Name: medium-scale preparation of drosophila embryo extracts for proteomic experiments
Uploaded: 2017-05-30T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments at JoVE.com

De auteurs bedanken leden van het laboratorium Veraksa voor nuttige opmerkingen over het manuscript en suggesties voor protokolverbeteringen. AV werd ondersteund door de NIH-subsidies GM105813 en NS096402. LY werd ondersteund door de universiteit van Massachusetts Sanofi Genzyme Doctoral Fellowship.

1. Voorbereiding van 5 L Vliegkooien (om 15 cm Platen aan te passen) <ol><li> Verkrijg de benodigde materialen: 5-kwart (4,7-L) houder met deksel (afbeelding 1A ), nylon gaas en een scheermesje. </li><li> Merk een cirkel met een diameter van 12 cm en snijd een gat in de bodem van de container met behulp van het scheermesje ( figuur 1B ). Knip een gat van 15 cm in het deksel ( figuur 1C ). </li><li> Snijd nylon mesh in 25 x 25 cm ...

<ol>
	<li>Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+developmental+processes:+insights+from+mass+spectrometry-based+proteomics.">Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics.</a> Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).</li><li>Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+charting+protein-protein+interaction:+mass+spectrometry-based+approaches.">Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches.</a> Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).</li><li>Arbeitman, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+during+the+life+cycle+of+Drosophila+melanogaster.">Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster.</a> Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).</li><li>Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transcription+of+the+Drosophila+engrailed+gene.">In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene.</a> Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).</li><li>Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+soluble+nuclear+fraction,+a+highly+efficient+transcription+extract+from+Drosophila+embryos.">The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos.</a> Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).</li><li>Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+affinity+purification+in+Drosophila:+The+advantages+of+the+GS-TAP+system.">Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system.</a> Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).</li><li>Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raising+large+quantities+of+Drosophila+for+biochemical+experiments.">Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments.</a> Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).</li><li>Sisson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+large+populations+of+Drosophila+for+protein+biochemistry.">Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry.</a> CSH Protoc. 2007, (2007).</li><li>Caravaca, J. M., Lei, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+a+Drosophila+melanogaster+Population+Cage.">Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minibrain+and+Wings+apart+control+organ+growth+and+tissue+patterning+through+down-regulation+of+Capicua.">Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).</li><li>Neumuller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stringent+analysis+of+gene+function+and+protein-protein+interactions+using+fluorescently+tagged+genes.">Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes.</a> Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).</li><li>Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+complexes+in+Drosophila+with+tandem+affinity+purification-mass+spectrometry.">Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry.</a> Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).</li><li>Mukherjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Notch+signalling+by+non-visual+beta-arrestin.">Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin.</a> Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).</li><li>Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Screen+for+Conditional+Growth+Suppressor+Genes+Identifies+the+Drosophila+Homolog+of+HD-PTP+as+a+Regulator+of+the+Oncoprotein+Yorkie.">A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie.</a> Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).</li><li>Anjum, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Toll+Signaling+and+Inflammation+by+beta-Arrestin+and+the+SUMO+Protease+Ulp1.">Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1.</a> Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).</li><li>Degoutin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riquiqui+and+minibrain+are+regulators+of+the+hippo+pathway+downstream+of+Dachsous.">Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous.</a> Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ecdysone+receptor+coactivator+Taiman+links+Yorkie+to+transcriptional+control+of+germline+stem+cell+factors+in+somatic+tissue.">The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue.</a> Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).</li><li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases.">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li><li>Vincent, J. P., Girdham, C. H., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-autonomous,+ubiquitous+marker+for+the+analysis+of+Drosophila+genetic+mosaics.">A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics.</a> Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).</li><li>Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoproteome+analysis+of+Drosophila+melanogaster+embryos.">Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos.</a> J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).</li><li>Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+strategy+to+isolate+ubiquitin+conjugates+reveals+wide+role+for+ubiquitination+during+neural+development.">A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).</li><li>Ramirez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+the+Ubiquitin+Landscape+in+the+Drosophila+Embryonic+Nervous+System+and+the+Adult+Photoreceptor+Cells.">Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells.</a> PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).</li></ol>

