Name: bidirectional retroviral integration site pcr methodology and quantitative data analysis workflow
Uploaded: 2017-06-14T15:00:00
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Le financement a été fourni par les Instituts nationaux de subventions de santé R00-HL116234, U19 AI117941 et R56 HL126544; La Fondation nationale pour la science Grant DMS-1516675; La National Research Foundation of Korea (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); Et le programme d&#39;initiative KRIBB.

1. Génération des bibliothèques de séquences en amont (à gauche) et en aval (droite) <ol><li> Préparation ADN linker: <ol><li> Préparez une solution d&#39;ADN de liaison de 10 μL en ajoutant 2 μL d&#39;oligos LINKER_A 100 μM (finale: 20 μM), 2 μL d&#39;oligos LINKER_B 100 μM (finale: 20 μM), 2 μL de NaCl 5 M (finale: 1 M) et 4 μl d&#39;eau exempte de nuclease dans un tube PCR. Voir le tableau 1 pour les séquences de liaison. </li><li> Incuber la solution d&#39;ADN lin...

<ol>
	<li>Serrao, E., Engelman, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sites+of+Retroviral+DNA+Integration:+From+Basic+Research+to+Clinical+Applications.">Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+HSPC+Repopulation+in+Nonhuman+Primates+Revealed+by+a+Decade-Long+Clonal-Tracking+Study.">Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study.</a> Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).</li><li>Bushman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+integration+and+human+gene+therapy.">Retroviral integration and human gene therapy.</a> J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).</li><li>Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+stem+cells:+methodological+constraints.">Counting stem cells: methodological constraints.</a> Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).</li><li>Schr&#246;der, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots.">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110 (4), 521-529 (2002).</li><li>Silver, J., Keerikatte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+of+polymerase+chain+reaction+to+amplify+cellular+DNA+adjacent+to+an+integrated+provirus.">Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus.</a> J. Virol. 64, 3150 (1990).</li><li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+insertion-site+analysis+by+linear+amplification-mediated+PCR+(LAM-PCR).">High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR).</a> Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).</li><li>Brady, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+sequence+and+quantify+DNA+integration+for+monitoring+outcome+in+gene+therapy.">A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy.</a> Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy.">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li><li>Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+cloning+and+sequencing+human+immunodeficiency+virus+type+1+integration+sites.">A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites.</a> J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).</li><li>Maldarelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Restriction+Enzyme-Free+Linear+Amplification-Mediated+Polymerase+Chain+Reaction+Approach+for+Tracking+Lentiviral+Integration+Sites+Does+Not+Abrogate+Retrieval+Bias.">High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias.</a> Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).</li><li>Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+Bias+of+Gammaretrovirus+Vectors+following+Transduction+and+Growth+of+Primary+Mouse+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+and+without+Selection.">Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection.</a> Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).</li><li>Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Amplification+Mediated+PCR;+Localization+of+Genetic+Elements+and+Characterization+of+Unknown+Flanking+DNA.">Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA.</a> J Vis Exp. (88), e51543 (2014).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+sensitive+quantification+of+repopulating+hematopoietic+stem+cell+clones.">High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones.</a> J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).</li><li>Mitchell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+ASLV,+HIV,+and+MLV+show+distinct+target+site+preferences.">Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences.</a> PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).</li><li>Melkus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1.">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li><li>Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+approach+to+the+restriction+of+a+mouse+genome.">A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome.</a> BMC Res Notes. 6, 284 (2013).</li><li>Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genomic+mapping+of+vector+integration+sites+in+gene+therapy+studies.">High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies.</a> Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy.">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li><li>Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+HIV-1+infection+in+human+T+cells+by+lentiviral-mediated+delivery+of+small+interfering+RNA+against+CCR5.">Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning:+powerful+tools+in+functional+genomics.">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li><li>Cartier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+with+a+lentiviral+vector+in+X-linked+adrenoleukodystrophy.">Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy.</a> Science. 326 (5954), 818-823 (2009).</li></ol>

L&#39;essai bidirectionnel permet d&#39;analyser simultanément les séquences de jonction d&#39;ADN vecteur-hôte amont (gauche) et aval (droite) et est utile dans plusieurs applications de thérapie génique, de cellules souches et de recherche sur le cancer. L&#39;utilisation d&#39;enzymes de motif GTAC (RsaI et CviQI) et l&#39;approche PCR bidirectionnelle améliore considérablement les chances de détection d&#39;un integrome (ou d&#39;une population clonale) par rapport aux dosages à base d&#39;enzymes motifs TC...

