Name: bidirectional retroviral integration site pcr methodology and quantitative data analysis workflow
Uploaded: 2017-06-14T15:00:00
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기금은 국립 보건원 R00-HL116234, U19 AI117941 및 R56 HL126544에 의해 제공되었다. 국립 과학 재단 보조금 DMS-1516675; 한국 연구 재단 (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); KRIBB 이니셔티브 프로그램.

1. 업스트림 (왼쪽) 및 다운 스트림 (오른쪽) - 접합 시퀀스 라이브러리 생성 <ol><li> DNA 링커 준비 : <ol><li> 100 μM LINKER_A oligos (최종 20 μM) 2 μL, 100 μM LINKER_B oligos (최종 20 μM) 2 μL, 5 M NaCl (최종 : 1M) 2 μL를 첨가하여 10 μL 링커 DNA 용액을 준비하고 PCR 튜브에 nuclease-free water 4 μL. 링커 시퀀스는 표 1 을 참조하십시오. </li><li> PCR 장비에서 95 ° C에서 5 분 링커 DNA 솔루션을 품어, ?...

<ol>
	<li>Serrao, E., Engelman, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sites+of+Retroviral+DNA+Integration:+From+Basic+Research+to+Clinical+Applications.">Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+HSPC+Repopulation+in+Nonhuman+Primates+Revealed+by+a+Decade-Long+Clonal-Tracking+Study.">Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study.</a> Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).</li><li>Bushman, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+integration+and+human+gene+therapy.">Retroviral integration and human gene therapy.</a> J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).</li><li>Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+stem+cells:+methodological+constraints.">Counting stem cells: methodological constraints.</a> Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).</li><li>Schr&#246;der, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+integration+in+the+human+genome+favors+active+genes+and+local+hotspots.">HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots.</a> Cell. 110 (4), 521-529 (2002).</li><li>Silver, J., Keerikatte, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+use+of+polymerase+chain+reaction+to+amplify+cellular+DNA+adjacent+to+an+integrated+provirus.">Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus.</a> J. Virol. 64, 3150 (1990).</li><li>Schmidt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+insertion-site+analysis+by+linear+amplification-mediated+PCR+(LAM-PCR).">High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR).</a> Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).</li><li>Brady, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+sequence+and+quantify+DNA+integration+for+monitoring+outcome+in+gene+therapy.">A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy.</a> Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy.">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li><li>Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+method+for+cloning+and+sequencing+human+immunodeficiency+virus+type+1+integration+sites.">A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites.</a> J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).</li><li>Maldarelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+HIV+integration+sites+are+linked+to+clonal+expansion+and+persistence+of+infected+cells.">Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells.</a> Science. 345 (6193), 179-183 (2014).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Restriction+Enzyme-Free+Linear+Amplification-Mediated+Polymerase+Chain+Reaction+Approach+for+Tracking+Lentiviral+Integration+Sites+Does+Not+Abrogate+Retrieval+Bias.">High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias.</a> Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).</li><li>Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+Bias+of+Gammaretrovirus+Vectors+following+Transduction+and+Growth+of+Primary+Mouse+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+and+without+Selection.">Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection.</a> Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).</li><li>Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+Amplification+Mediated+PCR;+Localization+of+Genetic+Elements+and+Characterization+of+Unknown+Flanking+DNA.">Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA.</a> J Vis Exp. (88), e51543 (2014).</li><li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput,+sensitive+quantification+of+repopulating+hematopoietic+stem+cell+clones.">High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones.</a> J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).</li><li>Mitchell, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+ASLV,+HIV,+and+MLV+show+distinct+target+site+preferences.">Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences.</a> PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).</li><li>Melkus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+mice+mount+specific+adaptive+and+innate+immune+responses+to+EBV+and+TSST-1.">Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1.</a> Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).</li><li>Bystrykh, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+approach+to+the+restriction+of+a+mouse+genome.">A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome.</a> BMC Res Notes. 6, 284 (2013).</li><li>Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+genomic+mapping+of+vector+integration+sites+in+gene+therapy+studies.">High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies.</a> Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).</li><li>Gabriel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+genomic+access+to+vector+integration+in+clinical+gene+therapy.">Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy.</a> Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).</li><li>Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+HIV-1+infection+in+human+T+cells+by+lentiviral-mediated+delivery+of+small+interfering+RNA+against+CCR5.">Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).</li><li>Kitamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+cloning:+powerful+tools+in+functional+genomics.">Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics.</a> Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).</li><li>Cartier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+gene+therapy+with+a+lentiviral+vector+in+X-linked+adrenoleukodystrophy.">Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy.</a> Science. 326 (5954), 818-823 (2009).</li></ol>

