Name: predicting gene silencing through the spatiotemporal control of sirna release from photo-responsive polymeric nanocarriers
Uploaded: 2017-07-21T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers at JoVE.com

Os autores agradecem ao Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) pelo apoio financeiro através de um Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) sob o número de concessão P20GM103541, bem como o número de concessão P20GM10344615. As declarações aqui contidas não refletem as opiniões do NIH. Também reconhecemos o Delaware Biotechnology Institute (DBI) eo Delaware Economic Development Office (DEDO) para apoio financeiro através do prêmio Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) (12A00448).

1. Formulação de siRNA Nanocarriers <ol><li> Prepare soluções separadas de siRNA e mPEG- b- P (APNBMA) com volumes iguais diluídos em tampão 20 mM de ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanossulfónico (HEPES) a pH 6,0. <ol><li> Adicionar siRNA a uma concentração de 32 μg / mL a 20 mM de solução de HEPES. NOTA: O siRNA foi uma sequência de controle negativa universal não-direcionada; No entanto, o siRNA pode ser projetado para direcionar qualquer gene de interesse. </l...

<ol>
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Existem alguns passos no método que são particularmente críticos. Ao formular os nanocarriers, a ordem de adição de componentes e velocidade de mistura são dois parâmetros importantes que influenciam a eficácia 39 . Este protocolo requer que o componente catiónico, mPEG- b- P (APNBMA), seja adicionado ao componente aniónico, siARN, de forma gota a gota enquanto se agita com vortex. Dependendo do volume total da formulação, este processo de mistura leva 3-6 s. Para testar se o...

