Name: predicting gene silencing through the spatiotemporal control of sirna release from photo-responsive polymeric nanocarriers
Uploaded: 2017-07-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers at JoVE.com

Die Autoren danken dem Nationalen Institut für Allgemeine Medizinische Wissenschaften der National Institutes of Health (NIH) für die finanzielle Unterstützung durch einen Institutional Development Award (IDeA) unter der Nummer P20GM103541 sowie der Nummer P20GM10344615. Die hierin enthaltenen Aussagen spiegeln nicht die Ansichten des NIH wider. Wir bestätigen auch das Delaware Biotechnology Institute (DBI) und das Delaware Economic Development Office (DEDO) für die finanzielle Unterstützung durch den Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) Award (12A00448).

1. Formulierung von siRNA-Nanocarriern <ol><li> Vorbereitung von separaten Lösungen von siRNA und mPEG- b -P (APNBMA) mit gleichen Volumina, verdünnt in 20 mM 4- (2-Hydroxyethyl) piperazin-1-ethansulfonsäure (HEPES) -Puffer bei pH 6,0. <ol><li> SiRNA in einer Konzentration von 32 μg / ml bis 20 mM HEPES-Lösung zugeben. HINWEIS: Die siRNA war eine nicht zielgerichtete, universelle negative Kontrollsequenz; Jedoch kann die siRNA entworfen werden, um jedes Gen von Interesse zu zielen...