Het hier gepresenteerde protocol is een eenvoudige en algemene procedure voor het opbouwen van Drosophila populatiekooien op middelgrote schaal en het maken van eiwitten van hele cellen uit embryo&#39;s. De resulterende extracten kunnen worden gebruikt in een verscheidenheid van stroomafwaartse toepassingen, zoals zuivering van eiwitcomplexen op affiniteitsharsen. Het is van cruciaal belang om de extractiestadies op ijs uit te voeren en sterke protease remming te gebruiken, om eiwitafbraak te minimalis...

Genetische schermen en recentere genomische benaderingen hebben de studie van biologische functies ge revolutioneerd. Echter, belangrijke cellulaire informatie is gecodeerd in eiwitten en hun ensemble van interactieve partners. Terwijl traditionele genetische modificatieschermen de snelheidsbeperkende componenten kunnen identificeren en indirecte interacties herstellen, ligt de sterkte van de proteomische benaderingen in hun vermogen om directe interactie-netwerken van eiwitten van belang te identificeren. Proteomics is dus een waardevolle orthogonale methode om biologische systemen te bestuderen, en complementeert genomics, transcriptomics en traditionele genetische schermen. Affiniteit zuiverings-massaspectrometrie (AP-MS) is bewezen een krachtige aanpak om eiwit-eiwitinteracties (PPI&#39;s) in hun natuurlijke omgeving in cellen en weefsels 1 , 2 te bestuderen. Deze methode maakt het mogelijk om directe of indirecte interacties bij specifieke ontwikkeling te identificerenAl fases of weefselcontexten, en is succesvol gebruikt om meerdere nieuwe PPI&#39;s te identificeren in een verscheidenheid aan ontwikkelingswegen (onderzocht in referentie 1 ). Ondanks het onbetwiste succes van PPI-studies, zijn de meeste van hen uitgevoerd in gekweekte cellen, waarin de &#39;aas&#39; eiwitten van belang zijn overexpresseerd. Er zijn twee problemen bij het bestuderen van PPI&#39;s in celcultuur: eerst kan een specifieke cellijn geen volledige complement van interacties verschaffen als gevolg van het gebrek aan expressie van bepaalde eiwitten. Ten tweede kan hoge overexpressie die gewoonlijk bij dergelijke analyses wordt gebruikt, leiden tot artefacten zoals eiwit misfolding of identificatie van valse positieve interacties. Beide deze beperkingen kunnen worden overwonnen door PPI&#39;s in vivo te analyseren. Een beperkende stap bij dergelijke experimenten is de beschikbaarheid van het uitgangsmateriaal voor het zuiveren van eiwitcomplexen. Drosophila melanogaster is al lang gebruikt als model voor functionele analyseSis, en recentelijk is ook aangetoond dat het een uitstekend systeem is voor het bestuderen van PPI&#39;s in vivo . Drosophila embryogenese vertegenwoordigt een bijzonder aantrekkelijk weefsel type om PPI&#39;s te bestuderen, omdat embryo&#39;s gemakkelijk in grote hoeveelheden kunnen worden verzameld, en ook omdat de meeste genen (&gt; 88%) uitgedrukt worden in de loop van de embryogenese, waardoor een rijk in vivo omgeving verschaft wordt voor het opsporen van relevante PPI&#39;s 3 . Traditioneel gebruikten biochemische studies in vliegen zeer grote embryo-collecties (100-150 g), zoals die welke nodig zijn voor het zuiveren van functionele transcriptieve lysaten 4 , 5 . Vorige AP-MS studies in Drosophila hadden ook grote hoeveelheden embryo&#39;s nodig (5-10 g), omdat ze vertrouwden op een tweestapszuiveringsbenadering zoals tandemaffiniteitszuivering (TAP), met het bijbehorende verlies van materiaal bij elke stap 6 . Grote amounTs van het uitgangsmateriaal moest het opzetten van embryo-collecties in grote populatiekooien, die zowel duur als commercieel gekocht kunnen worden en tijdrovend zijn om 7 , 8 , 9 te onderhouden en te reinigen. Recente vooruitgang in de ontwikkeling van een-stap-affiniteitszuiveringsbenaderingen, evenals de toenemende gevoeligheid van massaspectrometers, hebben de benodigde hoeveelheid uitgangsmateriaal verminderd met een orde van grootte. Met behulp van labels zoals het streptavidine bindende peptide (SBP) of groen fluorescerend eiwit (GFP) en vanaf minder dan 1 g embryo&#39;s, is het mogelijk om de hoeveelheden aas eiwit en interactie componenten te isoleren die voldoende zouden zijn om te identificeren door Massaspectrometrie 10 , 