양방향 분석은 상류 (좌측) 및 하류 (우측) 벡터 - 숙주 DNA 결합 서열 모두의 동시 분석을 가능하게하며 다수의 유전자 치료, 줄기 세포 및 암 연구 응용에 유용하다. GTAC- 모티프 효소 (RsaI 및 CviQI) 및 양방향 PCR 접근법을 사용하면 이전의 TCGA- 모티프 ( TaqαI ) 효소 ( 2 , 15 및 기타)와 비교할 때 인테그랄 (또는 클론 개체군)을 검출 할 가능성이...

레트로 바이러스는 게놈 DNA를 다양한 위치의 숙주 게놈에 삽입합니다. 암과 다른 형태의 바이러스 발병 기전의 발달에 기여할 수있는이 고유 한 특성은 유전자 치료 및 기초 생물학 연구를 위해이 바이러스를 세포 공학에 매우 적합하게 만드는 아이러니 한 이점이 있습니다. 외래 DNA (바이러스)가 통합 된 숙주 게놈의 위치 인 바이러스 통합 사이트 (IS)는 통합 바이러스와 숙주 세포의 운명에 중요한 영향을 미칩니다. IS 분석은 다양한 생물학적 및 임상 연구 환경에서 레트로 바이러스 통합 사이트 선택 및 병인, 암 발달, 줄기 세포 생물학 및 발달 생물학 1 , 2 , 3 , 4 를 연구하는 데 사용되었습니다. 낮은 검출 감도, 낮은 데이터 재현성 및 빈번한 교차 오염현재 및 계획된 연구에 IS 분석법의 적용을 제한하는 핵심 요인. 많은 IS 분석 기술이 개발되었습니다. 링커 매개 (LM) 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 5 , 역 PCR 6 및 선형 증폭 (Linear-Amplification-Mediated) PCR 7을 포함한 제한 효소 기반 통합 사이트 분석이 가장 널리 사용됩니다. 그러나 현장 특이적인 제한 효소의 사용은 IS 검색 중에 편향을 일으키고, 제한 효소 근처에서 통합 될 하위 집합 (숙주 게놈에 통합 된 외래 DNA) 만 회수 할 수 있습니다 4 . 최근에 벡터 IS를보다 종합적으로 평가하는 분석 기술이 도입되었습니다. 이러한 분석법은 Mu transposon-mediated PCR 8 , 비 제한적 (nr) -LAM PCR 9 , type-II 제한 효소 -mediated digestion 10 , mechanical shearing 11 , random hexamer-based PCR (Re-free PCR) 12 를 사용하여 게놈 DNA를 단편화하고 IS를 증폭합니다. 현재의 기술은 다양한 수준의 검출 감도, 게놈 범위, 표적 특이성, 높은 처리량, 분석 절차의 복잡성 및 표적 부위의 상대적 빈도를 검출하는 편향을 가지고 있습니다. 기존의 분석법의 다양한 특성과 이들이 사용될 수있는 다양한 목적을 고려할 때 최적의 분석법을 신중하게 선택해야합니다. 이 작업은 통합 표적 DNA의 IS 업스트림 및 다운 스트림을 동시에 분석함으로써 검출 속도 및 서열 정량 정확도를 크게 향상시키는 양방향 분석을위한 자세한 실험 절차 및 컴퓨터 데이터 분석 워크 플로우를 제공합니다 (그림 1의 분석 절차 개요도 참조). ). 이 방법은 또한레트로 바이러스 통합 과정을 특성화하는 수단 (예 : 표적 부위 복제의 정확도 및 상류 및 하류 삽입의 게놈 서열 변화). 다른 양방향 방법은 표적 DNA 11 , 13 , 14 의 양 끝을 복제하고 시퀀싱하기 위해 주로 사용되었습니다. 이 분석법은 잘 확립 된 LM-PCR 방법 및 전산 해석 매핑을 사용하고 상류 및 하류 접합을 정량화하기 위해 벡터 표시 클론의 고효율 및 재현성 정량을 위해 광범위하게 최적화되어 있습니다. TaqαI 효소의 양방향 분석은 줄기 세포 유전자 치료 전임상 연구에서 높은 처리량 클론 정량화에 유용함이 입증되었다. 이 논문은 t를 두 배로하는 더 빈번한 커터 (RsaI / CviQI - motif : GTAC)를 사용하는 수정 된 방법을 기술한다그는 TaqαI에 기반한 분석에 비해 integromes를 검출 할 가능성이 있다. 렌티 바이러스 (NL4.3 및 그 유도체) 및 감마 - 레트로 바이러스 (pMX 벡터) 벡터 IS 분석을위한 GTAC 모티프 효소를 사용하는 상세한 실험 및 데이터 분석 절차가 기술되어있다. 분석에 사용 된 올리고 뉴클레오타이드는 표 1 에 열거되어있다. 보충 문서에는 IS 서열 분석을위한 사내 프로그래밍 스크립트가 제공됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1004">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Thermostable DNA polymerase</td>
			<td style="width:208px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">600424</td>
			<td style="width:347px;">PicoMaxx Polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermostable DNA polymerase buffer</td>
			<td style="width:208px;">Agilent</td>
			<td>600424</td>
			<td style="width:347px;">PicoMaxx Polymerase buffer</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;">Deoxynucleotide (dNTP) solution mix</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>dNTP solution mix (10mM each)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR tubes</td>
			<td style="width:208px;">VWR International</td>
			<td style="width:119px;">53509-304</td>
			<td style="width:347px;">PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">2ml microcentrifuge tube</td>
			<td style="width:208px;">Molecular Bioproducts</td>
			<td style="width:119px;">3453</td>