<ol>
	<li>Forbes, D. C., Peppas, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+small+RNA+and+DNA.">Oral delivery of small RNA and DNA.</a> J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).</li><li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+RNAi+in+humans+from+systemically+administered+siRNA+via+targeted+nanoparticles.">Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles.</a> Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).</li><li>Bouchie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Companies+in+footrace+to+deliver+RNAi.">Companies in footrace to deliver RNAi.</a> Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).</li><li>Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+Polymeric+Delivery+Systems+Amidst+a+Nucleic+Acid+Therapy+Renaissance.">Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance.</a> ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).</li><li>Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA+Delivery:+From+Lipids+to+Cell-penetrating+Peptides+and+Their+Mimics.">siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics.</a> Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).</li><li>Motta-Mena, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optogenetic+gene+expression+system+with+rapid+activation+and+deactivation+kinetics.">An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics.</a> Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).</li><li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system.">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).</li><li>Ziauddin, J., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarrays+of+cells+expressing+defined+cDNAs.">Microarrays of cells expressing defined cDNAs.</a> Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).</li><li>Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+drug+delivery+into+tissue+engineering.">Building drug delivery into tissue engineering.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).</li><li>Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+nanocarriers+for+drug+delivery.">Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery.</a> Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).</li><li>Shim, M. S., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+polymers+and+nanomaterials+for+gene+delivery+and+imaging+applications.">Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications.</a> Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).</li><li>Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimuli-responsive+copolymer+solution+and+surface+assemblies+for+biomedical+applications.">Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications.</a> Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).</li><li>Weber, W., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+biomedical+applications+of+synthetic+biology.">Emerging biomedical applications of synthetic biology.</a> Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states.">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li><li>Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+light-switchable+gene+promoter+system.">A light-switchable gene promoter system.</a> Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).</li><li>Huschka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Silencing+by+Gold+Nanoshell-Mediated+Delivery+and+Laser-Triggered+Release+of+Antisense+Oligonucleotide+and+siRNA.">Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA.</a> ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).</li><li>Li, H. -. J., Wang, H. -. X., Sun, C. -. Y., Du, J. -. Z., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shell-detachable+nanoparticles+based+on+a+light-responsive+amphiphile+for+enhanced+siRNA+delivery.">Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery.</a> R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).</li><li>Braun, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-Activated+Gene+Silencing+via+Gold+Nanoshell-siRNA+Conjugates.">Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates.</a> ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).</li><li>Gilleron, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+analysis+of+lipid+nanoparticle-mediated+siRNA+delivery,+intracellular+trafficking+and+endosomal+escape.">Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape.</a> Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).</li><li>Wittrup, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+lipid-formulated+siRNA+release+from+endosomes+and+target+gene+knockdown.">Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).</li><li>Roth, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+measurements+and+rational+materials+design+for+intracellular+delivery+of+oligonucleotides.">Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides.</a> Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).</li><li>Mao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+polyethylene+glycol+chain+length+on+the+physicochemical+and+biological+properties+of+poly(ethylene+imine)-graft-poly(ethylene+glycol)+block+copolymer/SiRNA+polyplexes.">Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes.</a> Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).</li><li>Raab, R. M., Stephanopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+gene+silencing+by+RNA+interference.">Dynamics of gene silencing by RNA interference.</a> Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).</li><li>Cuccato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+RNA+interference+in+mammalian+cells.">Modeling RNA interference in mammalian cells.</a> BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).</li><li>Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+synthetic+gene+delivery+vector+design+properties.">Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties.</a> Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).</li><li>Chen, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+intracellular+unpacking+kinetics+of+polyplexes+by+a+model+constructed+from+quantum+Dot-FRET.">Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET.</a> Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).</li><li>Bartlett, D. W., Davis, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+kinetics+of+siRNA-mediated+gene+silencing+from+live-cell+and+live-animal+bioluminescent+imaging.">Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging.</a> Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).</li><li>Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-Mediated+Activation+of+siRNA+Release+in+Diblock+Copolymer+Assemblies+for+Controlled+Gene+Silencing.">Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing.</a> Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).</li><li>Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Design+of+Polymer+Nanocarriers+to+Spatiotemporally+Control+Gene+Silencing.">Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing.</a> ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).</li><li>Green, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+and+release:+photocleavable+cationic+diblock+copolymers+as+a+potential+platform+for+nucleic+acid+delivery.">Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery.</a> Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Lipid+Raft+Partitioning+of+Fluorescently-tagged+Probes+in+Living+Cells+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy+(FCS).">Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS).</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Plasma+Membranes+of+Primary+Lymphocytes+Measured+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy.">Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> J Vis Exp. (120), e54756 (2017).</li><li>Buyens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+disassembly+of+siRNA+polyplexes+in+serum+is+crucial+for+predicting+their+biological+efficacy.">Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy.</a> J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).</li><li>Eden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+Half-Life+Dynamics+in+Living+Human+Cells.">Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells.</a> Science. 331 (6018), 764-768 (2011).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+Fluorescence+Monitoring+of+Rapid+Cycle+DNA+Amplification.">Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification.</a> Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).</li><li>Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixing-sequence-dependent+nucleic+acid+complexation+and+gene+transfer+efficiency+by+polyethylenimine.">Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine.</a> Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).</li><li>Liu, Y. M., Reineke, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(glycoamidoamine)s+for+gene+delivery:+Stability+of+polyplexes+and+efficacy+with+cardiomyoblast+cells.">Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells.</a> Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).</li><li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+tuning+of+siRNA+dose+response+by+combining+mixed+polymer+nanocarriers+with+simple+kinetic+modeling.">Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling.</a> Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).</li></ol>

Es gibt ein paar Schritte in der Methode, die besonders kritisch sind. Bei der Formulierung der Nanocarrier sind die Reihenfolge der Komponentenaddition und der Mischgeschwindigkeit zwei wichtige Einflussfaktoren für die Wirksamkeit 39 . Dieses Protokoll erfordert, dass die kationische Komponente, mPEG- b -P (APNBMA), der anionischen Komponente, siRNA, tropfenweise unter Vortexen zugesetzt wird. Je nach Formulierungsvolumen dauert dieser Mischvorgang 3-6 s. Um zu testen, ob die Nanocarr...