11 . Het doel van het protocol dat hier wordt gepresenteerd, is om de onderzoekers overco te helpenMij ​​een waargenomen belemmering voor biochemische analyse van PPI&#39;s in vivo . Daartoe bieden wij een eenvoudige en goedkope procedure voor het verzamelen van Drosophila embryo&#39;s op middelgrote schaal (0,5-1 g), gevolgd door een stap bereiding van eiwitten van hele cellen die geschikt zijn voor latere analyse door AP-MS of andere benaderingen . Onze methode is gebaseerd op het gebruik van op maat gemaakte 1-L of 5-L populatiekooien die gemakkelijk door elk laboratorium kunnen worden geproduceerd. Bovendien zijn de hier getoonde extractie condities in verschillende studies gevalideerd, zowel in gekweekte cellen als in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1384">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3)</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">209330</td>
			<td style="width:644px;">For making 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3)</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">209320</td>
			<td style="width:644px;">Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875712</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875714</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB0875713A</td>
			<td style="width:644px;">Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Sefar NITEX nylon mesh</td>
			<td style="width:183px;">Sefar</td>
			<td style="width:119px;">03-180/44</td>
			<td style="width:644px;">180 micron, 44% open area, used for fly cages.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor</td>
			<td style="width:183px;">Home Depot</td>
			<td style="width:119px;">49-56-9670</td>
			<td style="width:644px;">3 inch cutting tool for making 1-L cages.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:439px;">Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11-823-33</td>
			<td style="width:644px;">For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch</td>
			<td style="width:183px;">Red Star&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">can be purchased from Amazon.com or other suppliers.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Frozen 100% Apple Juice Concentrate&#160;</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">can be purchased from a grocery store. Has to say &#34;100% apple juice&#34; on the can.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Methyl 4-hydroxybenzoate</td>
			<td style="width:183px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC126965000</td>
			<td style="width:644px;">also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">I8896</td>
			<td style="width:644px;">used for preparing lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:439px;">Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-740-2A</td>
			<td style="width:644px;">0.2 &#956;m pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">11697498001</td>
			<td style="width:644px;">Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Corning SFCA syringe filters&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-754-21</td>
			<td style="width:644px;">SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 &#956;m. Used for filtering final extract samples.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">BD&#160;Luer-Lok Disposable Syringes without Needles</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-823-2A</td>
			<td style="width:644px;">for filtering final extract samples. BD cat # 309604.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:439px;">Bleach</td>
			<td style="width:183px;">Clorox</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:644px;">used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Corning Costar Netwell Plates</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">07-200-213</td>
			<td style="width:644px;">mesh containers for embryo collections. 74 &#956;m mesh size, 6-well.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:439px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml</td>
			<td style="width:183px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">06-435B</td>
			<td style="width:644px;">homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

