bombeado fora da célula por NCX. No entanto, essa abordagem é limitada pela sua exigência de equipamento avançado e hábil operação. No presente estudo, descrevemos uma abordagem conveniente para avaliar SR Ca2 + reserva e Ca2 + remoção em miócitos medindo induzida por cafeína Ca2 + pulso com base em um Ca2 + fluorescência sistema de imagem. Brevemente, intracelular Ca2 + fluorescência é indicada pelo Fura-2. Pela interligação do sistema de estimulação e sistema de perfusão, apresentamos um programa para mudar a perfusão e automaticamente o sistema de estimulação. cafeína de 10 mM foi empregada para induzir rapidamente total Ca2 + lançamento no Sr. As constantes de tempo de decaimento exponencial (Tau) de pulsos de cálcio induzida por cafeína e transientes de cálcio foram obtidas de mono-exponencial curva de encaixe, que refletem a contribuição da SERCA e NCX para remoção de Ca2 + diastólica em conformidade.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>E31K43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>I02T070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>G22u018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPEs</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLBM 7880V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10189341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10154048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10144B17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>F21S033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>C31U038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamic</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>10149849</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J5407a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SLBM6826V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase A</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10103586001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>45k16005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>735094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>caffeine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2 AM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F1201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX 71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Langendorff system</td>
			<td>Beijing Syutime Technology Co</td>
			<td>PlexiThermo-S-LANGC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Marchauser</td>
			<td>MM33 links</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion chamber</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>FHD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valve Controlled Gravity Perfusion System</td>
			<td>ALA</td>
			<td>VC 3-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>valve commander software</td>
			<td>ALA</td>
			<td>VC 3 1.0.1.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision flow regulator</td>
			<td>Delta Med</td>
			<td>3204315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Barrel Manifold Perfusion Pencil</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>04-08-[360]</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micron Removable Tip</td>
			<td>AutoMate Scientific</td>
			<td>360um i.d.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Measurement and Cell Dimensioning Systems</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>Hyperswitch</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recording software</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>IonWizard 6.2.59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>IonOptix</td>
			<td>MyoPacer EP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague-dawley rats</td>
			<td>Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.</td>
			<td>SCXK 2016-01-007436</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of sarcoplasmic reticulum calcium reserve and intracellular diastolic calcium removal in isolated ventricular cardiomyocytes

Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Retículo sarcoplasmático cardíaco (SR) serve como um reservatório de Ca2 + para a contração, que reuptakes intracelular Ca2 + durante o relaxamento. A SR Ca2 + reserva disponível para batidas é determinante para contractibility cardíaca, e a remoção de intracelular Ca2 + é crítica para a função cardíaca diastólica. Sob algumas condições fisiopatológicas, tais como diabetes e insuficiência cardíaca, liberação de cálcio prejudicada e SR Ca2 + loja em cardiomyocytes podem estar envolvidos no progresso da disfunção cardíaca. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar SRCa2 + reserva e diastólica Ca2 + remoção. Brevemente, um único casos estava enzimaticamente isolado, e a intracelular Ca2 + fluorescência indicada pelo Fura-2 foi gravada por um sistema de imageamento de cálcio. Para empregar a cafeína para indução total SR Ca2 + lançamento, nós um programa de interruptor automático perfusão pré-estabelecido pela interligação do sistema de estimulação e sistema de perfusão. Em seguida, o encaixe de curva mono-exponencial foi usado para a análise de constantes de tempo de decaimento de pulsos de cálcio induzida por cafeína e transientes de cálcio. Nesse sentido, a contribuição do SR Ca2 +-ATPase (SERCA) e at+-Ca2 + trocador (NCX) para remoção de cálcio diastólica foi avaliada.

Aqui, ilustramos estreptozotocina (STZ) - induzida ratos diabéticos (DM) e idade-combinadas Sprague - Dawley (SD) ratos por exemplo. ratos machos de SD 8 semanas (200 ± 20 g) receberam uma única injeção intraperitoneal de STZ (70 mg/kg, ip) para o buffer de grupo ou citrato de DM para o grupo de controle. Uma semana após a administração de STZ, ratos com glicemia &#62; 16.7 mmol/L foram considerados diabéticos. Depois de 8 semanas, os miócitos de LV foram enzimaticamente isolado...