Kleine interferierende RNAs (siRNAs) vermitteln das posttranskriptionelle Gen-Silencing durch einen katalytischen RNAi-Weg, der hochspezifisch, potent und maßgeschneidert für nahezu jedes Zielgen 1 ist . Diese vielversprechenden Eigenschaften haben es ermöglicht, dass siRNA-Therapeutika in menschlichen klinischen Studien zur Behandlung zahlreicher Krankheiten, einschließlich metastasiertem Melanom und Hämophilie 2 , 3 vorankommen. Allerdings bestehen erhebliche Lieferprobleme, die die Übersetzung behindert haben 4 . Insbesondere müssen Lieferfahrzeuge stabil bleiben und siRNAs vor extrazellulärem Abbau schützen und dennoch die Nutzlast in das Zytoplasma 5 freisetzen. Darüber hinaus erfordern viele RNAi-Anwendungen verbesserte Methoden zur Regulierung der Gen-Silencing in Raum und Zeit 6 , die Nebenwirkungen in siRNA-Therapeutika reduzieren 7 und ermöglichen transformative aDvances in Anwendungen von Zell-Mikroarrays für die Wirkstoffforschung 8 bis hin zur Modulation von Zellreaktionen in regenerativen Gerüsten 9 . Diese Herausforderungen unterstreichen die Notwendigkeit neuer Materialien und Methoden zur besseren Kontrolle der Bindung gegenüber der Freisetzung in siRNA-Nanocarrier. Eine der vielversprechendsten Strategien zur Kontrolle der siRNA-Freisetzung und zur Verbesserung der räumlich-zeitlichen Regulierung ist der Einsatz von stimuli-reaktionsfähigen Materialien 10 . Beispielsweise wurde eine Vielzahl von Biomaterialien mit einer veränderlichen Nukleinsäure-Bindungsaffinität in Reaktion auf verändertes Redoxpotential oder pH-Wert oder angewandte Magnetfelder, Ultraschall oder Licht 11 entwickelt . Obwohl viele dieser Systeme eine verbesserte Kontrolle über die Nukleinsäureaktivität zeigen, ist die Verwendung von Licht als Trigger besonders vorteilhaft aufgrund seiner augenblicklichen zeitlichen Reaktion, der präzisen räumlichen Auflösung und der Leichtigkeit der Abstimmbarkeit <suP class = &quot;xref&quot;&gt; 12. Darüber hinaus wurde das Potenzial von photoempfindlichen Technologien zur Regulierung der Genexpression durch modernste induzierbare Promotor- und optogenetische Regulierungssysteme nachgewiesen; Diese Systeme leiden jedoch unter zahlreichen Herausforderungen, einschließlich begrenzter Kapazitäten zur Regulierung endogener Gene, Sicherheitsbedenken wie Immunogenität und Schwierigkeiten bei der Bereitstellung von Mehrkomponenten-Baugruppen 13 , 14 , 15 . Photo-responsive siRNA-Nanocarrier sind ideal geeignet, um diese Nachteile zu überwinden und bieten einen einfacheren und robusteren Ansatz zur räumlich-modulierenden Genexpression 16 , 17 , 18 . Leider sind Methoden zur genauen Vorhersage der resultierenden Protein-Knockdown-Antwort unklar. Eine zentrale Herausforderung ist, dass quantitative Auswertungen der siRNA-Freisetzung sindSelten 19 , 20 , und selbst wenn diese Auswertungen durchgeführt werden, wurden sie nicht mit Analysen der siRNA / Protein-Umsatzdynamik gekoppelt. Sowohl die Menge an siRNA freigesetzt als auch ihre Persistenz / Lebensdauer sind wichtige Determinanten der resultierenden Gen-Silencing-Dynamik; Daher ist ein Mangel an solchen Informationen eine große Trennung, die eine genaue Vorhersage der Dosis-Antwort in RNAi 21 ausschließt . Die Auseinandersetzung mit dieser Herausforderung würde die Formulierung der entsprechenden Struktur-Funktions - Beziehungen in Nanocarriern beschleunigen und besser informieren Biomaterial 22 - Design. Darüber hinaus würden solche Ansätze die Entwicklung von effektiveren siRNA-Dosierungsprotokollen ermöglichen. In einem Versuch, die dynamische Stummschaltung zu verstehen, haben mehrere Gruppen mathematische Modelle von RNAi 23 , 24 , 25 untersucht . Diese Rahmenbedingungen warenErfolgreich bei der Bereitstellung von Einsichten in siRNA-vermittelte Veränderungen in der Genexpression und zur Ermittlung der Geschwindigkeitsbegrenzungsschritte 26 . Diese Modelle wurden jedoch nur auf kommerzielle Genabgabesysteme ( z. B. Lipofectamin und Polyethylenimin (PEI)) angewendet, die nicht in der Lage sind, eine siRNA-Freisetzung zu kontrollieren, und die Komplexität der Modelle hat ihre Nützlichkeit stark eingeschränkt 27 . Diese Mängel unterstreichen einen unerfüllten Bedarf an neuen Materialien, die in der Lage sind, eine genau abstimmbare siRNA-Freisetzung zu kombinieren, kombiniert mit stromlinienförmigen und einfach zu bedienenden prädiktiven kinetischen Modellen. Unsere Methode adressiert alle diese Herausforderungen durch die Integration einer lichtempfindlichen Nanocarrier-Plattform mit gekoppelten Methoden zur Quantifizierung der freien siRNA und Modell-RNAi-Dynamik. Insbesondere wird die präzise kontrollierte siRNA-Freigabe 28 unserer Plattform durch zwei komplementäre Methoden zur genauen Quantifizierung von verkapselten vs. un überwachtGebundene siRNA. Die experimentellen Daten aus diesen Tests werden in einem einfachen kinetischen Modell eingegeben gene silencing Effizienzen a priori 29 vorherzusagen. Schließlich wird die On / Off-Natur der Nanocarrier leicht ausgenutzt, um Zellmuster in der Genexpression mit räumlicher Kontrolle auf der zellulären Längenskala zu erzeugen. Somit bietet dieses Verfahren ein leicht anpassbares Verfahren zur Steuerung und Vorhersage von Gen-Silencing in einer Vielzahl von Anwendungen, die von einer räumlich-zeitlichen Regulierung des Zellverhaltens profitieren würden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">siRNA</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">SIC001</td>
			<td style="width:195px;">non-targeted, universal negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">mPEG-b-P(APNBMA)</td>
			<td style="width:157px;">synthesized in our lab</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:195px;">photo-responsive polymer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">HEPES</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP310-100</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">436143</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">rubber gasket</td>
			<td style="width:157px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:145px;">3788T21</td>
			<td style="width:195px;">0.5 mL thick</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">UV laser&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Excelitas Technologies</td>
			<td style="width:145px;">Omnicure S2000</td>
			<td style="width:195px;">collimating lens and 365 nm filter used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">agarose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP160-100</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">ethidium bromide</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP1302-10</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">siRNA labelled with Dy547</td>
			<td style="width:157px;">GE Healthcare Dharmacon, Inc.</td>
			<td style="width:145px;">custom order</td>
			<td style="width:195px;">fluorophore conjugated to 5&#8217; end of sense strand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">microscope slide</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">12-550-A3</td>
			<td style="width:195px;">pre-cleaned glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Secure-Seal Spacer</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">S24735</td>
			<td style="width:195px;">double-sided adhesive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">LSM 780&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:195px;">confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">ZEN 2010</td>
			<td style="width:157px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:195px;">FCS analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">MATLAB</td>
			<td style="width:157px;">MathWorks</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:195px;">programming language</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">NIH/3T3 cells&#160;</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:145px;">ATCC CRL-1658</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Mediatech</td>
			<td style="width:145px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:195px;">growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:157px;">Mediatech</td>
			<td style="width:145px;">35-011-CV</td>
			<td style="width:195px;">heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:157px;">Mediatech</td>
			<td style="width:145px;">&#160;30-002-CI</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">6-well plates</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08-772-1B</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">11058021</td>
			<td style="width:195px;">transfection media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predicting gene silencing through the spatiotemporal control of sirna release from photo-responsive polymeric nanocarriers