Os pequenos ARNs de interferência (siRNAs) medeiam o silenciamento de genes pós-transcrição através de uma via de RNAi catalítica que é altamente específica, potente e adaptada a praticamente qualquer gene alvo 1 . Essas características promissoras permitiram que a terapia com siRNA avançasse em ensaios clínicos em humanos para o tratamento de numerosas doenças, incluindo melanoma metastático e hemofilia 2 , 3 . No entanto, persistem persistentes problemas de entrega que prejudicaram a tradução 4 . Em particular, os veículos de entrega devem permanecer estáveis ​​e proteger siRNAs de degradação extracelular, mas também liberar a carga útil no citoplasma 5 . Além disso, muitas aplicações de RNAi requerem métodos aprimorados para regular o silenciamento de genes no espaço e no tempo 6 , o que reduzirá os efeitos colaterais na terapêutica com siRNA 7 e possibilitará transformar aDvances em aplicações que vão desde microarrays celulares para a descoberta de drogas 8 até a modulação de respostas celulares em andaimes regenerativos 9 . Esses desafios destacam a necessidade de novos materiais e métodos para controlar melhor a ligação e a liberação nos nanocarriers de siRNA. Uma das estratégias mais promissoras para controlar a liberação de siRNA e melhorar a regulação espaciotemporal é o uso de materiais sensíveis ao estímulo 10 . Por exemplo, uma grande variedade de biomateriais foram projetados com afinidade de ligação de ácido nucleico variável em resposta ao potencial redox ou pH alterado, ou campos magnéticos aplicados, ultra-som ou luz 11 . Embora muitos desses sistemas demonstrem um controle melhorado sobre a atividade do ácido nucleico, o uso da luz como gatilho é particularmente vantajoso devido à sua resposta temporal instantânea, resolução espacial precisa e facilidade de afinação <suP class = &quot;xref&quot;&gt; 12. Além disso, o potencial das tecnologias sensíveis à foto para a regulação da expressão gênica foi demonstrado por sistemas de regulação induzível induciável e sistemas reguladores optogênicos de última geração; No entanto, esses sistemas sofrem de inúmeros desafios, incluindo capacidades limitadas para regular genes endógenos, preocupações de segurança, como imunogenicidade e dificuldades na entrega de conjuntos de componentes múltiplos 13 , 14 , 15 . Photo-responsive siRNA nanocarriers são ideais para superar essas desvantagens e proporcionar uma abordagem mais simples e mais robusta para spatiotemporally modular a expressão de genes 16 , 17 , 18 . Infelizmente, métodos para prever com precisão a resposta resultante da redução de proteína permanecem difíceis. Um desafio fundamental é que as avaliações quantitativas da liberação de siRNA sãoRaro 19 , 20 , e mesmo quando essas avaliações são realizadas, elas não foram acopladas a análises da dinâmica de rotação de siRNA / proteína. Tanto a quantidade de siRNA liberada quanto a persistência / vida são determinantes importantes da dinâmica de silenciamento de genes resultante; Daí, a falta de tal informação é uma grande desconexão que impede uma previsão precisa de dose-resposta no RNAi 21 . Dirigir-se a este desafio agilizaria a formulação das relações estrutura-função apropriadas em nanocarriers e melhor informará os projetos de biomateriais 22 . Além disso, tais abordagens permitiriam o desenvolvimento de protocolos de dosagem de siARN mais eficazes. Na tentativa de entender a resposta dinamizante ao silenciamento, vários grupos investigaram modelos matemáticos de RNAi 23 , 24 , 25 . Esses quadros foramBem sucedido em fornecer informações sobre as mudanças mediadas pelo siRNA na expressão gênica e na identificação das etapas de limitação de taxa 26 . No entanto, esses modelos foram aplicados apenas aos sistemas comerciais de administração de genes ( por exemplo , Lipofectamina e polietilenimina (PEI)) que não são capazes de liberação de siRNA controlada e a complexidade dos modelos limitou severamente sua utilidade 27 . Essas deficiências destacam uma necessidade insatisfeita de novos materiais capazes de obter uma versão de siRNA sintonizável, combinada com modelos cinéticos preditivos simplificados e fáceis de usar. Nosso método aborda todos esses desafios através da integração de uma plataforma de nanocarrier sensível à luz com métodos acoplados para quantificar siRNA e dinâmica de RNAi de modelo. Em particular, o lançamento de siRNA precisamente controlado da nossa plataforma 28 é monitorado por dois métodos complementares para quantificar com precisão encapsulado vs.SiRNA ligado. Os dados experimentais desses ensaios são inseridos em um modelo cinético simples para prever as eficiências de silenciamento de genes a priori 29 . Finalmente, a natureza on / off dos nanocarriers é facilmente explorada para gerar padrões de células na expressão gênica com controle espacial na escala de comprimento celular. Assim, este método fornece um método facilmente adaptável para controlar e prever o silenciamento de genes em uma variedade de aplicações que se beneficiarão da regulação espaciotemporal do comportamento celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="680">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">siRNA</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">SIC001</td>
			<td style="width:195px;">non-targeted, universal negative control</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">mPEG-b-P(APNBMA)</td>
			<td style="width:157px;">synthesized in our lab</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:195px;">photo-responsive polymer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">HEPES</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP310-100</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">sodium dodecyl sulfate&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">436143</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">rubber gasket</td>
			<td style="width:157px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:145px;">3788T21</td>
			<td style="width:195px;">0.5 mL thick</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">UV laser&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Excelitas Technologies</td>
			<td style="width:145px;">Omnicure S2000</td>
			<td style="width:195px;">collimating lens and 365 nm filter used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">agarose</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP160-100</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">ethidium bromide</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP1302-10</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:183px;">siRNA labelled with Dy547</td>
			<td style="width:157px;">GE Healthcare Dharmacon, Inc.</td>
			<td style="width:145px;">custom order</td>
			<td style="width:195px;">fluorophore conjugated to 5&#8217; end of sense strand</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">microscope slide</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">12-550-A3</td>
			<td style="width:195px;">pre-cleaned glass</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Secure-Seal Spacer</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">S24735</td>
			<td style="width:195px;">double-sided adhesive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">LSM 780&#160;</td>
			<td style="width:157px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:195px;">confocal microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">ZEN 2010</td>
			<td style="width:157px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:195px;">FCS analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">MATLAB</td>
			<td style="width:157px;">MathWorks</td>
			<td style="width:145px;">N/A</td>
			<td style="width:195px;">programming language</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">NIH/3T3 cells&#160;</td>
			<td style="width:157px;">ATCC</td>
			<td style="width:145px;">ATCC CRL-1658</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Mediatech</td>
			<td style="width:145px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:195px;">growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:157px;">Mediatech</td>
			<td style="width:145px;">35-011-CV</td>
			<td style="width:195px;">heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:157px;">Mediatech</td>
			<td style="width:145px;">&#160;30-002-CI</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">6-well plates</td>
			<td style="width:157px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">08-772-1B</td>
			<td style="width:195px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:183px;">Opti-MEM</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:145px;">11058021</td>
			<td style="width:195px;">transfection media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

predicting gene silencing through the spatiotemporal control of sirna release from photo-responsive polymeric nanocarriers