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Assessment of Sarcoplasmic Reticulum Calcium Reserve and Intracellular Diastolic Calcium Removal in Isolated Ventricular Cardiomyocytes

Reciclagem de cálcio intracelular desempenha um papel crítico na regulação da função sistólica e diastólica em cardiomyocytes. Aqui, descrevemos um protocolo para avaliar sarcoplasmático Ca2 + reserva e função de remoção de cálcio diastólica em cardiomyocytes por um sistema de imagem de cálcio.

Avaliação da remoção de reserva e intracelular do cálcio diastólica cálcio sarcoplasmático em Cardiomyocytes Ventricular isolado

Intracellular calcium recycling plays a critical role in regulation of systolic and diastolic function in cardiomyocytes. Cardiac sarcoplasmic reticulum ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Assessment of Cardiac Function and Energetics in Isolated Mouse Hearts Using 31P NMR Spectroscopy

Avaliação da função cardíaca e Energetics em Corações Isolados rato Usando 31 P NMR Spectroscopy

Bioengineered mouse models have become powerful research tools in determining causal relationships between molecular alterations and models of ...

Medicina

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Ultrasound Based Assessment of Coronary Artery Flow and Coronary Flow Reserve Using the Pressure Overload Model in Mice

Avaliação ultra-som base de Artéria Coronária Flow e Fluxo Coronariano Reserve Usando o modelo de sobrecarga de pressão no Mice

Transthoracic Doppler echocardiography (TTDE) is a clinically useful, noninvasive tool for studying coronary artery flow velocity and coronary flow ...

Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension and Assessment of Right Ventricular Function in the Piglet

Tromboembólica crônica Hipertensão Pulmonar e Avaliação da Função Ventricular Direita no Piglet

An original piglet model of Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension (CTEPH) associated with chronic Right Ventricular (RV) dysfunction is described. ...

Transthoracic Speckle Tracking Echocardiography for the Quantitative Assessment of Left Ventricular Myocardial Deformation

Transtorácica salpico de rastreamento A ecocardiografia para a avaliação quantitativa do Ventrículo Esquerdo do miocárdio Deformação

The value of conventional echocardiography is limited by differences in inter-individual image interpretation and therefore largely dependent on the ...

Treatment with Vancomycin Loaded Calcium Sulphate and Autogenous Bone in an Improved Rabbit Model of Bone Infection

Tratamento com vancomicina carregado de sulfato de cálcio e osso autógeno em um modelo melhorado coelho de infecção óssea

Bone infection results from bacterial invasion, which is extremely difficult to treat in clinical, orthopedic, and traumatic surgery. The bone infection ...

Echocardiographic Measurement of Right Ventricular Diastolic Parameters in Mouse

Mensuração ecocardiográfica dos parâmetros diastólicos do ventrículo direito no mouse

Diastolic dysfunction is a prominent feature of right ventricular (RV) remodeling associated with conditions of pressure overload. However, the RV ...

Invasive Hemodynamic Assessment for the Right Ventricular System and Hypoxia-Induced Pulmonary Arterial Hypertension in Mice

Avaliação Hemodinâmica Invasiva para o Sistema Ventricular Direito e hipertensão arterial pulmonar induzida por hipóxia em camundongos

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a chronic and severe cardiopulmonary disorder. Mice are a popular animal model used to mimic this disease. ...

Generation of Ventricular-Like HiPSC-Derived Cardiomyocytes and High-Quality Cell Preparations for Calcium Handling Characterization

Geração de cardiomiócitos derivados de HiPSC semelhantes ao Ventricular e preparações celulares de alta qualidade para caracterização de manuseio de cálcio

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs) provide a valuable human source for studying the basic science of calcium (Ca2+) ...

In Vitro Assessment of Cardiac Function Using Skinned Cardiomyocytes

Avaliação in vitro da função cardíaca usando cardiomócitos esfolados

In this article, we describe the steps required to isolate a single permeabilized (&#34;skinned&#34;) cardiomyocyte and attach it to a force-measuring ...