Name: medium-scale preparation of drosophila embryo extracts for proteomic experiments
Uploaded: 2017-05-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments at JoVE.com

Forfatterne takker medlemmer af Veraksa laboratoriet for nyttige kommentarer om manuskriptet og forslag til protokolforbedringer. AV blev støttet af NIH tilskud GM105813 og NS096402. LY blev støttet af University of Massachusetts Boston Sanofi Genzyme Ph.d.-stipendiat.

1. Forberedelse af 5 L Fly Cages (Tilpas 15 cm Plader) <ol><li> Hent de nødvendige materialer: 5-kvart (4,7-L) beholder med låg ( figur 1A ), nylon mesh og et barberblad. </li><li> Marker en 12 cm diameter cirkel og skær et hul i bunden af ​​beholderen ved hjælp af barberbladet ( figur 1B ). Skær et hul på 15 cm i låget ( figur 1C ). </li><li> Skær nylonsnit i 25 x 25 cm firkanter. </li><li> Placer masken over beholde...

<ol>
	<li>Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+developmental+processes:+insights+from+mass+spectrometry-based+proteomics.">Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).</li><li>Arbeitman, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+during+the+life+cycle+of+Drosophila+melanogaster.">Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster.</a> Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).</li><li>Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcription+of+the+Drosophila+engrailed+gene.">In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene.</a> Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).</li><li>Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+soluble+nuclear+fraction,+a+highly+efficient+transcription+extract+from+Drosophila+embryos.">The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos.</a> Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).</li><li>Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+in+Drosophila:+The+advantages+of+the+GS-TAP+system.">Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system.</a> Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).</li><li>Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+large+quantities+of+Drosophila+for+biochemical+experiments.">Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments.</a> Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).</li><li>Sisson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+large+populations+of+Drosophila+for+protein+biochemistry.">Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Caravaca, J. M., Lei, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+a+Drosophila+melanogaster+Population+Cage.">Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minibrain+and+Wings+apart+control+organ+growth+and+tissue+patterning+through+down-regulation+of+Capicua.">Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).</li><li>Neumuller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stringent+analysis+of+gene+function+and+protein-protein+interactions+using+fluorescently+tagged+genes.">Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes.</a> Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).</li><li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry.">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).</li><li>Mukherjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch+signalling+by+non-visual+beta-arrestin.">Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin.</a> Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).</li><li>Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Screen+for+Conditional+Growth+Suppressor+Genes+Identifies+the+Drosophila+Homolog+of+HD-PTP+as+a+Regulator+of+the+Oncoprotein+Yorkie.">A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie.</a> Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).</li><li>Anjum, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Toll+Signaling+and+Inflammation+by+beta-Arrestin+and+the+SUMO+Protease+Ulp1.">Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1.</a> Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).</li><li>Degoutin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riquiqui+and+minibrain+are+regulators+of+the+hippo+pathway+downstream+of+Dachsous.">Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous.</a> Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecdysone+receptor+coactivator+Taiman+links+Yorkie+to+transcriptional+control+of+germline+stem+cell+factors+in+somatic+tissue.">The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue.</a> Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).</li><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases.">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li><li>Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-autonomous,+ubiquitous+marker+for+the+analysis+of+Drosophila+genetic+mosaics.">A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics.</a> Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).</li><li>Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+analysis+of+Drosophila+melanogaster+embryos.">Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos.</a> J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).</li><li>Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+to+isolate+ubiquitin+conjugates+reveals+wide+role+for+ubiquitination+during+neural+development.">A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).</li><li>Ramirez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+the+Ubiquitin+Landscape+in+the+Drosophila+Embryonic+Nervous+System+and+the+Adult+Photoreceptor+Cells.">Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells.</a> PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).</li></ol>

Protokollen, der præsenteres her, er en simpel og generel fremgangsmåde til opstilling af Drosophila- populationskure på mellemstore skalaer og fremstilling af hele- celleproteinekstrakter fra embryoner. De resulterende ekstrakter kan anvendes i en række forskellige downstream-applikationer, såsom rensning af proteinkomplekser på affinitetsharpikser. Det er kritisk at udføre ekstraktionstrinnene på is og anvende stærk proteasehæmning for at minimere proteinforringelse. Som b...