			<td>microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">PCR purification kit</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">RsaI&#160;</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0167L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CviQI</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0639L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Buffer A</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>NEB CutSmart buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNA Polymerase I large (klenow) fragment&#160;</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td>Blunting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">streptavidin beads solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Binding Solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Washing Solution</td>
			<td>Invitrogen&#160;</td>
			<td>60101</td>
			<td>Dynabeads kilobaseBINDER kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">magnetic stand</td>
			<td style="width:208px;">ThermoFisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td>DynaMag&#8482;-2 Magnet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202L</td>
			<td>T4 DNA ligase</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">10X T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:208px;">New England Biolabs</td>
			<td>B0202S</td>
			<td>T4 DNA ligase reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">5X T4 DNA ligase buffer</td>
			<td style="width:208px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>46300-018</td>
			<td>T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td style="width:208px;">Fisher Scientific</td>
			<td>S06497</td>
			<td style="width:347px;">Nanodrop 2000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">pvuII</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>R0151L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">sfoI</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>R0606L</td>
			<td>restriction enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Buffer B</td>
			<td style="width:208px;">new England Biolabs</td>
			<td>B7203S</td>
			<td>NEB buffer 3.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:208px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td>11-05-01-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Capillary electrophoresis</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>9001941</td>
			<td style="width:347px;">QIAxcel capillary electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Veriti 96-well Fast Thermal Cycler</td>
			<td style="width:208px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4375305</td>
			<td>PCR Instrument</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Rotating wheel (or Roller)</td>
			<td style="width:208px;">Eppendorf</td>
			<td>M10534004</td>
			<td>Cell Culture Roller Drums</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA size marker</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929559</td>
			<td>QX size marker (100-2,500 bp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA size marker</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929554</td>
			<td>QX size marker (50-1,500 bp)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNA alignment markers</td>
			<td style="width:208px;">Qiagen</td>
			<td>929524</td>
			<td>QX DNA Alignment Marker</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">genomc DNA</td>
			<td style="width:208px;">Not Available</td>
			<td style="width:119px;">Not Available</td>
			<td>Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bidirectional retroviral integration site pcr methodology and quantitative data analysis workflow