São necessários novos materiais e métodos para controlar melhor a ligação e a liberação de ácidos nucleicos para uma ampla gama de aplicações que requerem uma regulação precisa da atividade gênica. Em particular, os novos materiais responsivos aos estímulos com controle espaciotemporal melhorado sobre a expressão gênica destravam plataformas traduzíveis em tecnologias de descoberta de drogas e medicina regenerativa. Além disso, uma capacidade aprimorada para controlar a liberação de ácido nucleico a partir de materiais permitiria o desenvolvimento de métodos simplificados para prever a eficácia do nanocarrier a priori , levando a triagem acelerada dos veículos de entrega. Aqui, apresentamos um protocolo para prever a eficiência de silenciamento gênico e alcançar o controle espaciotemporal sobre a expressão gênica através de um sistema nanocarrier modificador fotossensível modular. O pequeno ARN de interferência (siRNA) é complexado com mPEG- b- poli (metacrilato de 5- (3- (amino) propoxi) -2-nitrobenzilo) (mPEG- b- P (APNBMA)) paraRm estabilidade nanocarriers que podem ser controlados com luz para facilitar sintonizável, on / off siRNA libertação. Descrevemos dois ensaios complementares que utilizam espectroscopia de correlação de fluorescência e eletroforese em gel para a quantificação precisa da liberação de siRNA a partir de soluções que imitam ambientes intracelulares. As informações obtidas a partir desses ensaios foram incorporadas em um modelo cinético simples de RNAi (RNAi) para prever as respostas de silenciamento dinâmico a várias condições de fotoestimulação. Por sua vez, essas condições de irradiação otimizadas permitiram o refinamento de um novo protocolo para controle espacial controlando o silenciamento gênico. Este método pode gerar padrões celulares na expressão de genes com resolução célula a célula e sem efeitos detectáveis ​​fora do alvo. Em conjunto, nossa abordagem oferece um método fácil de usar para prever mudanças dinâmicas na expressão gênica e controlar com precisão a atividade de siRNA no espaço e no tempo. Este conjunto de ensaios pode ser facilmente adaptado para testar uma grande variedade de otSeus sistemas responsivos ao estímulo para abordar os principais desafios pertinentes a uma multiplicidade de aplicações em pesquisa biomédica e medicina.

Após a formulação dos nanocarriers, os ensaios de libertação de siRNA foram conduzidos para informar as condições de irradiação a serem utilizadas nas transfecções in vitro . Várias doses de luz foram aplicadas para determinar a porcentagem de siRNA que foi liberado. O primeiro ensaio utilizou eletroforese em gel para separar as moléculas de siRNA gratuitas das moléculas de siRNA ainda complexas / associadas ao polímero. Nanocarriers que não foram tratados com lu...

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Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers

Apresentamos um novo método que usa copolímeros de blocos foto-responsivos para um controle spatiotemporal mais eficiente do silenciamento gênico sem efeitos detectáveis ​​fora do alvo. Além disso, as mudanças na expressão gênica podem ser previstas usando ensaios diretos de liberação de siRNA e modelagem cinética simples.

Predicando silenciamento de genes através do controle Spatiotemporal da liberação de siRNA de Nanocarriers poliméricos com fotos

New materials and methods are needed to better control the binding vs. release of nucleic acids for a wide range of applications that require the precise ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Formulation of Diblock Polymeric Nanoparticles through Nanoprecipitation Technique

Formulação de nanopartículas poliméricas através da técnica de dibloco Nanoprecipitation

Nanotechnology is a relatively new branch of science that involves harnessing the unique properties of particles that are nanometers in scale ...

Bioengenharia

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Síntese combinatória de alta capacidade e liberação de proteínas a partir de polímero de Cinema e Bibliotecas Nanopartículas

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Engenharia de um hidrogel de camada dupla para controlar a diferenciação ASC

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

The Use of the Ex Vivo Chandler Loop Apparatus to Assess the Biocompatibility of Modified Polymeric Blood Conduits

O uso do<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Chandler Circuito Aparelho para avaliar a biocompatibilidade de Modificados Condutas sangue Poliméricos

The foreign body reaction occurs when a synthetic surface is introduced to the body. It is characterized by adsorption of blood proteins and the ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Porous Silicon micropartículas para entrega de siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

Polimérico Fabrication matriz Microneedle por fotolitografia

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Fabricating Superhydrophobic Polymeric Materials for Biomedical Applications

Fabricação de super-hidrofóbicas Materiais Poliméricos para aplicações biomédicas

Superhydrophobic materials, with surfaces possessing permanent or metastable non-wetted states, are of interest for a number of biomedical and industrial ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Síntese de nanopartículas de ouro lipossomas Integrated Photo-reactivos e medição das suas microbolhas cavitação em cima do pulso laser de excitação

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Entrega de terapêutica siRNA para o SNC Usando catiônicos e aniônicos lipossomas

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...