Les rétrovirus insèrent leur ADN génomique dans le génome hôte dans différents sites. Cette propriété unique, qui peut contribuer au développement de cancers et d&#39;autres formes de pathogenèse virale, a l&#39;avantage ironique de rendre ces virus hautement accessibles à l&#39;ingénierie cellulaire pour la thérapie génique et la recherche biologique de base. Le site d&#39;intégration virale (IS) - l&#39;emplacement sur le génome hôte où un ADN étranger (virus) est intégré - a des implications importantes pour le sort des virus intégrés et des cellules hôtes. Les tests IS ont été utilisés dans divers contextes de recherche biologique et clinique pour étudier la sélection et la pathogenèse du site d&#39;intégration rétrovirale, le développement du cancer, la biologie des cellules souches et la biologie du développement 1 , 2 , 3 , 4 . Une faible sensibilité à la détection, une faible reproductibilité des données et une contamination croisée fréquente sont parmiLes facteurs clés limitant les applications des tests IS aux études actuelles et planifiées. De nombreuses technologies d&#39;analyse IS ont été développées. Les essais sur le site d&#39;intégration à base d&#39;enzyme à restriction, y compris la réaction en chaîne par polymérase (PCR) 5 , la PCR inverse 6 et la PCR 7 à médiation par amplification linéaire (LAM), sont les plus utilisés. L&#39;utilisation d&#39;enzymes de restriction spécifiques au site, cependant, génère un biais lors de la récupération de l&#39;IS, permettant seulement un sous-ensemble d&#39;intégres (un ADN étranger intégré dans le génome de l&#39;hôte) au voisinage du site de restriction à récupérer 4 . Des technologies d&#39;analyse qui permettent d&#39;évaluer plus largement le vecteur IS ont également été introduites ces dernières années. Ces essais utilisent diverses stratégies, y compris la PCR 8 à médiation par transposon de Mu, non restrictive (nr) -LAM PCR 9 , enzyme de restriction de type II-mLa digestion éditée 10 , le cisaillement mécanique 11 et la PCR à l&#39;hexamère aléatoire (Re-free PCR) 12 , pour fragmenter les ADN génomiques et amplifier l&#39;IS. Les technologies actuelles ont différents niveaux de sensibilité à la détection, la couverture du génome, la spécificité cible, la capacité à haut débit, la complexité des procédures d&#39;analyse et les biais dans la détection des fréquences relatives des sites cibles. Étant donné les différentes qualités des analyses existantes et la variété des buts pour lesquels elles peuvent être utilisées, l&#39;approche d&#39;analyse optimale doit être soigneusement sélectionnée. Ce travail fournit des procédures expérimentales détaillées et un flux de travail d&#39;analyse de données de calcul pour un test bidirectionnel qui améliore de manière significative les taux de détection et la précision de la quantification des séquences en analysant simultanément l&#39;IS en amont et en aval de l&#39;ADN cible intégré (voir la figure 1 pour une vue schématique des procédures de dosage ). Cette approche fournit égalementS le moyen de caractériser le processus d&#39;intégration rétrovirale (par exemple, la fidélité à la duplication du site cible et les variations dans les séquences génomiques des insertions en amont et en aval). D&#39;autres méthodes bidirectionnelles ont été utilisées principalement pour le clonage et le séquençage des deux extrémités de l&#39;ADN cible 11 , 13 , 14 . Ce test est largement optimisé pour la quantification à haut débit et reproductible des clones vectorisés, en utilisant la méthode LM-PCR et la cartographie de l&#39;analyse calculée, ainsi que pour la quantification des jonctions amont et aval. L&#39;analyse bidirectionnelle avec l&#39;enzyme TaqαI s&#39;est révélée utile pour la quantification clonale à haut débit dans les études précliniques de thérapie génique de cellules souches 2 , 15 . Cet article décrit une méthode modifiée utilisant un coupeur plus fréquent (RsaI / CviQI - motif: GTAC) qui doubleIl existe des chances de détecter des globules par rapport à un dosage basé sur TaqαI . Des procédures détaillées d&#39;analyse expérimentale et de données qui utilisent des enzymes de motifs GTAC pour les lentiviraux (NL4.3 et ses dérivés) et les analyses gamma-rétrovirales (vecteurs pMX) IS sont décrites. Les oligonucleotides utilisés dans le dosage sont listés dans le tableau 1 . Un script de programmation interne pour l&#39;analyse de séquence IS est fourni dans le document complémentaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1004">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Thermostable DNA polymerase</td>
			<td style="width:208px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">600424</td>
			<td style="width:347px;">PicoMaxx Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermostable DNA polymerase buffer</td>
			<td style="width:208px;">Agilent</td>
			<td>600424</td>
			<td style="width:347px;">PicoMaxx Polymerase buffer</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Deoxynucleotide (dNTP) solution mix</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>dNTP solution mix (10mM each)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR tubes</td>
			<td style="width:208px;">VWR International</td>
			<td style="width:119px;">53509-304</td>
			<td style="width:347px;">PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">2ml microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:208px;">Molecular Bioproducts</td>
			<td style="width:119px;">3453</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">RsaI&#160;</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0167L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CviQI</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0639L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Buffer A</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>NEB CutSmart buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Polymerase I large (klenow) fragment&#160;</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td>Blunting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">streptavidin beads solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Binding Solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Washing Solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stand</td>
			<td style="width:208px;">ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>DynaMag&#8482;-2 Magnet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>T4 DNA ligase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">10X T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td>T4 DNA ligase reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">5X T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:208px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>46300-018</td>
			<td>T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S06497</td>
			<td style="width:347px;">Nanodrop 2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">pvuII</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>R0151L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">sfoI</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>R0606L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buffer B</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td>NEB buffer 3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-05-01-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Capillary electrophoresis</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>9001941</td>
			<td style="width:347px;">QIAxcel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Veriti 96-well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375305</td>
			<td>PCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Rotating wheel (or Roller)</td>
			<td style="width:208px;">Eppendorf</td>
			<td>M10534004</td>
			<td>Cell Culture Roller Drums</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA size marker</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929559</td>
			<td>QX size marker (100-2,500 bp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA size marker</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929554</td>
			<td>QX size marker (50-1,500 bp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA alignment markers</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929524</td>
			<td>QX DNA Alignment Marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">genomc DNA</td>
			<td style="width:208px;">Not Available</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bidirectional retroviral integration site pcr methodology and quantitative data analysis workflow