Genetiske skærmbilleder og mere nylig har genomiske tilgange revolutioneret undersøgelsen af ​​biologiske funktioner. Imidlertid er vigtig cellulær information kodet i proteiner og deres ensemble af interaktive partnere. Mens traditionelle genetiske modifikationsskærme kan identificere hastighedsbegrænsende vejkomponenter og genvinde indirekte interaktioner, ligger styrken af ​​de proteomiske fremgangsmåder i deres evne til at identificere komplette interaktive netværk af proteiner af interesse. Proteomics er således en værdifuld ortogonal metode til at studere biologiske systemer og supplerer genomics, transcriptomics og traditionelle genetiske skærme. Affinitetsrensning-massespektrometri (AP-MS) har vist sig at være en kraftfuld tilgang til undersøgelse af protein-proteininteraktioner (PPI&#39;er) i deres naturlige miljø i celler og væv 1 , 2 . Denne metode gør det muligt at identificere direkte eller indirekte interaktioner ved specifik udviklingAl faser eller vævskontekster, og har med succes været anvendt til at identificere flere nye PPI&#39;er i en række udviklingsveje (gennemgået i reference 1 ). På trods af PPI-studiernes ubestridte succes er de fleste af dem blevet udført i dyrkede celler, hvor de &quot;agn&quot; proteiner af interesse var overudtrykt. Der er to problemer med at studere PPI&#39;er i cellekultur: For det første kan en specifik cellelinie ikke give et komplet komplement af interaktioner på grund af manglende ekspression af visse proteiner. For det andet kan høj overekspression, der normalt anvendes i sådanne analyser, føre til genstande såsom protein misfolding eller identifikation af falske positive interaktioner. Begge disse begrænsninger kan overvindes ved at analysere PPI&#39;er in vivo . Et begrænsende trin i sådanne eksperimenter er tilgængeligheden af ​​udgangsmaterialet til oprensning af proteinkomplekser. Drosophila melanogaster har længe været brugt som model for funktionel analyseSis, og for nylig er det også vist sig at være et fremragende system til at studere PPI&#39;er in vivo . Drosophila embryogenese repræsenterer en særdeles attraktiv vævstype til at studere PPI&#39;er, fordi embryoner nemt kan indsamles i store mængder, og også fordi de fleste gener (&gt; 88%) udtrykkes i løbet af embryogenese og således tilvejebringer et rigt in vivo miljø til detektering af relevante PPI&#39;er 3 . Traditionelt udnyttede biokemiske undersøgelser i fluer meget store embryonsamlinger (100-150 g), såsom dem, der var nødvendige for rensning af funktionelle transkriptionelle lysater 4 , 5 . Tidligere AP-MS- undersøgelser i Drosophila havde også brug for store mængder embryoner (5-10 g), fordi de var afhængige af en to-trins oprensning, såsom tandemaffinitetsrensning (TAP), med det tilhørende tab af materiale i hvert trin 6 . Stor amounTs udgangsmateriale nødvendiggjorde opsætning af embryoindsamlinger i store befolkningsburer, som kan være både dyre (når de købes kommercielt) og tidskrævende at vedligeholde og rense 7 , 8 , 9 . Nylige fremskridt i udviklingen af ​​en-trins affinitetsrensningsfremgangsmåder såvel som den voksende følsomhed af massespektrometre har reduceret den nødvendige mængde udgangsmateriale med en størrelsesorden. Ved anvendelse af tags som streptavidinbindende peptid (SBP) eller grønt fluorescerende protein (GFP) og startende fra mindre end 1 g embryoner er det muligt at isolere mængderne af agnprotein og interaktive komponenter, der ville være tilstrækkelige til identifikation af Massespektrometri 10 , 11 . Formålet med protokollen, der præsenteres her, er at hjælpe forskerne overcoMig en opfattet barriere for biokemisk analyse af PPI&#39;er in vivo . Til dette formål tilvejebringer vi en simpel og billig procedure til indsamling af Drosophila embryoner i medium skala (0,5-1 g) efterfulgt af en-trins forberedelse af fuldcelleproteinekstrakter, der er egnede til efterfølgende analyse af AP-MS eller andre fremgangsmåder . Vores metode er baseret på brug af specialfremstillede 1-L eller 5-L populationsbure, der let kan produceres af ethvert laboratorium. Desuden er de ovenfor beskrevne ekstraktionsbetingelser valideret i adskillige studier, både i dyrkede celler og in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1384">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3)</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">209330</td>
			<td style="width:644px;">For making 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3)</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">209320</td>
			<td style="width:644px;">Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875714</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Sefar NITEX nylon mesh</td>
			<td style="width:183px;">Sefar</td>
			<td style="width:119px;">03-180/44</td>
			<td style="width:644px;">180 micron, 44% open area, used for fly cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">49-56-9670</td>
			<td style="width:644px;">3 inch cutting tool for making 1-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:439px;">Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-823-33</td>
			<td style="width:644px;">For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch</td>
			<td style="width:183px;">Red Star&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">can be purchased from Amazon.com or other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Frozen 100% Apple Juice Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">can be purchased from a grocery store. Has to say &#34;100% apple juice&#34; on the can.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Methyl 4-hydroxybenzoate</td>
			<td style="width:183px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC126965000</td>
			<td style="width:644px;">also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8896</td>
			<td style="width:644px;">used for preparing lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:439px;">Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-740-2A</td>
			<td style="width:644px;">0.2 &#956;m pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">11697498001</td>
			<td style="width:644px;">Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Corning SFCA syringe filters&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-754-21</td>
			<td style="width:644px;">SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 &#956;m. Used for filtering final extract samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">BD&#160;Luer-Lok Disposable Syringes without Needles</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-823-2A</td>
			<td style="width:644px;">for filtering final extract samples. BD cat # 309604.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:439px;">Bleach</td>
			<td style="width:183px;">Clorox</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Corning Costar Netwell Plates</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-213</td>
			<td style="width:644px;">mesh containers for embryo collections. 74 &#956;m mesh size, 6-well.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-435B</td>
			<td style="width:644px;">homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medium-scale preparation of drosophila embryo extracts for proteomic experiments