medium-scale preparation of drosophila embryo extracts for proteomic experiments

Analyse van eiwit-eiwit interacties (PPI&#39;s) is een onontbeerlijke aanpak geworden voor het bestuderen van biologische processen en mechanismen, zoals celsignaalvorming, ontwikkeling van organismen en ziekte. Het is vaak gewenst om PPI-informatie te verkrijgen door gebruik te maken van in vivo materiaal, om de meest natuurlijke en onpartijdige weergave van de interactie netwerken te verkrijgen. De vruchtvlieg Drosophila melanogaster is een uitstekend platform om PPI&#39;s in vivo te bestuderen en leent zich op eenvoudige aanpakken voor isolatiemateriaal voor biochemische experimenten. In het bijzonder vormen vruchtvliegenembryo&#39;s een geschikt type weefsel om PPI&#39;s te bestuderen door het gemakkelijk verzamelen van dieren in dit ontwikkelingsfase en het feit dat de meeste eiwitten uitgedrukt worden in embryogenese, waardoor een relevante omgeving wordt verschaft om de meeste PPI&#39;s te onthullen. Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van Drosophila embryo&#39;s op middelgrote schaal (0,5-1 g), wat een ideale hoeveelheid is voor een breed scala aanProteomische toepassingen, inclusief analyse van PPI&#39;s door affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS). We beschrijven onze ontwerpen voor 1 liter en 5 liter kooien voor embryo collecties die gemakkelijk en goedkoop in elk laboratorium kunnen worden opgezet. Wij bieden ook een algemeen protocol voor embryo-collectie en eiwit extractie om lysaten te genereren die direct kunnen worden gebruikt in downstream toepassingen zoals AP-MS. Ons doel is om alle onderzoekers een toegankelijke manier te bieden om de analyses van PPI&#39;s in vivo uit te voeren .

Om het gebruik van dit protocol in een proteïnecomplex zuiveringsexperiment te illustreren, genereren we een homozygote levensvatbare vlieglijn, arm-EGFP-ERK , die EGFP- gemarkeerde Drosophila extracellulaire signaal-gereguleerde kinase (ERK, gecodeerd door het gerold gen) onder de controle uitdrukken Van een alomtegenwoordig uitgesproken armadillo ( arm ) promotor 18 , 19 . De ar...

Watch this Scientific Journal Video about Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments at JoVE.com

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Het doel van dit protocol is om een ​​eenvoudige en goedkope aanpak te geven voor het verzamelen van Drosophila embryo&#39;s op middelgrote schaal (0,5-1 g) en het bereiden van eiwit extracten die kunnen worden toegepast in stroomafwaartse proteomische toepassingen, zoals affiniteitszuivering-massaspectrometrie (AP-MS ).

Middelgrote voorbereiding van<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryo Extracten voor Proteomische Experimenten

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Voorbereiding van mitochondriaal verrijkte fracties voor Metabole analyse in<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Beeldvorming Subcellulaire Structuren in het Living zebravis embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

AFM and Microrheology in the Zebrafish Embryo Yolk Cell

AFM en Microrheology in de cel van de dooier Zebrafish de Embryo

Elucidating the factors that direct the spatio-temporal organization of evolving tissues is one of the primary purposes in the study of development. ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Voorbereiding van Drosophila larvale monsters van gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS)-gebaseerd metabolomica

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Probing Cell Mechanics with Bead-Free Optical Tweezers in the Drosophila Embryo

Indringende cel mechanica met kraal-vrije optisch pincet in de Drosophila Embryo

Morphogenesis requires coordination between genetic patterning and mechanical forces to robustly shape the cells and tissues. Hence, a challenge to ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimaal invasieve embryo transfer en embryo verglazing bij de optimale embryo fase in konijnen model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live beeldvorming en analyse van spiercontracties in Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Ontdooien, kweken en Cryopreserving van Drosophila cellijnen

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

Een directe en eenvoudige methode om de levensvatbaarheid van Drosophila melanogasterte beoordelen van embryo tot volwassene

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Voorbereiding van Drosophila Larval en Pupal Testes voor analyse van celafdeling in levend, intact weefsel

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...