Les analyses du site d&#39;intégration (IS) sont une composante essentielle de l&#39;étude des sites d&#39;intégration rétroviraux et leur importance biologique. Dans les récentes études de thérapie génique rétrovirale, les tests IS, en combinaison avec le séquençage de la prochaine génération, ont été utilisés comme outil de suivi des cellules pour caractériser les cellules clonales de cellules souches partageant le même IS. Pour la comparaison précise de la réapprovisionnement de clones de cellules souches à l&#39;intérieur et à travers différents échantillons, la sensibilité de détection, la reproductibilité des données et la capacité à haut débit de l&#39;analyse sont parmi les qualités d&#39;analyse les plus importantes. Ce travail fournit un protocole détaillé et un workflow d&#39;analyse de données pour l&#39;analyse IS bidirectionnelle. Le dosage bidirectionnel peut simultanément séquencer les jonctions vecteur-hôte en amont et en aval. Par rapport aux approches de séquençage IS unidirectionnelles conventionnelles, l&#39;approche bidirectionnelle améliore considérablement les taux de détection IS et la caractérisation des événements d&#39;intégration aux deux extrémités de tIl cible l&#39;ADN. Le pipeline d&#39;analyse de données décrit ici identifie et énumère avec précision des séquences IS identiques à travers plusieurs étapes de comparaison qui mettent en place des séquences IS dans le génome de référence et déterminent les erreurs de séquençage. En utilisant une procédure de dosage optimisée, nous avons récemment publié les modèles de repeuplement détaillés de milliers de clones de cellules souches hématopoïétiques (HSC) après transplantation dans des macaques rhésus, démontrant pour la première fois le point précis du repopulation HSC et l&#39;hétérogénéité fonctionnelle des HSC dans le Système de primates. Le protocole suivant décrit la procédure expérimentale étape par étape et le flux de travail d&#39;analyse de données qui identifie et quantifie précisément les séquences IS identiques.

L&#39;essai IS bidirectionnel a généré différentes tailles d&#39;amplicons de PCR pour les jonctions d&#39;hôte vecteur amont (gauche) et aval (droite) ( Figure 2 ). La taille d&#39;un amplicon de PCR dépend de l&#39;emplacement du motif GTAC le plus proche en amont et en aval d&#39;un integrome. L&#39;essai a également produit des amplicons internes de PCR d&#39;ADN: des séquences rétrovirales proches du tube de polypurine et le site de liaison de ...

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Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Ce manuscrit décrit la procédure expérimentale et l&#39;analyse de logiciel pour un test de site d&#39;intégration bidirectionnelle qui peut analyser simultanément l&#39;ADN de jonction vecteur-hôte en amont et en aval. Les produits de PCR bidirectionnels peuvent être utilisés pour toute plate-forme de séquençage en aval. Les données résultantes sont utiles pour une comparaison quantitative à haut débit des cibles intégrées d&#39;ADN.

Site d&#39;intégration bidirectionnel Retroviral Méthodologie PCR et analyse de données quantitatives Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

La fusion absolue et relative des données quantitatives PCR pour Quantifier STAT3 Splice Variant Transcriptions

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

Recherche

Génétique

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Détection de l&#39;expression de microARN dans la membrane peritoneale des rats en utilisant une PCR quantitative en temps réel

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

Numérisation Retroviral: Mapping des sites d&#39;intégration MLV pour définir des régions réglementaires spécifiques à une cellule

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Préparation des échantillons et l’analyse des données sur l’Expression génique à base RNASeq de poisson-zèbre

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Une méthode Standard pour examiner la mutagénicité sur place en fonction de la Mutation ponctuelle de réparation catalysée par CRISPR/Cas9 et SsODN dans les cellules humaines

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Méthodologie pour une détection précise de la méthylation de l’ADN Mitochondrial

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

Analyse informatique des données de séquence d’écrans de 2-hybride de levure lot

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Nombre variable Tandem-répétition Analyse du Bacterium Yersinia ruckeri par Multiplex PCR et Capillary Electrophoresis

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through Analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based Competitive Index for High-through analysis of Fitness in Salmonella Digital PCR-based

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

Rt-PCR quantitatif à haut débit dans les échantillons de C. elegans en vrac et en vrac à l’aide de la technologie nanofluidique

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...