Analyse af protein-protein-interaktioner (PPI&#39;er) er blevet en uundværlig tilgang til at studere biologiske processer og mekanismer, såsom cellesignalering, organismerudvikling og sygdom. Det er ofte ønskeligt at indhente PPI-information ved anvendelse af in vivo materiale for at opnå den mest naturlige og upartiske visning af interaktionsnetværkene. Frugtflugten Drosophila melanogaster er en glimrende platform til at studere PPI&#39;er in vivo , og lader sig til retfærdige tilgange til isolering af materiale til biokemiske forsøg. Frugtflyveembryoner repræsenterer især en bekvem type væv til at studere PPI&#39;er på grund af den nemme indsamling af dyr på dette udviklingsstadium og det faktum, at størstedelen af ​​proteiner udtrykkes i embryogenese og således tilvejebringe et relevant miljø for at afsløre de fleste PPI&#39;er. Her præsenterer vi en protokol til indsamling af Drosophila embryoner i medium skala (0,5-1 g), hvilket er en ideel mængde til et bredt udvalg afProteomiske applikationer, herunder analyse af PPI&#39;er ved affinitetsoprensning-massespektrometri (AP-MS). Vi beskriver vores designs til 1 L og 5 L bur til embryon samlinger, der nemt og billigt kan opstilles i ethvert laboratorium. Vi leverer også en generel protokol til embryonindsamling og proteinudvinding for at frembringe lysater, som kan anvendes direkte i downstream-applikationer som AP-MS. Vores mål er at give alle forskere adgang til analyser af PPI&#39;er in vivo .

For at illustrere brugen af ​​denne protokol i et proteinkompleks rensningsforsøg genererede vi en homozygot levedygtig flyve linje, arm-EGFP-ERK , der udtrykte EGFP-mærket Drosophila ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK kodet af det rullede gen) under kontrollen Af en ubiquitously udtrykt armadillo ( arm ) promotor 18 , 19 . Armpromotoren er aktiv i de fleste fas...

Watch this Scientific Journal Video about Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments at JoVE.com

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en retfærdig og billig tilgang til indsamling af Drosophila embryoner i medium skala (0,5-1 g) og fremstilling af proteinekstrakter, der kan anvendes i nedstrøms proteomiske applikationer, såsom affinitetsrensnings-massespektrometri (AP-MS ).

Middelskala forberedelse af<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoekstrakter til proteomiske forsøg

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Forberedelse om mitokondriel berigede Brøker for Metabolic Analyse i<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging Subcellulære Strukturer i Living Zebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM og Microrheology i cellen zebrafisk Embryo æggeblomme

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Forberedelse af Drosophila larve prøver til gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS)-baseret Metabolomics

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Sondering celle mekanik med perle-fri Optisk pincet i Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalt invasivt Embryo Transfer og embryo Vitrificering på det optimale embryo stadie i kanin model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Levende billeddannelse og analyse af muskelsammentrækninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Optøning, dyrkning og Cryopreserving Drosophila cellelinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

En direkte og enkel metode til at vurdere Drosophila melanogasterslevedygtighed fra embryo til voksen

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Præparat af Drosophila Larve og Pupal Testikler til analyse af celledeling i Levende, Intakt væv

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...