Neue Materialien und Methoden sind erforderlich, um die Bindung gegen die Freisetzung von Nukleinsäuren für eine breite Palette von Anwendungen, die die genaue Regulation der Genaktivität erfordern, besser zu kontrollieren. Insbesondere würden neuartige stimuli-reaktionsfähige Materialien mit einer verbesserten räumlich-zeitlichen Kontrolle über die Genexpression verschiebbare Plattformen in der Wirkstoffforschung und der regenerativen Medizintechnologie freischalten. Darüber hinaus würde eine verbesserte Fähigkeit, die Nucleinsäure-Freisetzung aus Materialien zu kontrollieren, die Entwicklung von stromlinienförmigen Verfahren ermöglichen, um die Nanokarrier-Wirksamkeit a priori vorherzusagen, was zu einem beschleunigten Screening von Lieferfahrzeugen führt. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Vorhersage von Gen-Silencing-Effizienzen und zur Erzielung einer räumlich-zeitlichen Kontrolle über die Genexpression durch ein modulares photoempfindliches Nanocarrier-System. Kleine interferierende RNA (siRNA) wird mit mPEG- b- Poly (komplexen (5- (3- (Amino) propoxy) -2-nitrobenzylmethacrylat) (mPEG- b- P (APNBMA)) -Polymeren zu foRm stabile Nanocarrier, die mit Licht gesteuert werden können, um einstellbares, on / off siRNA Release zu ermöglichen. Wir skizzieren zwei komplementäre Assays mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie und Gelelektrophorese für die genaue Quantifizierung der siRNA-Freisetzung aus Lösungen, die intrazelluläre Umgebungen nachahmen. Informationen, die aus diesen Assays gewonnen wurden, wurden in ein einfaches RNA-Interferenz- (RNAi) -Kinetikmodell eingearbeitet, um die dynamischen Stummschaltungsreaktionen auf verschiedene Photo-Stimulus-Bedingungen vorherzusagen. Im Gegenzug ermöglichten diese optimierten Bestrahlungsbedingungen die Verfeinerung eines neuen Protokolls zur räumlich-zeitlichen Steuerung von Gen-Silencing. Diese Methode kann zelluläre Muster in der Genexpression mit Zell-zu-Zell-Auflösung und keine nachweisbaren Off-Target-Effekte erzeugen. Zusammenfassend bietet unser Ansatz eine einfach zu bedienende Methode zur Vorhersage dynamischer Veränderungen der Genexpression und zur präzisen Steuerung der siRNA-Aktivität in Raum und Zeit. Dieser Satz von Assays kann leicht angepasst werden, um eine breite Vielfalt von ot zu testenIhre stimuli-reaktionsfähigen Systeme, um die wichtigsten Herausforderungen zu adressieren, die für eine Vielzahl von Anwendungen in der biomedizinischen Forschung und Medizin relevant sind.