통합 사이트 (IS) 분석은 레트로 바이러스 통합 사이트 및 그 생물학적 중요성에 대한 연구에서 중요한 요소입니다. 최근의 레트로 바이러스 유전자 치료 연구에서, IS 분석은 차세대 시퀀싱과 함께 동일한 IS를 공유하는 줄기 세포 집단을 특성화하기위한 세포 추적 도구로 사용되었습니다. 서로 다른 샘플 내에서 그리고 다른 샘플 간에서 재 축적 된 줄기 세포 클론을 정확하게 비교하기 위해 분석의 검출 감도, 데이터 재현성 및 처리량이 가장 중요한 분석 품질 중 하나입니다. 이 작업은 양방향 IS 분석을위한 상세한 프로토콜 및 데이터 분석 워크 플로우를 제공합니다. 양방향 분석은 상류 및 하류 벡터 - 숙주 접합을 동시에 서열화할 수있다. 기존의 단방향 IS 시퀀싱 접근 방식과 비교할 때 양방향 접근 방식은 IS 탐지 속도와 t 양 끝에서 통합 이벤트의 특성을 크게 향상시킵니다.DNA를 목표로합니다. 여기에 설명 된 데이터 분석 파이프 라인은 IS 시퀀스를 참조 게놈에 매핑하고 시퀀싱 오류를 결정하는 여러 단계의 비교를 통해 동일한 IS 시퀀스를 정확하게 식별하고 열거합니다. 최적화 된 분석법을 사용하여 히말라포마 원숭이에 이식 한 후 수천 개의 조혈 줄기 세포 (HSC) 클론의 상세한 모집단 패턴을 최근에 발표하여 HSC 재조합의 정확한 시점과 HSC의 기능적 이질성을 처음으로 입증했습니다. 영장류 시스템. 다음 프로토콜은 동일한 IS 시퀀스를 정확하게 식별하고 정량화하는 단계별 실험 절차 및 데이터 분석 워크 플로를 설명합니다.

양방향 IS 분석은 상류 (왼쪽)와 하류 (오른쪽) 벡터 호스트 접합 ( 그림 2 ) 모두에 대해 서로 다른 크기의 PCR 증폭 물을 생성했습니다. PCR 증폭 물의 크기는 인테그람에서 상류와 하류에 가장 가까운 GTAC 모티프의 위치에 의존한다. 이 분석법은 또한 내부 DNA PCR 증폭 물을 생산 하였다 : 폴리펩티드 관 근처의 레트로 바이러스 서열 및 프라이머 결합 부...

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Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

이 원고는 상향 및 하향 벡터 - 숙주 접합 DNA를 동시에 분석 할 수있는 양방향 통합 사이트 분석을위한 실험 절차 및 소프트웨어 분석을 설명합니다. 양방향 PCR 제품은 모든 다운 스트림 시퀀싱 플랫폼에 사용할 수 있습니다. 결과 데이터는 통합 DNA 표적의 높은 처리량, 정량적 비교에 유용합니다.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Merging Absolute and Relative Quantitative PCR Data to Quantify STAT3 Splice Variant Transcripts

절대 및 상대 정량 PCR 데이터를 병합 STAT3 스플 라이스 변형 성적 증명서를 정량화하기

Human signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is one of many genes containing a tandem splicing site. Alternative donor splice sites 3 ...

연구

유전학

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

정량 실시간 PCR을 이용한 쥐 복막 막의 microRNA 발현 검출

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

레트로 바이러스 스캐닝 : MLV 통합 사이트 맵핑으로 세포 특정 규제 지역 정의

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

일괄 처리 효 모 2 잡종 스크린에서 시퀀스 데이터의 informatic 분석

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

Multi-locus Variable-number Tandem-repeat Analysis of the Fish-pathogenic Bacterium Yersinia ruckeri by Multiplex PCR and Capillary Electrophoresis

멀티 록스 PCR 및 모세관 전기 영동에 의한 어류 병원성 박테리아 Yersinia ruckeri의 다중 궤적 가변 수 탠덤 반복 분석

Yersinia ruckeri is an important pathogen of farmed salmonids worldwide, but simple tools suitable for epizootiological investigations (infection tracing, ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

살모넬라에서 피트니스의 높은 처리량 분석을 위한 디지털 PCR 기반 경쟁 지수

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

단일 및 벌크 C.의 고처리량 정량적 RT-PCR. 나노 유체 기술을 사용하여 샘플

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...