Nach der Formulierung der Nanocarrier wurden siRNA-Freisetzungsassays durchgeführt, um die Bestrahlungsbedingungen, die in den in vitro- Transfektionen verwendet werden sollen, zu informieren. Es wurden verschiedene Lichtdosierungen angewendet, um den Prozentsatz der freigesetzten siRNA zu bestimmen. Der erste Assay verwendete die Gelelektrophorese, um die freien siRNA-Moleküle von den noch komplexen / assoziierten siRNA-Molekülen zu trennen. Nanocarriers, die nicht mit Licht...

Watch this Scientific Journal Video about Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers at JoVE.com

Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Wir stellen eine neuartige Methode vor, die photoempfindliche Blockcopolymere für eine effizientere räumlich-zeitliche Kontrolle von Gen-Silencing ohne nachweisbare Off-Target-Effekte verwendet. Zusätzlich können Veränderungen in der Genexpression unter Verwendung einfacher siRNA-Freisetzungsassays und einfacher kinetischer Modellierung vorhergesagt werden.

Vorhersage des Gen-Silens durch die räumlich-zeitliche Kontrolle der siRNA-Freisetzung von photoreaktiven polymeren Nanocarriern

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulierung von Diblock Polymernanopartikel durch Nanopräzipitation Technik

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Forschung

Biotechnik

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Kombinatorische Synthese von und High-Throughput-Protein Release von Polymer Film-und Nanopartikel-Bibliotheken

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Projektierung eines zweischichtigen Hydrogel ASC Differenzierungskontrolle

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

Die Verwendung der<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Chandler Loop-Gerät, um die Biokompatibilität von modifizierten polymeren Blutleitungen beurteilen

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Poröses Silizium Mikropartikel für die Lieferung von siRNA-Therapeutika

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polymeren Mikronadelanordnung Fabrication durch Photolithographie

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Herstellung Superhydrophobe Polymere Materialien für biomedizinische Anwendungen

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Synthese von Gold-Nanopartikeln Integrated Photo-responsive Liposomen und Messung ihrer Mikroblasen Kavitation auf Pulse Laseranregung

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...